PLoS ONE: Forbedret G2 /M Arrest, Caspase Relaterede Apoptose og til nedsat E-Cadherin Dependent Intercellulær Vedhæftning af Trabectedin i prostatakræft Stamceller

Abstrakt

Trabectedin (Yondelis, ET-743) er en marine-afledt tetrahydroisoquinolin alkaloid. Den er oprindeligt stammer fra Caribien marine sækdyr

Ecteinascidia turbinata

og i øjeblikket fremstillet syntetisk. Trabectedin er aktivt mod en række forskellige tumorcellelinier vokser i kultur. Den foreliggende undersøgelse fokuserede på effekten af ​​trabectedin i celleproliferation, cellecyklusprogression, apoptose og klumpformet dannelse i prostatakræft stamceller (CSCS). Klynge af differentiering (CD) 133

+ høj /CD44

+ høje prostata CSCS blev isoleret fra DU145 og PC-3 human prostatacancer-cellelinie gennem flowcytometri. Vi studerede vækstinhiberende virkninger af trabectedin og dets molekylære mekanismer på humane prostata CSCS og ikke-CSCS. DU-145 og PC-3 CSCS blev behandlet med 0,1, 1, 10 og 100 nM trabectedin i 24, 48 og 72 timer og vækstinhiberingen satser blev undersøgt under anvendelse af kugle-dannende assay. Annexin-V assay og immunofluorescens blev udført til påvisning af celledød. Koncentrationsafhængig effekter af trabectedin på cellecyklussen blev også vurderet. Cellerne blev udsat for forskellige doser af trabectedin i 24, 48 og 72 timer for at evaluere effekten af ​​trabectedin på antallet og diameteren af ​​sfæroider. Ifølge resultaterne, trabectedin induceret cytotoksicitet og apoptose på IC

50 dosis, hvilket resulterer i en betydelig stigning ekspression af caspase-3, caspase-8, caspase-9, p53 og formindske ekspression af bcl-2 i dosisafhængig måde. Cellecyklus analyser afslørede, at trabectedin inducerer dosisafhængig G2 /M-fase-standsning af cellens cyklus, især ved høje doser behandlinger. Tre-dimensionelle kultur undersøgelser viste, at trabectedin reducerede antallet og diameter sfæroider af DU145 og PC3 CSCS. Endvidere har vi fundet, at trabectedin forstyrret celle-celle interaktioner via E-cadherin i prostasphere af DU-145 og PC-3 CSCS. Vores resultater viste, at trabectedin hæmmer celleproliferation og accelererer apoptotiske begivenheder i prostata CSCS; og kan være en potentiel effektiv terapeutisk middel mod prostatakræft

Henvisning:. Acikgoz E, Guven U, Duzagac F, Uslu R, Kara M, Soner BC, et al. (2015) Forbedret G2 /M Arrest, Caspase Relaterede Apoptose og til nedsat E-Cadherin Dependent Intercellulær Vedhæftning af Trabectedin i prostatakræft stamceller. PLoS ONE 10 (10): e0141090. doi: 10,1371 /journal.pone.0141090

Redaktør: Shian-Ying Sung, Taipei Medical University, TAIWAN

Modtaget: 23, 2015; Accepteret: 3 Oktober 2015; Udgivet: 20 oktober 2015

Copyright: © 2015 Acikgoz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cancer stamceller (CSCS) hypotese, at tumorer indeholder kun en lille subpopulation af celler med et potentiale på selv-fornyelse og differentiering. CSCS menes at være ansvarlig for tumor initiering og vedligeholdelse af tumorvækst og celleoverlevelse efter kemoterapi på grund af deres modstand mod konventionelle anticancer behandlinger [1]. Under tidlig tumorudvikling, kan CSCS gennemgå en symmetrisk selvfornyende celledeling i to identiske datterceller CSCS men også generere bulk-populationer af ikke-CSCS ved asymmetrisk celledeling [2]. Størstedelen af ​​celler i bulk-tumorer har begrænset tumorigene og metastatiske potentiale i sammenligning med CSCS. For en mere effektiv behandling af cancer, kan det være nødvendigt at målrette både CSCS og ikke-CSC populationer.

CSCS er tidligere blevet isoleret under anvendelse af CSC-specifikke celleoverflademarkører såsom CD44, CD133, CD24, α2β1 integrin og aldehyd dehydrogenase1. CD133 og CD44 er den mest anvendte celle

– Restaurant overflademarkører til identificering af CSCS. CD133 er et medlem af pentaspan transmembrane glycoproteiner. Det blev først beskrevet på hæmatopoietiske og neurale stam- /progenitorceller og er også en markør for CSCS i mange faste tumorer [3, 4]. CD44 er et allestedsnærværende multi-strukturelle og multi-funktionelle celleoverfladeglykoprotein. Det er involveret i celleadhæsion, migrering og metastase af en række tumorceller og stemness regulering af CSCS [5]. Det er tidligere blevet vist, at en CD44

+ /α2β1

høj /CD133

+ fænotype repræsenterer kandidat prostatacancer tumorigene celler [6]. Derfor CD133

+ /CD44

+ celler kunne være potentielle mål for antitumorterapi i fremtiden.

Konventionel monolag todimensionale (2D) cellekultur studier har haft succes med at forklare adfærd CSCS. På den anden side, in vitro tredimensionale (3D) kræft model efterligner funktionerne i in vivo miljø og derfor giver bedre mulighed for at forstå vigtige cancer stamceller mekanismer og udvikle nye kliniske terapeutiske anvendelser [7]. In vitro CSCS tendens til spontant at danne tredimensionale cellulære aggregater, kaldet sfæroider som repræsenterer differentieringsfaktorer egenskaber CSCS og anvendes til at bidrage til tumor generation, progression og kemoterapi modstand i adskillige undersøgelser. Det er blevet vist, at E-cadherin er den største adhæsionsmolekyle mediering stram celle-celle-interaktion og er blevet korreleret med en kompakt sfæroid dannelse i prostata cancercellelinier [8, 9].

Trabectedin er en marine tetrahydroisoquinolin alkaloid. Trabectedin er blevet isoleret fra Caribien marine sækdyr

Ecteinascidia turbinata

er i øjeblikket fremstilles syntetisk [10]. Trabectedin har en potent cytotoksisk aktivitet mod en række forskellige tumortyper i flere solide tumorer

in vitro

in vivo

. Det er under fase I og II kliniske forsøg i Europa og USA med lovende en anticancer lægemiddel til behandling af en række tumorer [11]. Alligevel anticanceraktivitet og virkningsmekanismen stadig uklar. Det er blevet vist, at trabectedin binder til N2 position guaniner i minor groove i DNA, bøjning DNA mod major groove og interfererer med flere transkriptionsfaktorer og DNA-reparationsmekanismer [11]. Det er også kendt, at trabectedin inducerer DNA-ødelæggelse. Dette ændrer den normale funktion af DNA reparation og transskription processer, hvilket resulterer med en anholdelse af proliferation, differentiering og celledød. [11, 12, 13]. Den anti-proliferative aktivitet af trabectedin er dosisafhængig: ved lave koncentrationer (1-10 ng /ml), trabectedin producerer cellecyklus perturbationer med en nedsat hastighed af S-fase progression og akkumulering af celler i G2 fase. Ved højere koncentrationer (10-100 ng /ml), transkription-uafhængig proces fører til apoptose via aktivere forskellige signaltransduktionsveje involverer mitokondrisk cytochrom c-frigivelse, JNK og caspase- 3-aktivering [14]. De cytostatiske og pro-apoptotiske aktiviteter af trabectedin skyldes aktiveringen af ​​den iboende og /eller ydre apoptotiske veje. Den indre vej er kendetegnet ved mitokondrisk ydre membran permeabilisering og frigivelse af cytochrom-c i cytoplasmaet; en proces reguleret af Bcl-2-familien af ​​proteiner. Tidligere arbejde tyder på, at trabectedin udløser cytochrom c-frigivelse fra mitochondrier, der normalt inhiberes af Bcl-2 overekspression [14].

For nylig nye beviser har vist, at CSCS spiller kritiske roller i udviklingen af ​​lægemiddelresistens, metastase og tilbagevenden. Således er det vigtigt at undersøge og finde nye lægemidler, som selektivt og effektivt vil målrette og dræbe CSCS. Den aktuelle undersøgelse havde til formål at undersøge virkningerne af trabectedin i CD133

+ høj /CD44

+ høje prostata CSCS i 2D og 3D kultur-systemet.

Materialer og metoder

Cell kultur betingelser og reagenser

Menneskelig hormon- og resistente prostatakræft-cellelinier, PC-3 og DU145 blev Damage fra American Type Culture Collection (Manasas, VA, USA) og blev dyrket i RPMI 1640 (

Lonza

,

Basel

,

Schweiz

) dyrkningsmedium indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Gibco, Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK), 1% penicillin og streptomycin ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Celler blev dyrket i 25 cm

2 polystyren kolber (Corning Life Sciences, UK) og vedligeholdes i en inkubator ved 37 ° C i en fugtig atmosfære i den nuværende 5% CO

2. Vækst og morfologi blev kontrolleret mikroskopisk dagligt for at sikre celle sundhed. Celler blev delt passerede, da de havde nået ca. 80% sammenflydning. Celler i Semisammenløbne kolber blev høstet ved anvendelse af 0,05% trypsin (Sigma-Aldrich) og centrifugeret (Nuve NF200; Laboratory og steriliseringsteknologi, Ankara, Tyrkiet) efter tilsætning af RPMI 1640 for trypsin inaktivering. Efter centrifugering blev de resuspenderet i dyrkningsmedium. Trabectedin blev leveret af PharmaMar (Madrid, Spanien) og blev fremstillet som en 2 mM stamopløsning i dimethylsulfoxid (DMSO). DMSO-koncentrationen i assayet oversteg ikke 0,1% og var ikke cytotoksisk for tumorcellerne. Anvendte antistoffer var anti-caspase-3 (1: 100 fortyndet, 3510-100, BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA), anti-caspase-8 (1: 100 fortyndet, 250.576, Abbiotec, USA), anti caspase-9 (1: 100 fortyndet, SantaCruz Biotechnology, USA, sc-17784), anti-p53 (1: 100 fortyndet; 3036R-100, BioVision, Inc.), anti-BCL2 (1: 100 fortyndet, SantaCruz Biotechnology, USA, sc-135.757), anti-E-cadherin (1: 100 fortyndet; Bios, USA, bs-1519R), gede anti-kanin immunoglobulin G-fluorescein (FITC) (1: 100 fortyndet; sc-2012, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) og kylling anti-kanin immunoglobulin Alexa fluor

® 594 (1: 100 fortyndet; Invitrogen, USA, A21442)

Fluorescens-aktiveret cellesortering. (FACS)

før høst, blev cellelinierne dyrket, indtil en 80% konfluens. For FACS (FACSAria, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), blev cellerne løsrevet under anvendelse af ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning (Sigma-Aldrich) og resuspenderet i Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS, Invitrogen, USA). Ca. 5×10

4-celler blev inkuberet med et antistof (fortyndet 1: 100 i FACS vask med 0,5% bovint serumalbumin, 2 mM NaN3 og 5 mM EDTA) i 15 minutter ved 4 ° C. En isotype og koncentration-matchede phycoerythrin (PE) -mærket kontrol antistof (Miltenyi Biotec Ltd., Woking, Surrey, UK) blev anvendt, og prøverne blev mærket med PE-mærket CD133 /1 (klon AC133 /1; Miltenyi Biotec Ltd. ) og FITC-mærket CD44 (klon G44-26, BD Biosciences). Efter 3-5 minutter blev cellerne vasket og derefter resuspenderet. Cellerne blev sorteret som CD 133

høj /CD44

stor befolkning (sortering celler) og ikke-sortering modstykker bruger FACSAria flowcytometer, med post-sortering analyse udført for at bekræfte befolkning renhed. Sorteret cellepopulationer blev dyrket i to forskellige indstillinger, monolag 2D kultur eller 3D flercellede tumor sfæroid.

Cell levedygtighed analyser

cellernes levedygtighed efter behandling blev bestemt ved anvendelse af Muse ™ Count og levedygtighed kit (Muse ™ Cell Analyzer, Millipore, Billerica, MA, USA) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev cellerne podet tredobbelt i 6-brønds plader ved en densitet på 1 x 10

4cells /brønd. Efter 24 timers inkubation blev cellerne eksponeret for stigende koncentrationer af trabectedin (0,1, 1, 10, 100 nM). Derefter blev pladerne inkuberet ved 37

° C i en CO 5%

2 inkubator i 24, 48 og 72 timer. Efter inkubering blev alle celler opsamlet og fortyndet med phosphatbufret saltvand (PBS). 50 pi af cellesuspensionen blev derefter tilsat til 450 pi MUSE Count og levedygtighed reagens (10x fortynding), inkuberet i 5 minutter ved stuetemperatur, og analyseret ved anvendelse af MUSE Cell Analyzer. Data blev præsenteret som proportional levedygtighed (%) ved at sammenligne trabectedin behandlede gruppe med de ubehandlede celler, levedygtigheden af, som antages at være 100%.

Celledød analyser

apoptotiske fordeling celle blev bestemt ved anvendelse af MUSE Annexin V Dead Cell Kit (Merck KGaA) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, efter behandling med trabectedin blev alle celler opsamlet og fortyndet med PBS indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA) som en fortyndingsbuffer til en koncentration på 5×10

5 celler /ml. 100 pi Annexin V /dead reagens og 100 pi af en enkelt cellesuspension blev blandet i et mikrorør og i mørke i 20 minutter ved stuetemperatur. Celler blev derefter analyseret under anvendelse af Muse-celle analysator (Merck Milipore). Den apoptotiske forhold blev bestemt ved identifikationen af ​​fire populationer: (i) nonapoptotic celler, der ikke undergår påviselig apoptose: Annexin V (-) og 7-AAD (-); (Ii) tidlig apoptotiske celler, Annexin V (+) og 7-AAD (-); (Iii) sent apoptotiske celler, Annexin V (+) og 7-AAD (+); (Iv) celler, der er døde gennem nonapoptotic vej: Annexin V (-) og 7-AAD (+). Prøverne blev bestemt ved Muse Cell Analyzer (Merck Millipore).

Cell cyklus analyser

Celle cyklus analyser blev udført under anvendelse af en Muse ™ cellecyklus kit fra Millipore ifølge producentens anvisninger. Kort beskrevet blev celler dyrket i 6-brønds plader behandlet med forskellige koncentrationer af trabectedin (0,1, 1, 10, 100 nM); derefter høstet ved trypsinisering og vasket to gange med PBS. Cellerne blev fikseret med 1 ml 70% kold ethanol ved -20 ° C i 5 timer og behandlet med 200 pi af Muse cellecyklus reagens og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Procentdelen af ​​celler i G0 /G1, S og G2 /M-faser blev derefter beregnet ved hjælp af en Muse-celle analysator (Millipore, USA)

Sphere dannelse og kolonidannelse analyser

klumpformet formation. potentiale CD133

høj /CD44

høj menneskelig prostata CSCS blev evalueret i 3D ikke-klæbende kultur tilstand. Oprindeligt CD133

høj /CD44

høje humane prostata CSCS blev dyrket som et monolag, hvorefter de blev talt, resuspenderet og udpladet med 1×10

4 celler per brønd i en 6-brønds plade precoatede med et tyndt lag af 3% Noble agar (w /v) (Difco Laboratories, Inc .; BD Diagnostic Systems, Detroit MI, USA) i RPMI 1640 indeholdende 10% FBS og inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. Celledyrkningsmedier blev erstattet hver 2-3 dage med frisk medium for at fjerne cellerester og sfæroiderne, der ikke velformede. Efter begyndelsen af ​​den flercellede tumor klumpformet dannelse blev trabectedin tilsat ved forskellige koncentrationer af trabectedin (0,1, 1, 10, 100 nM) og inkuberet i 24, 48 og 72 timer. Antallet og diameteren af ​​kolonier i hver brønd blev fotograferet og talt hver dag under mikroskop (Olympus BX-51, Olympus, Hamburg, Tyskland) og billederne af de repræsentative felter blev taget til fange. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer, og alle forsøg blev udført tre gange.

Immunfluorescensfarvning

Efter behandling med IC

50 dosis af trabectedin blev celler anbragt på lysin overtrukne dækglas, fikseret i 4% paraformaldehyd i 15 min. Efterfølgende blev cellerne permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i 10 minutter ved stuetemperatur, vasket tre gange med PBS, blokeret med PBS indeholdende 5% bovint serumalbumin i 1 time og inkuberet med primære antistoffer mod caspase-3, caspase- 8, caspase-9 p53, bcl-2 og e-cadherin for natten over ved 4 ° C. Derefter blev cellerne behandlet med det sekundære antistof i 1 time ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. De immunofarvede celler blev monteret ved montering medium indeholdende DAPI og blev visualiseret ved et fluorescensmikroskop udstyret med et kamera (Olympus BX-51 og Olympus C-5050 digital test).

Statistisk analyse

eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af envejs variansanalyse efterfulgt af Tukey s eller Dunett post hoc test. p 0,05 blev anset for at indikere en statistisk signifikant forskel

Resultater

Renhed og sortering satser CD 133

høj /CD44

højt sorteret og ikke-ordnet delpopulation

DU145 og PC-3 human prostatacancer-celler blev sorteret til CD133 og CD44 overfladeekspression med FACS (fig 1A og 1B). Resultaterne viste, at satserne for DU-145 CSCS og ikke-CSCS var 3,2 ± 5,4% (Fig 1A) og 96,8 ± 5,4% (Fig 1B), hhv. I PC-3 celler, satser var 3,9 ± 5,4 til sortering celler og 96,1 ± 5,4 for ikke-sortering celler. En post-sortering analyse blev udført for at bestemme renheden af ​​de sorterede cellepopulationer; som viste sig at være . 85%

(A) DU-145 CSCS blev isoleret fra DU-145 human prostata cellelinie. (B) PC-3 CSCS blev isoleret fra DU-145 human prostata cellelinie. CD133

høje /CD44

store populationer præsenteret i P6. CD, klynge af differentiering; FACS, fluorescens-aktiveret celle sortering.

Stigende cytotoksicitet af CD133

høje /CD44

høj prostata CSCS med trabectedin

For at bestemme virkningen af ​​trabectedin på levedygtigheden af humane prostata-epitelceller (RWPE-1), prostatacancerceller (DU-145 og PC-3), prostata CSCS (DU-145 og PC-3 CSCS) og bulk population (DU-145 ikke-CSCS og PC-3 ikke-CSCS) blev udsat for stigende koncentrationer af trabectedin (0,1-100 nM) i 24, 48 og 72 timer, og procentdelen af ​​levedygtige celler i prøverne blev bestemt ved celleviabilitetstest.

trabectedin reduceret celle levedygtighed i DU145 human prostata-cellelinje, DU-145 CSCS og DU-145 ikke-CSCS på en tids- og koncentrationsafhængig måde (figur 2). Efter 24 h behandling, The halvmaksimal inhiberende koncentration (IC

50) værdier af trabectedin viste sig at være 100 nM i DU-145 ikke-CSCS; hvorimod der ikke kunne opnås IC

50 værdi trabectedinkoncentration DU-145 cellelinje og CSCS (Fig 2A). Efter 48 timer behandling, IC

50 værdier af trabectedin viste sig at være 10 nM, 100 nM og 9,2 nM i DU-145-cellelinie, DU-145 CSCS og DU-145 ikke-CSCS (Fig 2B). Efter 72 h behandling, IC

50 værdier af trabectedin viste sig at være 1 nM, 9,3 nM og 1 nM i DU-145-cellelinie, DU-145 CSCS og DU-145 ikke-CSCS (fig 2C) .

Cytotoksicitet blev bestemt ved Muse ™ celle analysator. Resultaterne er udtrykt som middelværdien af ​​3 forskellige eksperimenter (± SD) (p 0,001 sammenlignet med ubehandlet kontrol).

Trabectedin faldt cellelevedygtigheden i PC-3 humane prostata-cellelinje, PC- 3 CSCS og PC-3 ikke-CSCS på en tids- og koncentrationsafhængig måde (figur 2). IC

50 værdi på trabectedin kunne ikke opnås i alle tre gruppe i 24 timer. Efter 48 timer behandling, IC

50 værdier af trabectedin viste sig at være 100 nM i PC-3-cellelinjen og PC-3 ikke-CSCS; hvorimod der ikke kunne opnås IC

50 værdi trabectedinkoncentration PC-3 CSCS (Fig 2B). Efter 72 h behandling, IC

50 værdier af trabectedin fandtes at være 9 nM, 10 nM og 8 nM i PC-3-cellelinjen, PC-3 CSCS og PC-3 ikke-CSCS (fig 2C). Selv trabectedin reduceret levedygtighed CSCS og ikke-CSCS i en koncentrationsafhængig måde, levedygtighed RWPE-1-celler var signifikant højere end prostatacancerceller efter eksponering for trabectedin, hvilket indikerer, at prostatakræft stamceller var mere følsomme over for trabectedin end normal prostata epitel RWPE-1 celler.

trabectedin induceret apoptotisk celledød både CSCS og ikke-CSCS

For at undersøge, om cellerne undergår apoptose, ubehandlet eller trabectedin-behandlet DU-145 cellelinje, DU -145 CSCS, DU-145 ikke-CSCS, PC-3 cellelinie, PC-3 CSCS, PC-3 ikke-CSCS blev udsat for stigende koncentrationer af trabectedin og evalueret af Muse ™ Annexin V og Dead Cell assay (fig 3 ). Annexin V og Dead Cell analyse af celler kan skelne celler i fire grupper, nemlig levedygtige (annexin V (-) og 7-AAD (-), tidlig apoptose annexin V (+) og 7-AAD (-), sen apoptose, annexin V (+) og 7-AAD (+) og nekrotisk Annexin V (-).. og 7-AAD (+) Trabectedin signifikant induceret apoptose i alle grupper i en koncentrationsafhængig måde statistiske analyser viste signifikant forskel mellem trabectedin behandlede celler sammenlignet til kontrol (p 0,001).

(A) DU-145-cellelinie, (B) DU-145 CSCS, (C) DU-145 ikke-CSCS, (D) PC-3-cellelinjen, (E) PC-3 CSCS, (F) PC-3 ikke-CSCS. cellerne blev behandlet med 0,1, 1, 10 og 100 nM trabectedin i 48 h. efter inkubationstiden blev cellerne opsamlet, og phosphatydilserine eksternalisering blev vurderet ved anvendelse Annexin V . protokol som beskriver Baseret på Annexin V reaktivitet og intensiteten af ​​7-AAD fluorescens kan celler klassificeres i fire kategorier:. døde, lever, tidlig apoptose og sen apoptose /dead Trabectedin blev vist at inducere apoptotisk celledød i kræft stamceller primært med stigningen i tidlige apoptose (grøn), celler og den tilsyneladende faldet i procentdelen af ​​levende celler. Trabectedin også signifikant inducerede de samlede apoptotiske celler (gul) i en dosis-afhængig måde. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM af tre forskellige eksperimenter. Statistisk signifikans blev bestemt med envejs variansanalyse efterfulgt af Tukey s eller Dunett post hoc test. p 0,05 blev anset for at indikere en statistisk signifikant forskel

Resultaterne viste, at trabectedins eksponering ved stigende koncentrationer resulterede i højere population af tidlige apoptotiske celler.. Baseret på vores data konkluderer vi, at trabectedin inducerer apoptotisk celledød i alle testede med en markant stigning i begyndelsen af ​​apoptose ved 48 timer grupper. Trabectedin inducerede de totale apoptotiske celler i DU-145-cellelinien (Fig 3A), DU-145 CSCS (Fig 3B), DU-145 ikke-CSCS (fig 3C), PC-3-cellelinje (figur 3D), PC-3 CSCS (fig 3E) og PC-3 ikke-CSCS (fig 3F) på en dosis-afhængig måde.

caspase-3, caspase-8, caspase-9, p53 og bcl-2 modulere flavopiridol-associeret apoptose

Immunfluorescensfarvning for caspase-3, caspase-8, caspase-9, p53 og bcl-2 understøttes vores resultater og gav oplysninger om den involverede apoptotiske vej. I DU-145-cellelinien (Fig 4A), DU-145 CSCS (Fig 4B) og DU-145 ikke-CSCS (Fig 4C) behandlet 10 nM trabectedin resulterede i en signifikant stigning i immunfluorescensfarvning af caspase-3, caspase-8 , caspase-9 og p53. I modsætning hertil blev immunfluorescensfarvning af bcl-2 synligt faldt sammenlignet med kontrollen. Lignende observationer blev registreret i PC-3-cellelinjen, PC-3 CSCS og PC-3 ikke-CSCS: immunfluorescensfarvning af caspase-3, caspase-8, og p53 blev forøget og immunfluorescensfarvning af bcl-2 blev reduceret. Der blev ikke observeret nogen signifikante ændringer i immunfluorescensfarvning af caspase-9.

(A) DU-145, (B) DU-145 CSCS, (C) DU-145 ikke-CSCS. Efter behandling med 10 nM trabectedin; caspase-3, caspase-8, caspase-9, p53 og bcl-2 blev visualiseret under anvendelse FITC-konjugeret sekundært antistof (grøn). Nuklear farvning blev visualiseret under anvendelse af DAPI (blå) farvning. Billeder er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Skalaen bar står for 50 um.

Cell cyklus regulering med højdosis trabectedin behandling

For at vurdere, om Trabectedin-induceret væksthæmning af celler medieres via ændringer i cellecyklus, vi undersøgte effekten af ​​trabectedin på cellecyklusfordeling af døde celle assay kit. Stigning i inkubationstiden resulterede i en forøgelse af mængden af ​​celler i G2 /M i alle grupper; især med høj-dosis (10 og 100 nM) behandlinger.

Efter 48 timer på 0,1 nM trabectedin behandling cellepopulationer i G0 /G1, S og G2 /M-faser var 55,3, 27,6 og 17,1%, henholdsvis i DU-145-cellelinien, og 58,3, 23,1 og 18,6% henholdsvis i DU-145 CSCS. Efter 1 nM trabectedin inkubation procenterne var 54,0, 21,2 og 24,8%, henholdsvis i DU-145 celler; og 50,1, 26,9 og 23,0% henholdsvis i DU-145 CSCS. Inkubering med 10 nM trabectedin resulterede i procentdelene af 35,7, 29,8 og 34,5% henholdsvis i DU-145-cellelinien og 37,0, 32,5 og 30,4% henholdsvis i DU-145 CSCS (Fig 5A og 5B). Når celler blev behandlet med 100 nM trabectedin, de procentdele af de tre klasser af celler var 28,0, 29,5 og 42,5% henholdsvis i DU-145-cellelinien; og 38,1, 21,8 og 40,0% henholdsvis i DU-145 CSCS. I DU-145 ikke-CSCS, cellepopulationer i G0 /G1, S og G2 /M faser var 56,2, 24,4, 19,4% henholdsvis efter 48 timers inkubation med 0,1 nM trabectedin. De procentdele af de tre klasser af celler med 1 nM trabectedin inkubation var 50,1, 19,3, 30,6%; med 10 nM trabectedin og 37,2, 22,9 og 39,9% (figur 5C); med 100 nM trabectedin 25,5, 29,1, 45,4% henholdsvis efter 48 timers inkubation.

(A) DU-145, (B) DU-145 CSCS, (C) DU-145 ikke-CSCS, (D) PC-3, (E) PC-3 ikke-CSCS, (F) PC-3 CSCS. Cellerne blev behandlet med 10 nM trabectedin i 48 timer. Procentdelen af ​​celler i G0 /G1, S og G2 /M-faser blev derefter beregnet under anvendelse af en Muse-celle analysator. Histogrammer fra et repræsentativt forsøg viser effekten af ​​trabectedin på cellecyklus profil. Især trabectedin væsentligt påvirket af cellerne i G2 /M-fasen, især i højdosis behandling. Data, der vises her er fra et repræsentativt forsøg gentaget tre gange med lignende resultater.

Efter 48 timers behandling med 0,1 nM trabectedin, cellepopulationer i G0 /G1, S og G2 /M faser var 57,0 , 24,6 og 18,4% henholdsvis i PC-3-cellelinjen, og 69,4, 12,7 og 17,8% henholdsvis i PC-3 ikke-CSCS. Inkubation med 1 nM trabectedin de procentdele af de tre klasser af celler var 45,8, 25,5 og 28,6%, henholdsvis i PC-3-cellelinje og 48,7, 22,9 og 28,3%, henholdsvis i PC-3 ikke-CSCS. Inkubation med 10 nM trabectedin de procentdele af de tre klasser af celler var 49,5, 17,7 og 32,7% (figur 5D), henholdsvis i PC-3-cellelinje og 35,8, 31,1 og 33,0% (figur 5E), henholdsvis PC 3 ikke-CSCS. Inkubation med 100 nM trabectedin, procenterne var 43,8, 18,9 og 37,3%, henholdsvis i PC-3-cellelinje og 28,0, 26,4 og 45,6% i PC-3 ikke-CSCS. Lignende observationer blev registreret i PC-3 CSCS. Eksponering af disse celler til trabectedin koncentrationer på 0,1, 1, 10 og 100 nM resulterede i 76,4, 62,7, 50,3, 45,8% arrest i G0 /G1-fasen, henholdsvis; og 15,0, 22,0, 27,6, 26,3% arrest (henholdsvis) i S-fasen, og 8,6, 15,3, 20,9, 27,9% arrest (henholdsvis) i G2 /M-fasen (fig 5F). Disse resultater viste, at væksthæmning observeret i alle grupper behandlet med trabectedin hovedsagelig er forbundet med G2 /M-fasen anholdelse.

Sammenligning af klumpformet danner evne CSCS og ikke-CSCS

DU-145 og PC-3 CSCS og ikke-CSCS blev dyrket i 3D ikke-klæbende dyrkningsbetingelser. Klumpformet dannelse blev evalueret under et fasekontrastmikroskop. CD133

høj /CD44

høje menneskelige prostata CSCS (Fig 6A og 6B) var i stand til at danne sfæroider; mens ikke-CSCS mislykkedes (Fig 6C og 6D).

A) DU-145 CSCS, B) PC-3 CSCS, (C) DU-145 ikke-CSCS, (D) PC-3 ikke- CSCS. CD133

høj /CD44

høje menneskelige prostata CSCS var i stand til at danne sfæroider; mens ikke-CSCS mislykkedes.

Hæmning af kugle formation med trabectedin

DU-145 CSCS og PC-3 CSCS dannede tumoroids på dag fem og tre, henholdsvis. De tidlige sfæroider blev inkuberet i 24, 48 og 72 timer, og celler blev behandlet med 0,1, 1, 10 og 100 nM trabectedin. Antallet og diameteren af ​​kolonier i hver brønd blev bestemt hver dag under mikroskopet. Målinger af tumoroid størrelse og tal afslørede en dosisafhængig cytotoksicitet i behandlede tumoroids sammenlignet med ubehandlede kontroller. Trabectedin reduceret antallet og diameteren af ​​sfæroider af DU145 CSCS og PC3 CSCS i en dosis og tid afhængig måde (figur 7 og 8). Med stigende doser af trabectedin, blev øget celledød observeret at ledsage opløsningen af ​​sfæroider af DU145 CSCS og PC3 CSCS.

(A) DU-145 CSCS, (B) PC-3 CSCS. Evne af kugle dannelse af CD133

høj /CD44

høj DU-145 og PC-3CSCs markant undertrykt på en dosis-afhængig måde fra begyndelsen af ​​sfæroiden forfatning. Efter begyndelsen af ​​den flercellede tumor klumpformet dannelse blev trabectedin tilsat ved forskellige koncentrationer af trabectedin (0,1, 1, 10, 100 nM) i 24, 48 og 72 timer. Et signifikant fald blev observeret i diameteren af ​​klumpformet dannelse. Resultaterne er repræsentative for data indsamlet fra mindst tre eksperimenter.

(A) DU-145 CSCS, (B) PC-3 CSCS. Efter begyndelsen af ​​den flercellede tumor klumpformet dannelse blev trabectedin tilsat ved forskellige koncentrationer af trabectedin (0,1, 1, 10, 100 nM) i 24, 48 og 72 timer. Antallet af sfæroider af 15-20 tilfældige felter blev talt og beregnet. Trabectedin reduceret antallet af sfæroider af DU145 CSCS og PC3 CSCS i en dosis og tidsafhængig måde.

E-cadherinekspression faldt i CD133

høje /CD44

høje prostata CSCS med trabectedin

for at undersøge rollen af ​​trabectedin i ekspressionen af ​​E-cadherin-medieret celle-celleadhæsion i DU-145 og PC-3 CSCS dyrket under tredimensionelle betingelser in vitro, undersøgte vi immunfluorescensfarvning af E- cadherin. Vores immunofluorescensassays Resultaterne viste, at efter behandling af DU-145 og PC-3 CSCS med IC

50 doser trabectedin, E-cadherinekspression faldt betydeligt i forhold til kontrol (figur 9).

(A) DU -145 CSCS, (B) PC-3 CSCS. Efter den flercellede tumor klumpformet dannelse blev DU-145 CSCS og PC-3 CSCS sfæroider behandlet med trabectedin. Trabectedin forstyrret E-cadherin-medieret celle-celle interaktioner i flercellede sfæroider af DU-145 og PC-3 CSCS. E-cadherin blev visualiseret under anvendelse Alexa Fluor

® 594 -konjugeret sekundært antistof (rød) Kerner farvet med DAPI (blå). Scale bar: 100 um

Diskussion

Vores undersøgelse er den første til at demonstrere kræft forebyggende virkninger af trabectedin på humane prostata CSCS.. Nylige cancer undersøgelser har afsløret, at et mindretal population af celler i tumorer bulks er ansvarlig for tumor initiering, vækst og modstandsdygtighed over for konventionelle behandlinger. De fleste af kræftlægemidler, der undersøges, samtidig med at dræbe hovedparten af ​​tumorceller, i sidste ende ikke eleminate CSCS, som årsag til tumor tilbagefald og metastaser. Derfor har opmærksomheden været rettet mod at definere nye anticancer lægemiddel til forebyggelse af kræft og terapi ved at fjerne CSCS.

Trabectedin har potentialet til at være en effektiv kemoterapeutisk middel til udvikling af nye behandlingsstrategier, der specifikt retter sig mod prostata CSCS. Vore data antyder kraftigt, at trabectedin hæmmer væksten af ​​prostata CSCS på en dosis-afhængig måde, via cellecyklusstop og apoptose.