PLoS ONE: oncogen miRNA-182-5p Mål Smad4 og Reck i Human Blære Cancer

Abstrakt

Onco-miR-182-5p er blevet rapporteret til at være over-udtrykt i blærekræft (BC) væv dog en detaljeret funktionel analyse af miR-182-5p er ikke blevet gennemført i BC. Derfor formålet med denne undersøgelse var at: 1. gennemføre en funktionel analyse af miR-182-5p i blærekræft, 2. vurdere dens anvendelighed som en tumor markør, 3. identificere miR-182-5p målgener i BC. Oprindeligt fandt vi, at MIR-182-5p ekspression var betydeligt højere i blærekræft sammenlignet med normale væv og høj MIR-182-5p ekspression var forbundet med kortere samlet overlevelse i BC patienter. At studere den funktionelle betydning af miR-182-5p, vi over-udtrykte miR-182-5p med miR-182-5p forløber og observeret, at celleproliferation, migration og invasion evner blev forøget i BC celler. Imidlertid celle apoptose blev inhiberet af MIR-182-5p. Vi identificerede også

Smad4

RECK

som potentielle mål gener af miR-182-5p ved hjælp af flere algoritmer. 3’UTR luciferaseaktivitet af disse målgener var faldet betydeligt og protein ekspression af disse målgener var signifikant opreguleret i MIR-182-5p inhibitor transficerede blære cancerceller. MIR-182-5p steg også nuklear beta-catenin ekspression og mens Smad4 undertrykt nuklear beta-catenin ekspression. Afslutningsvis vores data antyder, at MIR-182-5p spiller en vigtig rolle som et onkogen ved at banke ned RECK og Smad4, hvilket resulterer i aktivering af Wnt-beta-catenin signalvejen i blærekræft

Henvisning.: Hirata H, Ueno K, Shahryari V, Tanaka Y, Tabatabai ZL, Hinoda Y, et al. (2012) onkogenisk miRNA-182-5p Mål Smad4 og Reck i Human blærekræft. PLoS ONE 7 (11): e51056. doi: 10,1371 /journal.pone.0051056

Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: 14. september 2012; Accepteret: 29 Okt 2012; Udgivet 30. november, 2012 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Center for Research Resources i USA National Institutes of Health gennem Grant Number RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, VA Merit anmeldelse tilskud samt VA Program Project. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

blærekræft (BC) er den tredje hyppigste dødsårsag blandt urologiske tumorer og den mest almindelige histologiske type blærekræft er urotelial karcinom (UC), tidligere kendt som overgangsordning celle carcinom (TCC) [1]. Ca. 75% af patienterne er “ikke-muskel invasiv UC (PTA, pTis, PT1) og har en 5-års overlevelse på mellem 88-98% [2]. Den almindelige behandling for disse patienter er endoskopisk resektion [1], [3]. Patienter med muskel invasiv UC er normalt behandles med radikal cystektomi eller kemo strålebehandling [1], [4]. Men halvdelen af ​​muskel invasive UC patienter udvikler efterfølgende metastatisk sygdom efter første aggressiv behandling [1], [5]. Tidligere undersøgelser har identificeret flere potentielle molekylære biomarkører for blærekræft [6], [7]. Inaktivering af tumorsuppressorgener

TP53

Rb

Ras

onkogen aktivering er blevet betragtet som vigtige nøglespillere i blærekræft carcinogenese [6].

Aktivering af Wnt-beta-catenin signalering er også blevet undersøgt og rapporteres at være forbundet med kræft progression og dårlig prognose i blærekræft [8], [9]. Transformerende vækstfaktor beta (TGF-beta) spiller en afgørende rolle i embryonisk udvikling og patogenese af adskillige sygdomme og cancer [10]. Dokumentation for krydstale mellem TGF-beta og andre signalveje, herunder Wnt signalering er blevet rapporteret [10]. Smad4 er en central intracellulær signaltransduktion komponent af TGF-beta og de seneste undersøgelser har vist, at Smad4 samarbejder med beta-catenin i flere caners [11] – [14]

RECK er afgørende repressor af matrixmetalloproteinaser (MMP’er. ) og tidligere undersøgelser har vist, at RECK ekspression er betydeligt lavere i blære cancervæv sammenlignet med normale urothelial væv [15] – [17]

Hidtil mange microRNA er blevet identificeret og rapporteret at være vigtige i flere kræftformer. [18]. MikroRNA’er (miRNA) er små ikke-kodende RNA’er, ca. 22 nukleotider i længde, der er i stand til at regulere genekspression på både transkription og translation niveauer [19]. MiRNA binder til 3’UTR af mål-mRNA og undertrykke translation fra mRNA til protein eller inducere mRNA-spaltning og derved regulere ekspressionen af ​​målgener [20].

I denne undersøgelse fandt vi, at MIR-182- 5p var signifikant højere i blære cancervæv sammenlignet med normale urothelial væv og høj mIR-182-5p ekspression blev signifikant associeret med kortere samlet overlevelse. Indtil videre har der ikke været rapporter om funktionen af ​​miR-182-5p i blærekræft. Således vi fokuseret på miR-182-5p, udført funktionelle analyser, identificeret adskillige målgener af miR-182-5p ved hjælp af flere algoritmer og identificeret

Smad4

og

RECK

som målgener. Endelig har vi over-udtrykte disse målgener (

Smad4

RECK

) i blære kræftceller til at undersøge mekanismen for miR-182-5p funktion.

Resultater

miRNA-182-5p Expression er betydeligt højere i Blærekræft væv og associeret med Shorter Samlet overlevelse

Vi sammenlignede miRNA-182-5p ekspressionsniveauer i blærekræft væv (n = 18) og normal urothelial væv (n = 6) ved real-time PCR. MIR-182-5p ekspression var betydeligt højere i blærekræft væv (Fig 1A). Vi undersøgte sammenslutningen af ​​miR-182-5p og flere kliniske parametre som vist i figur 1-B og observeret, at høje miR-182-5p udtryk var signifikant associeret med kortere samlet overlevelse.

A. miR-182-5p udtryk i kliniske prøver og blærekræft cellelinjer, B. Foreningen af ​​miR-182-5p med klinik-patologiske parametre, C. Kaplan Meier-kurver over total overlevelse.

Med hensyn til flere andre kliniske parametre blev ingen signifikant sammenhæng observeret. Vi delte de 18 blære kræftpatienter i to kategorier baseret på medianværdien og Kaplan Meier-kurver viste, at den samlede overlevelse var kortere i den høje miR-182-5p udtrykker gruppe (p-værdi = 0,0349, log-rank test) (figur 1- C).

miRNA-182-5p Expression er steget betydeligt i blære kræftcellelinjer

Vi sammenlignede miR-182-5p udtryk i flere blærekræft cellelinjer og dens udtryk i T24 og UM -UC-3-celler var i området fra at i blærekræft væv. brugte vi således disse to blære kræft cellelinjer til yderligere forsøg i denne undersøgelse (figur 1A).

Effekt af microRNA-182-5p Over-udtryk på Cell Levedygtighed og migration i Blære kræftceller

for at bekræfte funktionen af ​​miR-182-5p, vi transficeret miR-182-5p forløber i blære cancer cellelinjer (T24 og UM-UC-3). Ved 24 timer efter transfektion af MIR-NC eller MIR-182-5p precursor i blære cancerceller blev MIR-182-5p ekspressionsniveau verificeret af real time PCR (fold forandringer; 4545, 5920, henholdsvis figur 2-A.) . Derefter blev udført flere funktionelle analyser. Vi observerede signifikant øget celleproliferation (fig. 2-B), invasion (fig. 2-C) og migration (fig. 2-D) i miRNA-182-5p transficerede celler sammenlignet med MIR-NC transficerede celler. Desuden miR-182-5p faldt betydeligt celle apoptose (fig. 2-E).

To blære cancer cellelinjer (T24 og UM-UC-3), blev kortvarigt transficeret med enten miR-182-5p precursor eller kontrol (mIR-NC). A. Relativ MIR-182-5p ekspression, B. Cellelevedygtighed assay C. Invasion assay D. Sårheling assay (24 timer), E. Flowcytometrisk analyse af apoptose i MIR-NC eller MIR-182-5p transficeret BC celler.

3′-UTR-Luciferase Assay og Target Protein Expression i miR-182-5p Transfektanter

RECK mRNA har en, mens Smad4 har to potentielt gratis bindingssted med miR- 182-5p under dets 3’UTR (fig. 3-A). Baseret på disse resultater, udførte vi 3’UTR luciferaseassays og fandt, at de relative luciferaseaktiviteter med disse steder blev signifikant reduceret i MIR-182-5p transficerede blære cancerceller (T24, UM-UC-3) (fig. 3-B ). Disse resultater antyder, at Reck og Smad4 mRNA’er er potentielle målgener af MIR-182-5p. Western-analyse bekræftede, at RECK og Smad4 proteinekspression blev øget betydeligt i miR-182-5p hæmmer transfekterede celler (fig. 3-C).

A. RECK og Smad4 3’UTR position og komplementære MIR-182-5p sekvenser. B. 3’UTR Luciferase assay (miR-NC og miR-182-5p forløber), C. RECK, Smad4 og beta-tubulin protein-ekspression i miR-NC-hæmmer eller MIR-182-5p inhibitor transfekterede blære cancerceller (T24, UM-UC-3).

Virkninger af over-ekspressionen af ​​RECK og Smad4 om blærekræft Cell (T24) funktion

for at se på funktionen af ​​RECK og Smad4, vi overudtrykt RECK og Smad4 i T24-celler, som blev bekræftet ved måling mRNA (fig. 4-A) og protein-ekspressionsniveauer (fig. 4-B). Derefter udført vi flere funktionelle analyser. Som vist i figur 4, cellelevedygtighed (fig. 4-C), invasion (fig. 4-D) og migration (Fig. 4-E) blev signifikant inhiberet i RECK og Smad4 transficeret T24 blære cancerceller. Som vist i figur 4-F, blev procentdelen af ​​apoptotiske celler signifikant forøget i RECK eller Smad4 transficerede celler.

A. Ved 24 timer efter transfektion af enten pCMV6-tomme, pCMV6-RECK eller pCMV6-Smad4 ind blære kræftceller (T24), blev Reck og Smad4 ekspressionsniveauerne verificeret af real time RT-PCR (fold ændringer; 24.744, 8563, henholdsvis) og Western analyse (B) C. Cellelevedygtighed assay, D. invasion assay, E. sår healing assay F. Flowcytometrisk analyse af apoptose i tomme, RECK og Smad4 transficerede T24-celler. Data er den gennemsnitlige ± standardafvigelse af fire uafhængige forsøg. G. beta-catenin udtryk i nukleare fraktion, blev CREB anvendt som kontrol.

Effekt af miR-182-5p og Smad4 om Beta-catenin Expression i Nuclear Fraktion

Som vist i figur 4-G, blev beta-catenin ekspression i den nukleare fraktion signifikant forøget i mIR-182-5p transficerede T24-celler. I modsætning hertil beta-catenin udtryk i den nukleare fraktion blev signifikant reduceret i Smad4 transficerede T24-celler.

Diskussion

En række microRNA er blevet identificeret som tumorsuppressor eller onkogener baseret på deres udtryk niveau i blærekræft væv og /eller funktionel analyse. Dog har mange miRNA undersøgelser fokuseret på tumor suppressor miRNA herunder miR-125b, -133a, -143, -145, -200 familie (200a, 200b, 200c, 141, 429), -203, -205, -218, – 449a, -493 og -517a [21] – [29]. To miRNA (MIR-21 og MIR-129) er blevet identificeret og bekræftet som onkogener i blærekræft [30], [31].

MIR-182-5p er også blevet rapporteret at være et onkogen i flere cancere [32] – [37]. Svarende til vores resultater, én rapport fandt, at MIR-182-5p ekspression var betydeligt højere i blære cancervæv sammenlignet med normale urothelium, men funktionel analyse blev ikke udført i denne undersøgelse [38]. undersøgte derfor vi forholdet mellem miR-182-5p udtryk og kliniske parametre, herunder patologiske stadier og patientresultater og fandt, at miR-182-5p udtryk var korreleret til kortere samlet overlevelse efter operation hos patienter blærekræft. Disse resultater antyder, MIR-182-5p kan være en ny og nyttig diagnostisk biomarkør i blærekræft.

Vores næste mål var at bestemme, om MIR-182-5p fungerer som en blærecancer onkogen. Af tre blærekræft cellelinjer (T24, UM-UC-3, J82), udtryk for miR-182-5p i to cellelinjer (T24 og UM-UC-3) var i intervallet udtryk observeret i blære kræft væv . brugte vi således disse to blære cancer cellelinjer (T24 og UM-UC-3) til funktionel analyse eksperimenter. Vi fandt, at overekspression af MIR-182-5p fremmes signifikant blærekræft cellelevedygtighed, migration og invasion og inhiberede apoptose. Vi brugte flere algoritmer til at søge efter potentielle miR-182-5p målgener siden microRNA udøver deres virkninger ved at regulere target genekspression. Vi identificerede RECK og Smad4 som potentielle målgener af 3’UTR luciferaseanalyse og Western analyser.

MMP spiller en vigtig rolle i cancer invasion og metastase og MMP-2 elevation blærekræft væv er blevet rapporteret at være korreleret med tumor stadium og dårlig prognose i blærecancerpatienter [39], [40]. RECK er en afgørende MMP-2 repressoren og RECK ekspression er tidligere rapporteret at være nedreguleret i blæren cancervæv sammenlignet med normale urothelium [16], [17]. Desuden er DNA-methylering blevet identificeret som en RECK silencing mekanisme [41]. For nylig miR-21 blev identificeret som en regulator af

RECK

genekspression i flere kræftformer [42], men til dato har der ikke været nogen rapport, der viser direkte regulering af RECK af miR-182-5p.

Vi undersøgte også den funktion RECK ved overudtrykker det i en blærecancer-cellelinie (T24). Som vist RECK inhiberede celleproliferation, blev migration og invasion evner i blære cancerceller og antallet af apoptotiske celler steg med RECK transfektion.

Smad4 er et vigtigt signal transduktion bestanddel af TGF-beta og nylige undersøgelser viser, at Smad4 funktioner ved at samarbejde med beta-catenin i flere kræftformer.

Wnt-beta catenin signalering er afgørende for embryogenese og tumorudvikling [43]. I cancerceller, er den Wnt-vejen aktiveres sædvanligvis forårsager ikke-phosphoryleret beta-catenin at akkumulere i cytoplasmaet og bevæger sig til kernen, hvor det binder til TCF /LEF og transskriptionelt regulerer Wnt målgener fremmer tumorigenese [43]. I blærekræft, dereguleret Wnt-beta-catenin signalering spiller en vigtig rolle i udvikling og metastaser. Således vi kiggede for at se, om beta-catenin ekspression blev ændret af enten miRNA-182 eller Smad4 transfektion. Som vi observerede, MIR-182-5p øget nuklear beta-catenin ekspression mens Smad4 faldt nuklear beta-catenin ekspression. Så vidt vi ved, har der ikke været rapporter om miR-182 og Wnt-beta-catenin signalering og vores resultater tyder på, at kræftpsykologisk miR-182-5p kan være involveret i reguleringen af ​​Wnt-beta-catenin relaterede gener.

I vores undersøgelse, Smad4 overekspression faldt blærekræft proliferation, migration og invasion evne. Apoptose blev også øget med Smad4 overekspression i blæren kræftceller. Da tab af Smad4 er blevet rapporteret at spille en kausal rolle i initiering pladecellecarcinomer af huden, øvre fordøjelseskanal samt adenocarcinom i mavetarmkanalen [44], kan vore resultater indikerer, at Smad4 spiller en vigtig rolle i blærekræft. Da vi kun fokuseret på Smad4 i Wnt-signalering kaskade, er det muligt, at andre gener kan direkte eller indirekte reguleret af MIR-182-5p. vil være behov for yderligere forsøg for at belyse den nøjagtige rolle af miR-182-5p i Wnt-beta catenin signalering. Tilsammen denne undersøgelse viser, at miR-182-5p udøver sine onkogene virkninger i blære cancerceller ved at nedregulere RECK og Smad4.

Dette er den første rapport også dokumentere, at miR-182-5p udtryk er steget betydeligt i blærekræft væv, hvor det fungerer som et onkogen ved at inhibere RECK og Smad4 ekspression og kan være potentielt nyttig som prognostisk biomarkør. Disse resultater tyder også på, at miR-182-5p kan have terapeutisk potentiale til behandling af blærekræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

formalin-fikseret, paraffin- indlejrede (FFPE) blære kræft prøver blev indhentet fra de San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical center. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, og undersøgelsen blev godkendt af UCSF Udvalget om menneskelige Forskning (Godkendelsesnr: H9058-35751-01).

kliniske prøver

I alt 18 mandlige patienter med patologisk bekræftet blærekræft blev indrulleret i denne undersøgelse (Veterans Affairs Medical center på San Francisco)

Cell kultur

Tre blære kræft cellelinier (J82, ATCC nummer:. HTB-1, T24; ATCC nummer: HTB-4, UM-UC-3; ATCC nummer: blev CRL-1749) anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). De J82 og UM-UC-3-cellelinjer blev dyrket i MEM Eagles med Earles BSS suppleret med 10% føtalt bovint serum. T24-cellelinien blev dyrket i McCoys 5A-medium med 10% føtalt bovint serum.

RNA og protein Ekstraktion

RNA (microRNA og total RNA) blev ekstraheret fra formalin-fikserede, paraffin-indlejret (FFPE) human blærecancer og ikke-kræft normale blære væv (urothelial celler) under anvendelse af en miRNeasy FFPE (Qiagen) efter laser mikro-dissektion baseret på patologer anmeldelser. Totalt RNA blev også ekstraheret fra blærekræft cellelinjer under anvendelse af en miRNeasy mini kit (QIAGEN). Cellerne blev lyseret med RIPA-buffer (Thermo Scientific, Rockford, IL) indeholdende proteaseinhibitorer (Sigma, St. Louis, MO). Protein kvantificering blev udført under anvendelse af et BCA proteinassaykit (Thermo Scientific, Rockford, IL). NE-PER Nuclear og cytoplasmiske Extraction Reagens blev anvendt til at ekstrahere nukleare og cytoplasmiske proteinfraktioner fra blære cancerceller (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL).

MicroRNA Transfektion (præ-miR precursor og miR Inhibitor)

Pre-miR ™ miRNA forstadier [negativ kontrol (mIR-NC) eller HSA-mIR-182-5p, Ambion] blev forbigående transficeret ind i blæren cancerceller ved Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner.

Anti-miR ™ miRNA-hæmmer [negativ kontrol (inh-NC) eller miR-182-5p inhibitor (miR-182-hæmmer), Ambion] blev forbigående transficeret ind blære cancerceller ved siPORT NeoFX Transfektion Agent (Ambion) ifølge producentens instruktioner. Efter transfektion blev cellerne inkuberet ved 37 ° C i 48 timer, indtil vurdering.

cellelevedygtighed, Cell Invasion blev Sårheling Assay

Cellelevedygtighed måles 3 dage efter transfektion med MTS (CellTiter 96 vandig One Solution Cell Proliferation Assay, Promega). Data er den gennemsnitlige ± standardafvigelse af 6 uafhængige forsøg. Celleinvasion assays blev udført med CytoSelect 24-brønds celleinvasion assaykit (celle BioLab, San Diego, CA) ifølge producentens instruktioner. Transficerede celler blev resuspenderet i dyrkningsmedium uden FBS og anbragt i det øvre kammer i tre eksemplarer. Efter 48 timers inkubation ved 37

o C (5% CO2), blev celler migrerer gennem membranen farves. Resultaterne blev udtrykt som invaderede celler kvantificeres ved OD 560 nm. Sårhelingsprocessen begynder med vævsmatrix remodeling, migration, og eventuel lukning af sårområdet. Derfor dette assay anvendes ofte til vurdering af kræftcelle migration. Sårheling assay blev udført med CytoSelect 24 brønde sårheling assay kit ifølge producentens instruktioner. For at generere en viklede felt, transficerede celler blev dyrket, indtil de dannede et monolag omkring indsatsen. Efter fjernelse af insertet, blev en 0,9 mm åbent sår felt genereret og cellerne fik lov til at migrere fra hver side af hullet. Sårlukning blev overvåget og procentdelen lukningen blev målt. [Percent lukningshastigheden (%) = migreret celleoverflade /totalt overfladeareal x100)].

Apoptosis Analyser

Celler (48 timer efter transfektion) blev vasket to gange med 1 x PBS og trypsiniseret. Efter inaktivering af trypsin i komplet medium blev cellerne resuspenderet i iskold 1x binding buffer (70 pi). Annexin V-FITC-opløsning (10 pi) og 7-AAD viabilitetsfarvestoffet (20 pi) blev tilsat til 70 pi af cellesuspensionerne. Efter inkubation i 15 minutter i mørke, 400 pi iskold 1x bindingsbuffer blev tilsat. Den apoptotiske fordeling af cellerne i hver prøve blev derefter bestemt ved anvendelse af en FACS (Cell Lab QUANTA SC, Beckman Coulter, Fullerton, CA). Data er den gennemsnitlige ± standardafvigelse af fire uafhængige forsøg.

Plasmid Byggeri og 3’UTR-Luciferase Assay

Vi konstrueret individuelle plasmider for hvert bindingssted i 3’UTR af mRNA fra potentielle målgener baseret på microRNA.org information. Derefter bekræftede vi miR-182-5p binding til target gener mRNA 3’UTR ved luciferaseanalyse med miR-182-5p forløber. PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspressionsvektor blev anvendt til at udføre 3’UTR luciferase assay (Promega, Madison, WI, USA). Primersekvenserne anvendt til plasmid inserts er vist i tabel 1. I et totalt volumen på 20 pi, 5 pi af hver af 100 pM forward primer og reverse primer, 2 pi 10x annealing buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl, 10 mM EDTA) og 8 pi vand blev sat til en 200 pi PCR-rør og inkuberet ved 95 ° C i 5 minutter og derefter anbragt ved stuetemperatur i 1 time. Oligonucleotiderne blev ligeret i

Pmel

I-

Xba

stedet i pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector. Koloni direkte PCR blev udført for insert genkendelse ved hjælp REDTaq (Sigma, St. Louis, MO, USA). Primerne anvendt til PCR var som følger: fremadrettet primer, 5′-cgtgctggaacacggtaaaa-3 ‘; revers primer, 5’-gcagccaactcagcttcctt-3 ‘. PCR parametre for cykling var som følger: 94 ° C i 3 minutter, 30 cykler af PCR ved 94 ° C i 30 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder, 72 ° C i 10 minutter og 4 ° C i 10 minutter. PCR-produktet blev fordøjet med NotI (Takara /Fisher Scientific,

Pittsburgh

,

PA, USA

). Størrelserne af vektorer, som indeholder inserter var omkring 200 bp og 100 bp ved elektroforese siden Notl-genkendelsessekvensen blev inkorporeret i primerne. For MIR-182-5p precursor transfektion, blærecancer celler co-transficeret med MIR-NC og pmirGLO eller MIR-182-5p og pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspressionsvektorer anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Luciferaseaktivitet blev vurderet ved hjælp af Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega) (48 timer efter deres transfektion).

overekspression Plasmid af målgener (RECK, Smad4) og funktionelle analyser

for at konstruere målgen (RECK, Smad4) overudtrykker plasmider, blev generne amplificeret med totalt RNA fra human voksne normale nyrevæv (katalog #: R1234142-50, Biochain Institute, Newark, CA) og RWPE-1 ved transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR). Sekvenserne af primere til kloning er vist i tabel 1. Polymerasekædereaktion produkter blev klonet ind i pTARGET-pattedyrekspressionsvektor System (Promega, Madison, WI). Så pCMV6-RECK eller pCMV6-Smad4 blev opnået ved subkloning en NheI-XhoI fragment fra pTARGET-RECK /Smad4 i NheI-XhoI site af pCMV6-indtastning Vector.

I første omgang vi transficeret pCMV6-tom og pCMV6- RECK eller -Smad4 i blære kræftceller og RNA og protein blev udvundet. Overekspression af RECK eller Smad4 blev bekræftet ved real time RT-PCR og Western blot-analyse og funktionelle analyser blev udført.

kvantitativ real-time RT-PCR

Kvantitativ real-time RT-PCR var udført tredobbelt med et Applied Biosystems Prism 7500 Fast Sequence Detection System ved hjælp TaqMan universal PCR Master mix ifølge producentens protokol (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). TaqMan prober og primere blev indkøbt fra Applied Biosystems. Humant GAPDH og RNU48 blev anvendt som en endogen kontrol. Niveauer af RNA-ekspression blev bestemt under anvendelse af 7500 Fast System SDS softwareversion 1.3.1 (Applied Biosystems).

Western Analysis

totalt celleprotein (15-20 ug) blev anvendt til Western blotting . Prøverne blev løst i 4-20% Præcise Protein Gels (Thermo Scientific, Rockford, IL) og overført til PVDF-membraner (Amersham Biosciences, Fairfield, CT). Membranerne blev nedsænket i 0,3% skummetmælk i TBS indeholdende 0,1% Tween 20 i 1 time og probet natten over ved 4 4 ° C med primære polyklonale og monoklonale antistof mod Smad4 (# 9515), RECK (# 3433), beta-catenin ( # 9562), CREB (# 9197) og beta-tubulin (# 2128) fra Cell Signaling Technology, Beverly, MA. Blots blev vasket i TBS indeholdende 0,1% Tween 20 og mærket med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært anti-muse eller anti-kanin-antistof (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Proteiner blev forstærket af kemiluminescens (Amersham ECL plus Western Blotting detection system, Fairfield, CT) til visualisering. De protein Ekspressionsniveauerne blev udtrykt i forhold til beta-tubulin eller CREB niveauer

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af StatView. (Version 5, SAS Institute Inc., NC). En

s

-værdi af 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Tak

Vi takker Dr. Roger Erickson for hans støtte og bistand med udarbejdelse af manuskriptet. .