PLoS ONE: Integreret Funktionel, Gene Expression og Genomisk Analyse for Identifikation af Cancer Targets

Abstrakt

De fleste nye lægemiddelkandidater godkendelser til kræft er baseret på eksisterende terapeutiske mål. En metode til identifikation af hidtil ukendte mål er at udføre high-throughput RNA-interferens (RNAi) cellulær levedygtighed skærme. Vi beskriver en ny tilgang, der kombinerer RNAi screening i flere cellelinjer med genekspression og genomisk profilering at identificere nye cancer targets. Vi udførte parallelle RNAi skærme i flere kræftceller til at identificere gener, der er afgørende for levedygtigheden i nogle cellelinjer, men ikke andre, tyder på, at disse gener udgør vigtigste drivkræfter for cellulær overlevelse i specifikke kræftceller. Denne tilgang blev bekræftet ved identifikation af

PIK3CA

, lyddæmpning af som var selektivt livsfarlige for MCF7 cellelinje, der huser en aktiverende onkogen

PIK3CA

mutation. Vi kombinerede vores funktionelle RNAi tilgang med genekspression og genomisk analyse, muliggør identifikation af flere nye kinaser, herunder

WEE1

, der er afgørende for levedygtigheden kun cellelinjer, der har et forhøjet niveau af udtryk for denne kinase. Endvidere har vi identificeret en delmængde af brysttumorer at stærkt udtrykker WEE1 antyder, at WEE1 kunne være et hidtil ukendt terapeutisk mål i brystkræft. Afslutningsvis denne strategi repræsenterer en ny og effektiv strategi til identifikation af funktionelt vigtige terapeutiske mål i kræft

Henvisning:. Iorns E, Lord CJ, Grigoriadis A, McDonald S, Fenwick K, MacKay A, et al . (2009) Integreret Funktionel, Gene Expression og Genomisk Analyse for Identifikation af Cancer Mål. PLoS ONE 4 (4): e5120. doi: 10,1371 /journal.pone.0005120

Redaktør: Toru Ouchi, Northwestern University, USA

Modtaget: Januar 12, 2009; Accepteret: 6 marts 2009; Udgivet: April 9, 2009

Copyright: © 2009 Iorns et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Vi takker Gennembrud Breast Cancer og New Zealand ungdomsuddannelse Kommissionen til finansiering denne undersøgelse. Vi anerkender også NHS finansiering til NIHR Biomedical Research Centre. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Central til design af nye terapeutiske strategier for kræft er identifikationen af ​​gener, der er afgørende for overlevelsen af ​​tumorceller, men som stort set overflødige i normale celler [1]. Korrelere molekylære ændringer med tumorudvikling har givet en rute til identifikation af potentielle lægemiddelkandidater og giver rationalet bag bestræbelserne på at karakterisere den genetiske variation og genekspression i tumorer. den korrelative karakter af disse data betyder imidlertid, at det ofte ikke muligt at afgøre, om observationerne er forårsagende eller blot en effekt af sygdomstilstanden [2].

RNA-interferens (RNAi) er et naturligt forekommende mekanisme som regulerer genekspression på post-transkriptionel niveau. I mammale celler, korte interfererende RNA’er (siRNA’er) medierer nedbrydningen af ​​komplementære messenger RNA (mRNA) transkripter i en sekvens-afhængig måde [3]. Denne sekvens-specificitet RNAi kan udnyttes eksperimentelt at lukke munden på specifikke gener ved transfektion af siRNA’er i pattedyrsceller. Denne teknologi er blevet udvidet til RNAi biblioteker, der omfatter reagenser, der er målrettet en bred vifte af transkripter, hvilket tillader den rolle, multiple gener i en cellulær proces, der skal vurderes i en neutral måde [4], [5]. RNAi skærme er blevet anvendt til at identificere gener er vigtige for cancercellelinjer fænotyper, herunder cellelevedygtighed [6], [7].

Vi viser, at RNAi skærme kan anvendes til at identificere gener, der er differentielt kræves for levedygtigheden af ​​kræft cellelinjer og, som bevis for dette princip, identificere den kendte onkogen

PIK3CA

som afgørende for levedygtigheden i MCF7-celler med en aktiverende

PIK3CA

mutation. Vi viser, at kombinere funktionelle RNAi-analyse med genekspression og genomisk analyse giver en ny strategi til identifikation af de vigtigste drivkræfter for specifikke kræftceller, som er potentielle roman lægemiddelkandidater.

Resultater

Parallel RNAi skærme til at identificere kinaser essentielle for cellernes levedygtighed

for at funktionelt identificere vigtige gener udtrykkes i kræftceller, brugte vi en RNAi screening tilgang. Ved hjælp af en bred vifte af menneskelige kræftceller og en kort interfererende RNA (siRNA) bibliotek rettet mod 779 kinaser, vi udførte fem parallelle levedygtighed skærme bruger MCF7 (ER positiv, luminale brystkræft), CAL51 (ER negativ, mikrosatellit ustabil brystkræft), A549 (lungekræft), NCI-H226 (lungekræft) og HeLa (livmoderhalskræft) cellelinier (figur 1a og tabel S1). Vi valgte at målrette kinaser, da disse proteiner er relativt modtagelig for farmakologisk hæmning og har vist sig at være vigtige drivkræfter for mange forskellige cancerformer. Kort fortalt blev celler udpladet i plader med 96 brønde og transficeret med siRNA fra biblioteket. Her anvendte vi en SMARTpool bibliotek, hvor hver brønd på-plade 96 indeholdt en pulje af fire forskellige siRNAs (a SMARTpool) rettet ét gen. Efter syv dage kontinuerlig kultur blev cellelevedygtighed i hver brønd anslås ved anvendelse af et luminescerende assay måler cellulære ATP-niveauer. For at sammenligne tab af levedygtighed effekter i forskellige cellelinier, normaliseret vi cellelevedygtighed data fra hver cellelinie til medianen af ​​alle virkninger i denne cellelinie, repræsenterer hver SMARTpool virkning som en Z-score [8], hvor Z = 0 repræsenterede ingen effekt på rentabilitet og Z-score mindre end -3 repræsenterede en betydelig tab af levedygtighed effekter. Resultaterne fra de fem cellelevedygtighed skærme tilnærmet normalfordelinger, tillader sammenligning af de individuelle siRNA effekter på tværs cellelinier (figur 1b).

a. Scatter plots af Z-scores fra rentabilitet celle skærme udført sideløbende i MCF7, CAL51, HeLa, A549 og NCI-H226 kræft cellelinjer. Sorte diamanter – individuelle siRNA SMARTpools rettet mod 779 kinase gener pr cellelinje. Z scores≤-3 repræsenterer betydeligt tab af levedygtighed effekter. b. Distribution plots af Z-scores fra de parallelle siRNA skærme. Z scores≤-3 repræsenterer betydeligt tab af levedygtighed effekter. c. Kinaser kan klassificeres på grundlag af effekten af ​​tavshed på cellernes levedygtighed på tværs af alle fem kræft cellelinjer. siRNAs der ikke havde nogen signifikant effekt på cellelevedygtighed i nogen af ​​de cellelinjer undersøgte sandsynlige mål uvæsentlige kinaser (eller siRNA var ikke funktionel). siRNAs der forårsager betydelige tab af cellelevedygtighed i alle cellelinjer undersøgte sandsynlige mål kinaser, der er afgørende for levedygtigheden i de fleste tumorer eller dem, der er afgørende for levedygtigheden af ​​både normale og tumorceller. siRNAs der kun forårsager betydelig dødelighed i nogle, men ikke alle cellelinjer sandsynlige mål kinaser, som måske ikke er kritisk for levedygtigheden af ​​alle celler, men repræsenterer tumor-specifikke effekter. d. Parallelle RNAi skærme identificere en kendt onkogen,

PIK3CA

. Cell levedygtighed effekter af

PIK3CA

målretning vises i fem cellelinier. MCF7-celler blev selektivt følsomme over for målretning af

PIK3CA

som påvist af en Z-score på ≤-3. siRNAs der forårsager betydelig letalitet i nogle, men ikke alle cellelinjer kan forventes at målrette kinaser, der ikke er kritiske for levedygtigheden af ​​alle celler, men repræsenterer tumorspecifikke virkninger. I nogle tilfælde kan dette forklares ved forekomsten af ​​en aktiveret onkogen som det er tilfældet med MCF7-celler, der huser en aktiverende

PIK3CA

mutation.

Vi ræsonnerede, at siRNAs forårsager betydelig tab af levedygtighed celle (Z≤-3) i alle cellelinjer analyseret sandsynligvis repræsenteret kinaser, der er afgørende for levedygtigheden i de fleste tumorer eller mere sandsynligt afgørende for levedygtigheden af ​​både normale og tumorceller. Tilsvarende siRNAs der ikke havde nogen signifikant effekt på levedygtighed i nogen af ​​de cellelinier enten ikke funktionel eller målrettet ikke-væsentlige kinaser. Endelig har vi den hypotese, at siRNAs der kun forårsagede betydelig dødelighed i nogle men ikke alle cellelinier, identificerede kinaser, der repræsenterer tumorspecifikke virkninger potentielt identificere nye terapeutiske mål (figur 1c). For at bestemme arten af ​​virkningen blev siRNAs klassificeret ved at sammenligne Z-score mellem cellelinier (tabel 1).

Identifikation af

PIK3CA

giver bevis for princippet for tilgang

Vores indledende analyse viste, at

PIK3CA

lyddæmpning var tilbøjelige til at repræsentere en cellelinje specifik effekt. Silencing af

PIK3CA

var selektivt letal for MCF7-celler (Z score på -3,80), men ikke HeLa, CAL51, A549 eller H226 (figur 1d og tabel 1). MCF7 celler vides at indeholde et aktiverende

PIK3CA

mutation (E545K), hvorpå disse celler er afhængige for overlevelse [9], [10]. Endvidere har amplificeringer og gain-of-funktion mutationer af

PIK3CA

været forbundet med ovariecancer [11], livmoderhalskræft [12] og brystkræft [10]. Afhængigheden af ​​MCF7-celler ved en

PIK3CA

aktiverende mutation, kan være et onkogen afhængighed virkning, som kan udnyttes terapeutisk [13]. I tilfælde af gen afhængighed, tumorceller blive fysiologisk afhængig af fortsatte funktion af aktiverede eller overudtrykte onkogener som derfor oplagt kandidat terapeutiske mål. For eksempel effektiviteten af ​​imatinib (Gleevec) til behandling af leukæmier forsynet med BCR-ABL fusion [14] indeholder en klinisk eksempel på onkogen afhængighed, og hvordan den kan udnyttes terapeutisk. Identifikationen af ​​

PIK3CA

valideret vores tilgang til at identificere kinaser, der er afgørende for tumorcelleoverlevelse.

Korrelation af cellelevedygtighed med genekspression

Selvom identificerede celle-specifikke geneffekter på skærmen RNAi kan være på grund af aktiverende mutationer, som i

PIK3CA

, er det sandsynligt, at andre kunne opstå på grund af købet af et forhøjet niveau af genekspression. For at undersøge dette udførte vi hele genomet genekspression profilering på cellelinie panel under anvendelse af human-6 v2 Illumina BeadChips [15] og sammenlignet denne til screening RNAi data (Tabel S2) de. Ekspressionsprofil blev udført tre gange og kinaser med betydelige forskelle i genekspression mellem cellelinier identificeret ved variansanalyse. For gener, hvor mindst en siRNA signifikant nedsatte cellernes levedygtighed (Tabel 1), undersøgte vi sammenhængen mellem cellulære levedygtighed efter siRNA transfektion og genekspression. Denne analyse identificeret fire gener, hvor cellulær levedygtighed omvendt korreleret med genekspression;

ADCK2

,

NAGK

,

TLR6

WEE1

(figur 2 og tabel 1). Hver af disse korrelationer foreslog, at forhøjet ekspression af det pågældende gen kan være afgørende for tumor overlevelse og kan derfor udgøre et hidtil ukendt terapeutisk mål.

a-d. Z-scores fra siRNA skærme, Z scores≤-3 er fremhævet med en rød stiplet boks. e-h. Normaliseret ekspressionsniveauer beregnet ud fra Illumina udtryk profilering. Høj udtryk korreleret med følsomhed over for siRNA, fremhævet med en rød stiplet boks. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM). Betydningen af ​​forskelle i gener ekspression mellem cellelinjer blev vurderet ved envejs ANOVA og p-værdi vises for hver cellelinier. i-l. sammenligning af Z værdier med normaliserede ekspressionsniveauer. Den stiplede linie repræsenterer Z = -3 tærskel for betydeligt tab af levedygtighed effekter (p 0,0015). For de fire gener er vist, et forhøjet niveau af ekspression er konsistent med tab af levedygtighed efter siRNA transfektion. Se tabel 1 for Pearson korrelation af Z vs udtryk.

The Toll-lignende receptor 6, (TLR6) er kendt for at aktivere nukleare faktor kappa-B signalering, en kandidat terapeutisk mål i kræft [16] og aktivering af TLR pathway er for nylig blevet foreslået at spille en rolle i tumorigenese [17]. Funktionen af ​​

ADCK2

(aarF domæne indeholdende kinase 2) er mindre veletableret. NAGK (N-acetylglucosamin kinase) konverterer endogen N-acetylglucosamin (GIcNAc), en vigtig komponent i komplekse kulhydrater, fra lysosomal nedbrydning eller ernæringsmæssige kilder til GlcNAc 6-phosphat, som del af en katalytisk genbrugsruten. Funktionen af ​​WEE1 diskuteres nedenfor.

Korrelation af genekspression med genomisk analyse

Vi undersøgte, om den relativt forhøjede udtryk for de fire gener er identificeret i vores RNAi skærmen kunne forklares ved ændringer i gen kopi nummer (dvs. kopital gevinster og /eller genamplifikation). Genkopital blev undersøgt under anvendelse mikroarray-baserede komparativ genomisk hybridisering (aCGH) analyse og overlejret på RNAi og genekspression data (figur 3, figur S1 og tabel S3). Dette kombineret analyse viste, at for nogle cellelinier, høj ekspression af

ADCK2

,

NAGK

eller

WEE1

var forbundet med en stigning i genkopiantal, potentielt identificere en årsag af forhøjet ekspression. MCF7-celler var meget følsomme over for

ADCK2

siRNA og dette blev afspejlet ved opregulering af udskrift og stigningen i genkopital på

ADCK2

. Ligeledes en stigning i genkopital var i overensstemmelse med forhøjet ekspression og siRNA følsomhed til

NAGK

i A549-celler. Endelig følsomheden af ​​HeLa-celler til

WEE1

siRNA var konsistent med opregulering af dette gen og genomisk gevinst (figur 3 og figur S1).

Scatter plots illustrerer forholdet mellem genkopital og genekspression. Lodret stiplede linjer repræsenterer tærsklen for kopital gevinster (AWS nøgletal 0,12).

Yderligere karakterisering af WEE1

WEE1 har en veldefineret rolle i cellecyklus checkpoint kontrol med WEE1 aktivitet begrænse pro-mitotiske virkninger af Cdc2 (aka CDK1) [18]. Derfor, tab af WEE1-aktivitet og dens ødelæggelse er et krav for indrejse i mitose [19], hvilket tyder på, at WEE1 aktivitet faktisk kan begrænse tumorcellevækst. Eftersom vores RNAi data tydede på, WEE1 er, i nogle sammenhænge, ​​kritisk for levedygtigheden af ​​cancerceller, der overudtrykker det undersøgte vi rollen af ​​denne kinase yderligere. Vi først bekræftet, at Wee1-protein blev overudtrykt i HeLa og CAL51 celler understøtter vores RNA-analyse (figur 4a). For at bekræfte korrelationen af ​​følsomhed over for siRNA og WEE1 udtryk, blev WEE1 tavshed af en uafhængig pulje af siRNAs designet til at reducere off-target effekter (Wee1 ONTARGETplus). CAL51 og HeLa cellelinier blev signifikant mere følsomme over for silencing af WEE1 end cellelinier som ikke har overekspression WEE1 (figur 4b og figur S2). Små molekyler er blevet udviklet til at inhibere WEE1 på det grundlag, at inhibering af denne kinase kan føre til ophævelse af G

2 /M checkpoint. Mange cancerceller udviser en defekt G

1 checkpoint resulterer i en afhængighed af G

2 /M checkpoint under cellereplikation og som sådan inhibering af G

2 /M checkpoint kan være dødelig i dette sammenhæng [20]. Vi anvendte en lille molekyle WEE1 inhibitor (PHCD [21]) for at bekræfte den selektive følsomhed CAL51 og HeLa cellelinier til WEE1 inhibering (fig 4c). Vi undersøgte også yderligere cellelinier til WEE1 ekspression og følsomhed over for WEE1 målretning med prostatacarcinom-cellelinier PC3 og DU145, og det ikke-tumorfremkaldende bryst epitelcellelinie MCF10A. Ingen af ​​disse cellelinjer udtrykte høje niveauer af WEE1 (figur 4a), og som forventet, ingen var følsomme over for WEE1 målretning (figur 4b og 4c).

a. Western blot analyse af lysater fremstillet fra HeLa, CAL51, MCF7, A549, NCI-H226, PC3, DU145 og MCF10A celler. En antistof, der genkender WEE1 blev anvendt med β-tubulin som en loading kontrol. WEE1 udtryk øges betydeligt i HeLa og CAL51 celler i forhold til MCF7, A549, NCI-H226, PC3, DU145 og MCF10A celler. b. Venstre panel: Cell levedygtighed assay i celler transficeret med WEE1 ONTARGETplus SMARTpool eller ONTARGETplus siControl. WEE1 silencing var selektivt letal for WEE1 overudtrykker HeLa og CAL51 celler. Fejlsøjler repræsenterer SEM fra tredobbelte transfektioner. Højre panel: Western blot analyse af lysater fremstillet fra CAL51 celler transficeret med WEE1 ONTARGETplus SMARTpool eller ONTARGETplus siControl. En antistof, der genkender WEE1 blev anvendt med β-tubulin som en loading kontrol. WEE1 ONTARGETplus SMARTpool signifikant reduceret Wee1-protein-ekspression sammenlignet med siControl transficerede celler. c. Cellelevedygtighed assay i celler behandlet med WEE1 inhibitor. WEE1 inhibering var selektivt letal for WEE1 overudtrykker HeLa og CAL51 celler. Fejlsøjler repræsenterer SEM fra tredobbelte cellebehandlinger. d. Panelet til venstre: Western blot analyse af lysater fremstillet fra celler behandlet med 5 pM WEE1 inhibitor til 0, 6, 24 og 48 timer. En antistof, der genkender PARP blev anvendt med β-tubulin som en loading kontrol. Efter 24 timer WEE1 hæmning induceret PARP spaltning (Clvd PARP) i WEE1 overekspression HeLa og CAL51 celler, men inducerede ikke PARP spaltning i MCF7 og NCI-H226 celler, som udtrykker WEE1 på et normalt niveau. Panelet til højre: Caspase 3,7-aktivitet i celler behandlet med 5 pM WEE1 inhibitor i 24 timer. WEE1 hæmning induceret caspase 3,7 aktivering i WEE1 overekspression HeLa og CAL51 celler, men inducerede ikke caspase 3,7 aktivering i MCF7 og NCI-H226 celler, som udtrykker WEE1 på et normalt niveau. Fejlsøjler repræsenterer SEM fra tredobbelte cellebehandlinger. e. Venstre panel: Western blot analyse af lysater fremstillet fra celler transficeret med WEE1 ONTARGETplus SMARTpool eller ONTARGETplus siControl. En antistof, der genkender PARP blev anvendt med β-tubulin som en loading kontrol. Silencing af WEE1 induceret PARP spaltning i WEE1 overekspression HeLa og CAL51 celler, men inducerede ikke PARP spaltning i MCF7 og NCI-H226 celler, som udtrykker WEE1 på et normalt niveau. Højre panel: Caspase 3,7 aktivitet i celler transficeret med WEE1 ONTARGETplus SMARTpool eller ONTARGETplus siControl. Silencing af WEE1 induceret caspase 3,7 aktivering i WEE1 overekspression HeLa og CAL51 celler, men inducerede ikke caspase 3,7 aktivering i MCF7 og NCI-H226 celler, som udtrykker WEE1 på et normalt niveau. Fejl søjler repræsenterer SEM fra tredobbelte transfektioner.

Samlet set vores resultater giver grund til at formode, at cellelinier viser højere niveauer af WEE1 udtryk er følsomme over for WEE1 hæmning. For at undersøge mekanismen for følsomhed i disse cellelinier, undersøgte vi niveauet af apoptose efter WEE1 inhibering. Kemisk inhibering af WEE1 forårsagede apoptose kun i cellelinier med højere niveauer af WEE1 ekspression (figur 4d), en observation bekræftes også af brugen af ​​WEE1 siRNA (figur 4e).

kliniske betydning af WEE1

Vores data tyder på, at WEE1 overekspression kan være afgørende for tumor cellelevedygtighed. Derfor forhørte vi udtryk for WEE1 i offentligt tilgængelige datasæt, detalje udtrykket profiler af humane bryst tumorcellelinjer og tumorer [22], [23]. Denne analyse viste, at WEE1 udtryk korrelerer med

WEE1

genkopitallet (Spearman p = 0,039) og viser en tendens (t-test p = 0,06, Mann-Whitney test p = 0,07) til højere ekspression i cellelinjer med en luminal fænotype (data ikke vist). På grundlag af disse data, undersøgte vi WEE1 ekspression ved immunhistokemi (IHC). Ekspression af WEE1 vurderet af IHC på formalinfikserede, paraffinindlejrede cellelinie pellets korrelerede med udtryk målt ved western blotting, der beviser, specificitet WEE1 antistof (figur 5a). Vi derefter undersøgt en godt kommenteret serie af brysttumorer [24], [25] og fandt, at 35% udviste niveauer af WEE1 ekspression svarende til CAL51 celler, som er følsomme over for WEE1 inhibering (figur 5b). Endvidere blev høje niveauer af WEE1 ekspression fortrinsvis findes i brystcancer med en luminal fænotype, som defineret af Nielsen et al. [26], i overensstemmelse med analysen af ​​brystcancercellelinier. I forbindelse med vore tidligere data implicerer WEE1 som cancer target, disse immunohistokemiske data antyder, at anvendelsen af ​​Wee1-inhibitorer kan være passende i en signifikant delmængde af brystkræftpatienter.

a. WEE1 immunhistokemisk farvning i formalinfikserede, paraffinindlejrede brystcancercellelinier og invasive brystcancere. Bemærk de lave niveauer af WEE1 udtryk i H226 celler og en basal-lignende brystkræft og de høje niveauer af WEE1 udtryk i CAL51 celler og luminale og HER2 brystkræft. (Harris Hæmatoxylin /DAB farvning; oprindelige forstørrelse × 200). b. Høje niveauer af WEE1 ekspression er fortrinsvis udtrykkes i luminale brystcancere. Sager blev scoret ifølge Allred pointsystem [36] som beskrevet i materialer og metoder. For hver tumortype procentdelen af ​​tumorer med høj WEE1 ekspression er vist. Høj WEE1 ekspression viste en statistisk signifikant direkte korrelation med ekspression af østrogen og progesteron-receptorer og cyclin D1, og en signifikant omvendt korrelation med tumorstørrelse, histologisk bedømmelse og ekspression af epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR), cytokeratin (Ck) 14, Ck 5 /6, Ck 17, MIB-1-indekset og caveolins 1 og 2. Ingen korrelationer mellem WEE1 immunhistokemisk ekspression og tilstedeværelse af Lympho-vaskulær invasion, lymfeknudemetastase, HER2 ekspression eller genamplifikation, p53-ekspression mærkning, og

CCND1

og

MYC

genamplifikation blev fundet [24], [37] (data ikke vist). Alle sager blev klassificeret i luminale, HER2 og basal-lignende grupper efter den immunhistokemiske panel beskrevet af Nielsen et al. [26].

Diskussion

De fleste nye lægemiddelkandidater godkendelser til kræftbehandling er baseret på eksisterende mål. I stedet afspejler et fravær af mål, det er måske et tegn på omkostninger og tid involveret i at identificere nye terapeutiske tilgange. Parallel RNAi screening kan tillade en enkel, high-throughput, tilgang til den funktionelle identifikation af mål, og andre har også brugt parallel RNAi screening for at identificere potentielle førere af tumorudvikling og kandidatlandene mål [27]. Vores identifikation af

PIK3CA

, en kendt onkogen og terapeutisk mål, ved hjælp af parallelle RNAi skærme giver stærke indicier for denne tilgang. Endvidere kan forbedringer i RNAi teknologi gør parallel RNAi screening af en meget enklere og omkostningseffektiv proces [28], [29]. Parallelle RNAi skærme, når de kombineres med ledsager tilgange, såsom udtryk profilering, genomisk profilering og high throughput histopatologisk og immunhistokemisk analyse har potentiale til at identificere potentielle mål, der er værdig til yderligere undersøgelse. I tilfælde af WEE1, har en kombination af RNAi screening, transkript profilering, genomisk profilering og histologisk analyse førte til identifikation af en patient delmængde (luminale brystcancer), hvor inhibering af denne kinase kunne undersøges som et potentielt terapeutisk strategi. Indarbejde denne tilgang i den konventionelle medicin target identifikationsprocessen har potentiale til at strømline udviklingen af ​​nye behandlingsformer.

Materialer og metoder

cellelinjer, forbindelser, plasmider og siRNA

MCF7, CAL51, HeLa, A549, NCI-H226, PC3, DU145 og MCF10A celler blev opnået fra ATCC (USA) og vedligeholdt i henhold til leverandørens anvisninger. WEE1 inhibitor (681.637) blev opnået fra Calbiochem (UK). MCF7 og HeLa-celler blev transficeret med SMARTpool siRNAs hjælp Dharmafect 3 transfektionsreagens; A549 og NCI-H226-celler blev transficeret med SMARTpool siRNAs hjælp Dharmafect 1 transfektion reagens ifølge producentens instruktioner (Dharmacon). CAL51 celler blev transficeret med SMARTpool siRNAs hjælp Oligofectamine transfektion reagens ifølge producentens instruktioner (Invitrogen). DU145-celler blev transficeret med SMARTpool siRNAs anvendelse af lipofectamin 2000 transfektion reagens ifølge producentens instruktioner (Invitrogen). Kinasen siRNA bibliotek (siARRAY – targeting 779 kendte og formodede humane proteinkinasegenerne) opnåedes i ti 96-brønds plader fra Dharmacon (USA). Hver brønd i dette bibliotek indeholdt et SMARTpool af fire forskellige siRNA arter målrettet forskellige sekvenser af target transkript. Hver plade blev suppleret med siCONTROL (ti brønde, Dharmacon (USA)). Den WEE1 ONTARGETplus SMARTpool og ONTARGETplus siControl blev opnået fra Dharmacon (USA)

Antistoffer

Antistoffer rettet mod følgende epitoper blev anvendt:. WEE1 (4936, Cell Signaling, UK), PARP (9542, cellesignalering, UK) og β-tubulin (T4026, Sigma, UK). Alle sekundære antistoffer anvendt til Western blot-analyse blev HRP konjugeret.

siRNA skærm metode

Celler udpladet i 96 brønds plader blev transficeret 24 timer senere med siRNA (slutkoncentration 100 nM), i henhold til producentens instruktioner. Hver siRNA plade blev suppleret med 10 brønde i siControl. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne trypsineret og delt i tre identiske replika-plader. Medier var genopfyldes efter 48 timer og 96 timer, og cellelevedygtighed blev vurderet efter syv dage ved hjælp CellTiter Glo Luminescent Cell Levedygtighed Assay (Promega, USA) i henhold til producentens anvisninger. Data fra hver cellelinje blev forarbejdet som følger: luminescens aflæsning for hver brønd på en plade var log

2 transformeret og udtrykt i forhold til medianen luminescens værdien af ​​alle brønde på den samme plade (plade centrering). Disse data blev derefter normaliseret ifølge medianen af ​​hele data skærmen ved hjælp af den mediane absolutte afvigelse (MAD) for at estimere den sande variation inden for hver skærm [30]. Denne normalisering repræsenterede virkningen af ​​hver SMARTpool i hver cellelinje som en Z-score [30] og tilladt virkningerne af hver SMARTpool på levedygtighed, der skal sammenlignes på tværs cellelinien panel. AZ score≤-3 blev taget som tærsklen betydning for reduceret cellelevedygtighed, der repræsenterer tre sanitetsorganisationernes fra median og tilnærme til tre standardafvigelser.

Transcript profilering

RNA blev ekstraheret fra cellelinier med Trizol og phenol /chloroform-ekstraktion efterfulgt af isopropanol udfældning. For rækkevidde cellelinje blev tredobbelte ekstraktioner og profiler udføres. Biotin-mærket cRNA blev frembragt ved hjælp af en lineær forstærkning kit (IL1791; Ambion, Austin, TX, https://www.ambion.com) under anvendelse 250 ng kvalitet kontrolleres totalt RNA som input. Chip hybridiseringer, vask, blev Cy3-streptavidin (Amersham Biosciences) farvning, og scanning udført på en Illumina BeadStation 500 (San Diego, https://www.illumina.com) platform ved hjælp af reagenser og efter protokoller, der leveres af producenten. cRNA prøver blev hybridiseret på Illumina human-6 v2 BeadChips, der dækker cirka 47.000 RefSeq udskrifter. Den tilfældige fordeling af store populationer af oligonucleotid-belagte kugler på tværs af de ledige stillinger i det menneskelige-6 v2 chip muliggør, gennemsnit 30 intensitet målinger pr RefSeq, hvilket gav kvantitative vurderinger af genekspression [15]. Alle grundlæggende udtryk dataanalyse blev udført ved hjælp af producentens software BeadStudio 3.1. Illumina udtryk profiler blev udført tredobbelt, de rå data blev derefter varians-stabiliserende transformeret og robust spline normaliseret under anvendelse af Lumi pakke i BioConductor software [31], [32]. Expression værdier for hver prøve var median skaleret og middelværdien udtryk værdi blev fastlagt i løbet af de tre gentagelser. Gener med signifikant forskel i ekspression mellem cellelinier blev identificeret ved envejs variansanalyse (ANOVA). Denne udskrift profilering data er nu offentligt tilgængelige (tiltrædelse ArrayExpress: E-TABM-610)

Korrelation af siRNA Z score med genekspression

Sammenhængen mellem siRNA Z score og normaliseret genekspression var. undersøgt for gener, hvor siRNA forårsagede signifikant tab af levedygtighed (Z -3). Z-score blev sammenlignet med normaliseret genekspression ved anvendelse Pearson korrelationskoefficienten. Et gen blev taget som værende signifikant korreleret hvis Pearson korrelationskoefficienten var signifikant forskellig fra nul hypotesen, var korrelationen inverse, og variationen i genekspression mellem cellelinier var signifikant forskellige som vurderet ved envejs ANOVA.

Array CGH analysemetode

Genomisk DNA blev ekstraheret fra cellelinjer under anvendelse af QIAamp DNA Blood Mini Kit (51104, Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Microarray-baserede CGH analyse blev udført på en in-house 32K teglstensforløb BAC-array platform som tidligere beskrevet [33], [34]. For kopiantal korrelationer, gennemsnittet af adaptive vægt udglattet (AWS) forhold af BAC’er, der indeholder genet af interesse blev anvendt til kopital korrelationer og kopiere nummer tildelt som tidligere beskrevet [35]. Kort fortalt AWS glattede log2 forholdstallene -0,12 blev kategoriseret som tab, der 0,12 som gevinster, og dem i mellem som uændret. Amplifikationer blev defineret som udglattede log2 forholdstallene 0,4 [35]. Databehandling og analyse blev udført i F 2.0.1 (https://www.r-project.org/) og BioConductor 1.5 (https://www.bioconductor.org/), hvilket gør udstrakt brug af modificerede udgaver af pakker aCGH, Marray og AWS i særdeleshed.

Cellelevedygtighed assay til måling WEE1 siRNA følsomhed

Celler udplades i 96 brønds plader blev transficeret 24 timer senere med WEE1 ONTARGETplus SMARTpool eller ONTARGETplus siControl (slutkoncentration 100 nM), i henhold til producentens anvisninger. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne trypsineret og delt i tre identiske replika-plader. Medier var genopfyldes efter 48 timer og 96 timer, og cellelevedygtighed blev vurderet efter syv dage under anvendelse af CellTiter Glo Luminescent Cell Levedygtighed Assay (Promega, USA) og udtrykt i forhold til betyde luminescens i brøndene transficeret med siControl.

Cell levedygtighed assay til måling af lægemiddelfølsomhed

Celler blev udpladet i plader med 96 brønde og udsat for forskellige doser af WEE1 inhibitor (Calbiochem, katalog nr. 681.637, 4- (2-phenyl) -9-hydroxypyrrolo [3, 4-c] carbazol-1,3- (2H, 6H) -dion (PHCD)) [21]. Cellelevedygtighed blev vurderet ved CellTiter Glo Luminescent Cell Levedygtighed Assay (Promega, USA) 48 timer senere og overlevende fraktion for hver dosis af lægemiddel vurderes ved at dividere luminescens værdien af ​​lægemiddel behandlet ved luminescens værdi køretøj.

Western