PLoS ONE: Anti-tumor effekt i Human Lung Cancer af en kombinationsbehandling af Novel histon-deacetylasehæmmerne: SL142 eller SL325 og Retinoid Acids

Abstrakt

histon deacetylase (HDAC) hæmmere arrestere kræft cellevækst og forårsage apoptose med lav toksicitet og dermed udgør en lovende behandling for kræft. I denne undersøgelse undersøgte vi antitumoraktiviteten i lungecancerceller af det hidtil ukendte cykliske amid-bærende hydroxamsyre baseret HDAC-inhibitorer SL142 og SL325. I A549 og H441 lungecancerceller både SL142 og SL325 induceret mere cellevækstinhiberingen og celledød end hydroxamsyren-baserede HDAC inhibitor suberoylanilid hydroxamsyre (SAHA). Desuden kombinationsbehandlingen hjælp retinoid narkotika ATRA eller

9-cis

RA sammen med SL142 eller SL325 væsentligt induceret mere apoptose og undertrykt kolonidannelse end engangsbrug af enten. Udtrykket af retinoinsyrereceptorerne RARa, RAR, RXRa og RXRβ var uændret med behandlingen. Men en luciferase reporter konstruktion (pGL4. RARE 7x), der indeholder syv tandem gentagelser af retinsyre ansvarlig element (RARE) genereret betydelig transkriptionsaktivitet efter kombinationsbehandling af retinsyrer og SL142 eller SL325 i H441 lunge kræftceller. Desuden blev apoptose-fremmende Bax udtryk og caspase-3 aktivitet steget efter kombinationsbehandlingen. Disse resultater antyder, at kombinationsbehandling af SL142 eller SL325 med retinsyrer har væsentlig antitumoraktivitet og er en lovende terapeutisk kandidat til behandling human lungecancer

Henvisning:. Han S, Fukazawa T, Yamatsuji T, Matsuoka J, Miyachi H, Maeda Y, et al. (2010) Anti-tumor effekt i Human Lung Cancer af en kombinationsbehandling af Novel histon-deacetylasehæmmerne: SL142 eller SL325 og retinoinsyrer. PLoS ONE 5 (11): e13834. doi: 10,1371 /journal.pone.0013834

Redaktør: Rory Edward Morty, University of Giessen Lung Center, Tyskland

Modtaget: 10 juni, 2010; Accepteret: 11 oktober 2010; Udgivet: November 4, 2010

Copyright: © 2010 Han et al. . Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: yde støtte : Ministeriet for uddannelse, videnskab og kultur, Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

histon deacetylase (HDAC) og histonacetyltransferase (HAT) er involveret i co-regulering af kromatin remodeling og den funktionelle regulering af gentranskription [1]. HDACs regulere forskellige former for biologiske processer, herunder proliferation, differentiering og apoptose [2]. Der er flere rapporter om, at ændret HAT eller HDAC aktivitet er forbundet med forskellige kræftformer [3], [4], [5], [6]. En række små molekyler HDAC-inhibitorer er blevet udviklet som anti-cancermidler. Faktisk blev HDAC-inhibitorer vist at inducere standsning af cellens cyklus, differentiering og apoptose i en række forskellige maligne celler. HDAC-inhibitorer øger acetylering af histoner og transkriptionsfaktorer, som kan vende gendæmpning således letter genekspression [7]. Disse virkninger medieres delvist af selektiv ændring i genekspression, såsom induktionen af ​​p21waf ekspression [8]. Men ikke alle gener er opreguleret ved behandling med HDAC-inhibitorer, og forholdet mellem opreguleret til down-regulerede gener har vist sig at være tæt på 01:01 [9].

Lungekræft er den førende dødsårsag på verdensplan [7]. De to vigtigste former for lungekræft er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og småcellet lungecancer (SCLC). Behandlingsresultater til avanceret NSCLC hjælp kemoterapeutiske stoffer har været skuffende. Det er klart, er der et presserende behov for yderligere undersøgelser til behandling af fremskreden NSCLC. Nye behandlinger med nye virkningsmekanismer, herunder midler, der er målrettet angiogenese og regulering af genekspression ved retinsyrer er blevet udforsket [10], [11], [12], [13]. Uden ligand, retinsyrer receptorer fungerer som transkriptionelle repressorer følge af binding af co-repressorkomplekset komplekser, der indeholder histondeacetylaser (HDAC). Ligandbinding frigiver disse co-repressorer og rekrutterer co-aktivator-komplekser, som kunne generere histon acetylase aktivitet [13], [14]. Det er blevet rapporteret, at kombinationerne af all-trans-retinsyre og HDAC-inhibitorer har en anti-tumor effekt [15], [16]. Kombinationen af ​​alle-

trans

retinoinsyre (ATRA) og nogle HDAC-inhibitorer viste en antitumorvirkning i neuroblastom [15], [16]. Kombinationen terapi af retinsyrer med HDAC-inhibitorer kan forbedre effektiviteten og samtidig reducere bivirkninger Formålet med den foreliggende undersøgelse er at udvikle en ny strategi til behandling af lungecancer. Vi har derfor analyseret effekten af ​​at bruge kombinationen af ​​hidtil ukendte, klasse selektiv cyklisk amid-bærende hydroxamsyre baseret HDAC-inhibitorer SL142 eller SL325 [17] kombineret med retinsyrer at teste deres effektivitet til behandling af lungecancer.

Materialer og Methods

Reagenser

SL-142 ((E) -3- (2- (4-pyridin-4-yl) benzyl-1-oxoisoindolin-6-yl) -N- hydroxyacrylamide) og SL-325 ((E) -3- (2- (4-quinolin-3-yl) benzyl-1-oxoisoindolin-6-yl) -N-hydroxy-acrylamid) er hidtil ukendte isoindolinon-hydroxamsyre baseret histon deacetylase (HDAC) inhibitorer afledt fra vores strukturelle studier udvikling af multi-drug skabelon thalidomid for oprettelsen af ​​strukturelt nye lægemidler (fig. 1A) [18], [19].

A. Kemisk struktur af SAHA, SL142 og SL325. B. Påvisning af H4 acetylering ved immunoblot 24 timer efter SAHA, SL142 eller SL325 behandling (0,5 eller 2,0 uM) i H441 lunge kræftceller. β-actin er vist som kontrol. C. Virkning på cellelevedygtigheden induceret af SAHA, SL142 eller SL325. Celler blev udpladet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1 x 10

3 celler /brønd 24 timer før behandling med SAHA, SL142 eller SL325 (0,1 til 10 uM). Cellelevedygtighed blev evalueret ved 96 timer efter behandling fra WST1 assay (Roche, Basel, Schweiz) ifølge fabrikantens protokol. ** Signifikant forskel fra cellen levedygtighed behandlet med 0,1 uM SAHA, SL142 eller SL325 (p 0,01).

cellelinier og dyrkningsbetingelser

Den menneskelige ikke-small celle lungecancerceller A549, H441 og H1299 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i Hams F12 (A549-celler), RPMI 1640 (H1299 celler) med højt glucoseindhold Dulbeccos modificerede Eagle-medium suppleret med 10% varme -inactivated kalvefosterserum. Alle cellelinier blev dyrket i 10% CO

2 ved 37 ° C. Lysaterne af voksent menneske lungevæv blev opnået fra Novas Biologicals (Littleton, CO).

Immunblotanalyse

Celler blev lyseret i iskold lysepuffer [1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCI (pH 8,0), 137 mM NaCl, 10% glycerol (v /v), 2 mM EDTA, 1 mM natriumorthovanadat (v /v) 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid]. Cellelysater blev klaret ved centrifugering (10 minutter ved 15.000 x g ved 4 ° C) og protein blev bestemt under anvendelse af DC-proteinassayet (BioRad, Hercules, CA). Lige store mængder protein blev separeret på en SDS-PAGE-gel. Gelen blev elektroforetisk overført til et Hybond PVDF transfer-membran (Amersham, Arlington Heights, IL). Membranen blev inkuberet med primære og sekundære antistoffer ifølge den Supersignal

R West Pico kemiluminescens protokol (Pierce, Rockford, IL) for at detektere sekundært antistof binding. Antistof specifikt for β-actin-antistof blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO) og antistof specifikt for humant RARa og RXRa blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti RARa, RXRβ og histon H4 acetyl-antistof blev opnået fra Abcam (Cambridge, UK). Antistof specifikt for humant Bax, p21 og p27 blev opnået fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Sekundær peberrodsperoxidasekonjugeret antistoffer blev opnået fra Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA).

Inhibition og måling af caspaseaktivitet

Caspase-3-aktivitet blev bestemt under anvendelse ApoAlert caspase kolorimetrisk assay kits opnået fra Clontech (Mountain View, CA) ifølge producentens protokol. Den fold stigning i aktivitet blev bestemt ved sammenligning af den caspaseaktivitet i behandlede celler med dem i kontrolceller (DMSO). For caspase hæmning blev celler inkuberet med 100 pM zVAD-FMK opnået fra BioVision (Mountain View, CA).

Flowcytometrisk analyse for apoptose

Celler blev udsået i 24-brønds plader på et densitet på 0,5-1,0 × 10

5 celler per brønd 1 dag før behandlingerne. Efter 72 eller 96 timer blev cellerne høstet og vasket en gang med PBS. Celler blev resuspenderet i PBS indeholdende 0,2% Triton X-100 og 1 mg /ml RNase i 5 minutter ved stuetemperatur og derefter farvet med propidiumiodid ved 50 ug /ml for at bestemme sub-G

0 /G

1-DNA indhold under anvendelse af en FACScan. Dubletter, cellerester og fiksering artefakter blev gated ud, og sub-G

0 /G

1 DNA-indholdet blev bestemt ved anvendelse af Cell Quest Ver. 3.3 software.

Klonogen overlevelse

H441-celler blev først udpladet med en tæthed på 2 x 10

5 celler per brønd i seks-brønds plader i 24 timer før behandling. Efter behandling med HDAC-inhibitorer (0,5 um) og /eller retinsyrer (2,5 uM) i 36 timer blev celler frigjort fra skålen ved inkubation med trypsin /EDTA, talt og udpladet i tre eksemplarer med en tæthed på 2 x 10

3-celler i 100 mm skåle i 16 dage. Cellerne blev derefter fikseret med 100% methanol og fik lov til at lufttørre. Cellerne blev farvet med 0,1% krystalviolet. Kolonier (grupper af aggregerede celler nummerering mindst 50) blev derefter talt. Det gennemsnitlige antal af PBS-behandlede celler blev arbitrært sat til 100%, og alle andre tal blev normaliseret i overensstemmelse hermed.

plasmider og transient transfektion reporter assays

dobbeltstrenget DNA indeholdende syv gentagelser af de sjældne sekvens [20], [21] blev syntetiseret og ligeret ind Nhel- og Hindlll-stederne i pGL.4.24 luciferase-reporterkonstruktion (pGL4 RARE 7x,. Promega, Madison, WI). Luciferase reporter konstrukt pGL4 Bax blev genereret ved subkloning promotorregionen af ​​Bax -1570 /+ 68 fra genomisk DNA under anvendelse af PCR-primere: 5′-tttctcgag

XhoIgaagtccaagagatcttcctgacaccctagtctga og 5′- tttaagctt

Hindlll caccgccgctcccgccgccgcctctcgccgggtcc. Det PCR-genererede fragment blev fordøjet med XhoI og HindIII og subklonet direkte ind i pGL.4.24 – luciferase-reporterkonstruktion (Promega). Alle transfektioner blev udført i seks-brønds plader. H441 lung celler blev podet 24 timer før transfektion med en tæthed på 0,3 x 10

6 /brønd. Transfektioner blev udført med Lipofectin (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Californien, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. H441 lung celler blev podet 24 timer før transfektion med en tæthed på 0,3 x 106 /brønd. Transfektioner blev udført med Lipofectin (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Californien, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. 4 timer efter transfektion blev celler behandlet med HDAC-inhibitorer og /eller retinsyrer. 24 timer efter HDAC-inhibitorer og /eller retinsyrer behandling blev cellerne høstet. Resultaterne af et repræsentativt forsøg er vist som gange induktion af relative lysenheder normaliseret til p-galactosidase aktivitet i forhold til den observeret for kontrol- vektorer. Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange. Fejl søjler indikerer standardafvigelsen fra gennemsnittet af de tredobbelte prøver i et eksperiment.

Statistisk analyse

Statistisk signifikante forskelle mellem midler og medianer af undersøgte grupper blev vurderet ved hjælp af t-test eller ikke-parametriske Mann-Whitney U-test. En analyse af varians (ANOVA), hvor det er relevant, blev anvendt til at identificere statistisk signifikans for multiple sammenligninger. Statistisk signifikans blev defineret som p 0,05 (*, #), s. 0,01 (**)

Resultater

Virkninger af SL142 og SL325 på H4 acetylering

Til analysere histondeacetylaseaktivitet af SL142 og SL325, udførtes immunoblotanalyse. Inkubation af H441-celler i 24 timer med SAHA, SL142 og SL325 forårsagede en dosisafhængig stigning i histon H4 acetylering. Både SL142 og SL325 demonstrerede stærkere H4 acetylering end SAHA ved koncentrationer på 0,5 uM og 2,0 uM. SL142 forårsagede en meget større forøgelse af histon H4 acetylering end SL325 ved en koncentration på 2,0 uM (fig. 1B). Disse resultater viser, at både SL142 og SL325 stigning histon H4 acetylering mere end Saha [22] i H441 lungekræft celler.

SL142 og SL325 betydeligt undertrykt cellelevedygtighed i H441 og A549 lunge kræftceller

for at analysere den antitumorvirkningen af ​​HDAC-hæmmere, målte vi cellelevedygtigheden med MTS-assayet efter behandling med SAHA, SL142 og SL325 i H441, A549 og H1299 lungecancerceller. Den celleviabilitetstest afslørede, at alle HDAC-inhibitorer (SAHA, SL142 og SL325) kraftigt undertrykt celle levedygtighed H441, A549 og H1299 lungecancerceller ved en koncentration på 10 uM. I lavere koncentrationer (0,5-5,0 uM), både SL142 og SL325 undertrykt signifikant cellens levedygtighed H441 og A549 lungekræft celler (Fig. 1C). Disse resultater antyder, SL142 og SL325 er mere effektive til at undertrykke cellelevedygtigheden af ​​H441 og A549 lungecancerceller end SAHA og ved lavere koncentrationer.

SL142 og SL325 signifikant forøget caspase-3-aktivitet induceret apoptose i H441 og A549 lunge kræftceller

Vi analyserede caspase-3 aktivitet og apoptose i H441, A549 og H1299 lungekræft celler efter behandling med HDAC-hæmmere. SAHA, SL142 og SL325 øget caspase-3 aktivitet i alle celletyper. Betydeligt, SL142 og SL325 induceret højere caspase-3 aktivitet (2.25- til 2,48 gange) end SAHA (1.42- til 1,66 gange) i H441 og A549 lungekræft celler (Fig. 2A). Næste undersøgte vi apoptose induceret af HDAC-hæmmere i lunge kræftceller. Som vist i fig. 2B, SL142 og SL325 inducerede mere sub-G

0 /G

1 DNA-indhold (51,36-55,81% og 35,07 til 43,80%) end SAHA (10,47-12,12%) i H441 og A549 lungekræft celler efter en 72 timers behandling. Men disse HDAC-inhibitorer inducerede mindre apoptose i H1299 lungecancerceller. Disse resultater antyder, SL142 og SL325 mere effektivt øge caspase-3-aktivitet og inducere mere apoptose i H441 og A549 lungecancerceller end SAHA.

A. Analyse af caspase-3 aktivitet i A549, H441 og H1299 lungekræft celler efter SAHA, SL142 og SL325 behandling. Celler blev behandlet med SAHA, SL142 eller SL325 ved en koncentration på 2,5 uM i 36 timer. blev udført tredobbeltforsøg; data repræsenterer stigningen middelværdi gange ± S.E. Signifikant forskel fra celler behandlet med PBS og celler behandlet med HDAC-inhibitorer er angivet blev vist (* p 0,05, ** 0,01). B. Flowcytometrisk analyse af apoptose induceret af SAHA, SL142 eller SL325. Celler blev inficeret med SAHA, SL142 eller SL325 ved en koncentration på 2,5 uM i 72 timer og sub-G

0 /G

1 DNA-indhold blev målt ved propidiumiodid-farvning og flow-cytometrisk analyse.

ATRA eller

9-cis

RA forbedret caspase-3-aktivitet induceret af SL142 eller SL325 og øget apoptose i H441 pulmonal adenocarcinomceller

for at analysere kombination effekt af retinsyrer med SL142 eller SL325, vi undersøgte caspase-3 aktivitet og sub-G

0 /G

1 DNA-indhold ved hjælp propidiumiodidfarvning med flowcytometri og caspase-3 aktivitet efter en enkelt eller kombinationsbehandling. Som vist i fig. 3A, både ATRA og

9-cis

RA inducerede ingen caspase-3 aktivitet, mens en enkelt behandling af SAHA, SL142 eller SL325 signifikant forøget caspase-3 aktivitet (1.38- til 2,13 gange) i H441 pulmonal adenokarcinomceller . Vigtigere, retinsyre forbedret caspase-3-aktivitet induceret af SAHA, SL142 eller SL325 og kombinationen af ​​ATRA eller

9-cis

RA, og SL142 eller SL325 forøget caspase-3-aktivitet (2.47- til 2,91 gange) mere end ATRA eller

9-cis

RA og SAHA alene (1.90- til 2,04 gange). 100 uM af zVAD-fmk effektivt inhiberede caspase-3-aktivitet i alle eksperimenter. Dernæst undersøgte vi mængden af ​​apoptose induceret af HDAC-inhibitorer i lungecancerceller. Sub-G

0 /G

1 DNA-indholdet blev øget til 5,98% til 8,58% efter en enkelt behandling af retinsyrer eller HDAC-hæmmere. Men kombinationsbehandling af SAHA og ATRA eller

9-cis

RA øget sub-G

0 /G

1 DNA indhold til 22,37% og 23,36% hhv. Desuden SL142 og ATRA eller

9-cis

RA øget sub-G

0 /G

1 DNA indhold til 32,82% og 56,92%, og SL325 og ATRA eller

9-cis

RA forøgede indhold til 26,18% og 49,33% (fig. 3B). Sub-G

0 /G

1 DNA-indhold induceres af enkelt- eller kombinationsbehandling i normal human lunge fibroblast (NHLF) var mindre end H441 celler (data ikke vist). Morfologisk analyse viste, at mere celledød blev induceret efter kombinationsbehandling af SL142 og ATRA eller

9-cis

RA end engangsbrug (fig. 3C). Disse resultater antyder, at ATRA eller

9-cis

RA stigning caspase-3-aktivitet og apoptose induceret af SAHA, SL142 eller SL325.

A. Analyse af caspase-3-aktivitet induceret af ATRA eller

9-cis

RA (2,5 uM) og /eller SAHA, SL142 eller SL325 (0,5 uM) i H441 lungecancerceller. Celler blev behandlet med SAHA, SL142 eller SL325 ved en koncentration på 2,5 uM i 36 timer. Efter 36 timers behandling blev sub-G

0 /G

1 DNA-indhold målt ved propidiumiodid-farvning og flow-cytometrisk analyse. blev udført tredobbeltforsøg; data repræsenterer stigningen middelværdi gange ± S.E. *, Signifikant forskel fra kontrol celler (celler uden behandlinger) (p 0,05). B. Flowcytometrisk analyse af apoptose induceret af ATRA eller

9-cis

RA (2,5 uM) og /eller SAHA, SL142 eller SL325 (0,5 uM) i H441 lungecancerceller. Efter 96 timers behandling blev sub-G

0 /G

1 DNA-indhold målt ved propidiumiodid-farvning og flow-cytometrisk analyse. C. Morfologisk analyse af H441 celler efter ATRA eller

9-cis

RA (2,5 uM) og /eller SL142 (0,5 uM) behandling.

Virkninger af kombinationsbehandling af retinsyrer og SL142 eller SL325 om undertrykkelse af kolonidannelse af H441 lungekræft celler

for at analysere antitumorvirkningen af ​​kombinationsbehandling af ATRA eller

9-cis

RA og SL142 eller SL325, en klonogene assay blev udført. Som vist i fig. 4A og 4B, ATRA eller

9-cis

RA svagt undertrykke koloni dannelse af H441 lungekræft celler (69,1-78,0%), mens SAHA, SL142 eller SL325 stærkere undertrykke kolonidannelse (40,2-69,4%). Betydeligt, ATRA eller

9-cis

RA forbedret anti-tumor effekt af SAHA, SL142 eller SL325 især når de kombineres med SL142 eller SL325 og ATRA eller

9-cis

RA drastisk undertrykt kolonidannelse (2,52-13,22%). Disse resultater antyder, at kombinationsbehandling af SL142 eller SL325 og ATRA eller

9-cis

RA synergistisk inhiberer kolonidannelse af H441 lungecancer-celler.

A. Colony dannelsen af ​​H441 celler behandlet med ATRA eller

9-cis

RA (2,5 uM) eller /og SAHA, SL142 eller SL325 (0,5 uM) i 36 timer. Assayet blev initieret ved udpladning 2 × 10

3 celler pr 100-mm-skåle. Efter 16 dage blev cellerne fikseret og farvet med krystalviolet. Repræsentative billeder af eksperimenter udført i tredobbeltbestemmelse er vist. B. Mean koloni numre blev afledt fra kvantificering af tredobbelte retter for hver behandling og procentdelen-specifikke cytotoksicitet sammenlignet med kolonidannelse i DMSO gruppe (kontrol) blev beregnet. *, P. 0,05 versus enkelte midler

Kombinationen behandling af SL142 eller SL325 og ATRA eller

9-cis

RA synergisk øger transkriptionsaktivitet af RARE, men ændrer ikke udtryk af RAR og RXR

for at analysere transkriptionsaktivitet af retinsyre responsive element (RARE) efter behandlingen af ​​SL142 eller SL325 og ATRA eller

9-cis

RA, genereret vi en luciferase konstruktion drevet af syv tandem gentagelser af RARE element: pGL4. RARE 7x [20], [21]. pGL4. RARE 7x genereret betydelig promotor-aktivitet (5.26- til 17.11 gange) efter administration af 2,5 uM ATRA eller

9-cis

RA behandlinger i H441 lunge kræftceller. Viste imidlertid konstruktionen lidt transkriptionsaktivitet efter 0,5 uM SAHA, SL142 eller SL325 behandling i cellerne (1.26- til 1.43- gange). Vigtigere er det, SL142 og SL325 mere væsentligt forbedret promotoraktiviteten af ​​RARE efter behandling af ATRA eller

9-cis

RA. (29.94- til 37,42 gange, 55.58- til 60,14 gange) sammenlignet med SAHA (14.99- til 24,65 gange) (fig. 5A). Som vist i fig. 5B, immuno-blot-analyse viste, at lille ændring blev set i ekspression af RARa RARp, RXRa og RXRβ udtryk efter enkelt eller kombinationsbehandling i H441 lunge kræftceller.

A. Transient transfektion reporterassays i H441 celler med pGL4. eller pGL4.RARE 7x (2 ug), plus pCMV. β-galactosidase (2 ug) efter retinsyrer (2,5 um) og /eller SL142 eller SL325 (0,5 uM) retinsyrer behandling. Resultaterne præsenteres som gange induktion af relative lysenheder normaliseret til p-galactosidase aktivitet i forhold til den, der blev observeret for kontrol konstruktioner.

#, signifikant forskel fra promotoren aktivitet genereret af pGL4.RARE 7x efter ATRA og SAHA behandling (p 0,05). *, Signifikant forskel fra promotor-aktivitet genereret af pGL4.RARE 7x efter

9-cis

RA og SAHA behandlede celler (p 0,05). B. Immunblotanalyse af RARa, RAR, RXRa og RXRβ udtryk efter retinsyrer og /eller SL142 eller SL325 behandling i H441 lunge kræftceller. Humane lungecancer-celler blev høstet 24 timer efter behandling med ATRA eller

9-cis

RA (2,5 uM) eller /og SAHA, SL142 eller SL325 (0,5 uM). β-actin er vist som kontrol.

Kombinationen behandling med SL142 eller SL325 og ATRA eller

9-cis

RA øger Bax udtryk i H441 lungekræft celler

for at undersøge mekanismen for antitumorvirkningen induceret af kombinationsbehandlingen af ​​ATRA eller

9-cis

RA og SL142 eller SL325, analyserede vi ekspressionen af ​​p21, p27 og Bax i H441 lungecancerceller. Som vist i fig. 6A, blev p21 udtryk steget markant efter SL142 behandling (fig. 6A, bane 7-9). Efter 9-cisRA, SAHA behandling eller kombinationsbehandling med SAHA og retinoider forøget p27-ekspression (fig. 6A, bane 1-6) som rapporteret af andre [16], men ingen signifikant ændring blev set i p27-ekspression efter SL142 eller SL325 behandling eller kombinationsbehandlingen af ​​SL142 eller SL325 og retinoider (fig. 6A, bane 7-12). Vigtigere, blev Bax ekspression øget 24 timer efter SL142 eller SL325 behandling (fig. 6A, bane 7, 10) og ATRA eller

9-cis

RA forøgede ekspression (bane 8, 9, 11,12) i H441 celler. Kombinationen behandling af

9-cis

RA og SL325 også steget Bax udtryk (bane 6). Dernæst analyserede vi Bax promotoraktivitet efter kombinationsbehandlingen ved anvendelse af luciferase konstruktion indeholdende Bax promotorregionen: pGL4. Bax. Som vist i fig. 6B, aktivering af Bax-promotoren forblev (3.58- til 6,07 gange) efter en enkelt behandling af HDAC-inhibitorer eller retinsyrer i H441 lungecancerceller. Vigtigere er det, SAHA forbedret Bax promotor-aktivitet induceret af ATRA eller

9-cis

RA (6.27- til 8,74 gange) og SL142 og SL325 forbedret endnu mere (10.14- til 18,44 gange). Disse resultater antyder, at kombinationsbehandling af SL142 eller SL325 og ATRA eller

9-cis

RA kan forbedre den transkriptionelle aktivitet af Bax-promotoren og inducerer Bax ekspression i H441 lungecancerceller.

A . Immunoblotanalyse af RARa, RAR, RXRa og RXRβ udtryk efter retinsyrer og /eller SL142 eller SL325 behandling i H441 lunge kræftceller. Humane lungecancer-celler blev høstet 24 timer efter behandling med ATRA eller

9-cis

RA (2,5 uM) eller /og SAHA, SL142 eller SL325 (0,5 uM). β-actin er vist som kontrol. B. Forbigående transfektion reporter analyser i H441 celler med pGL4. eller pGL4.Bax (2 ug), plus pCMV. β-galactosidase (2 ug) efter retinsyrer (2,5 um) og /eller SL142 eller SL325 (0,5 uM) retinsyrer behandling. Resultaterne er angivet som fig. 6A. *, Signifikant forskel fra promotor-aktivitet genereret af pGL4.Bax efter ATRA eller

9-cis

RA (2,5 uM) eller SAHA, SL142 eller SL325 (0,5 uM) (p 0,05).

diskussion

Lungekræft er den mest almindelige årsag til kræftrelaterede dødsfald på verdensplan [23]. Behandling af lungekræft med kemoterapi har forlænget overlevelse, men kliniske fordele med disse stoffer er begrænset til patienter i ellers godt helbred, og dem i tidlige stadier. Men alle kemoterapi behandlinger har også uønskede bivirkninger for patienten [24]. For nylig er små molekyler blevet udviklet til behandling af lungecancer hos patienter, der bærer sådanne muterede gener som EGFR og EML4-ALK fusionsgener. Disse små molekyler er designet til at målrette kinase domæner af de muterede gener og hæmme deres aktivitet [25], [26]. Imidlertid er en sådan lille molekyle terapi er ikke egnet til de fleste lungecancer begivenheder, herunder cancer forårsaget af en muteret KRAS-genet [27]. Det er klart, er der et presserende behov for yderligere undersøgelser af nyere, tolererede agenter med nye virkningsmekanismer for at forbedre varigheden og livskvalitet for denne store population af patienter.

selektive hæmmere af human histondeacetylaser (HDAC) er rapporteret at have antitumoraktivitet

in vivo

, og flere af dem er under kliniske forsøg [9], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35], [36]. Den første af disse, har SAHA blevet godkendt til behandling af kutant T-celle lymfom og det er også blevet rapporteret, at SAHA har en anti-tumor effekt mod lungecancerceller [37], [38]. Tidligere har vi udviklet nye amid-bærende hydroxamsyrederivater som klasse-selektive HDAC-hæmmere kaldt SL142 og SL325 (fig. 1A) og rapporterede, at disse små molekyler viser større HDAC1, HDAC4 og HDAC6 hæmmende aktivitet i humane prostata kræftceller LNCaP end SAHA [17]. De halve maksimale inhibitoriske koncentrationer (IC50-værdier) af SL-142 mod HDAC1, HDAC4 og HDAC6 er 69 ± 5 nM, 53 ± 2 nM, og 260 ± 70 nM. De IC50’er af SL-325 mod HDAC1, HDAC4 og HDAC6 er 120 ± 4 nM, 65 ± 4 nM, og 310 ± 50 nM. I modsætning hertil vil IC50’er for klinisk anvendte HDAC inhibitor suberoylanilid hydroxamsyre ZolinzaTM mod HDAC1 og HDAC4 er meget højere ved 290 ± 50 nM, 340 ± 30 nM, og sammenlignes med HDAC6 ved 200 ± 10 nM. Derfor er disse forbindelser udviser mere potente inhiberende aktivitet på HDAC1 og HDAC4 og sammenlignelige HDAC6 inhibitorisk aktivitet sammenlignet med den klinisk anvendte HDAC inhibitor suberoylanilid hydroxamsyre (ZolinzaTM) [18], [19].

I den foreliggende undersøgelse , SL142 og SL325 viste mere signifikant HADC hæmmende aktivitet (HAT aktivitet) i H441 lungekræft celler (fig. 1B) og undertrykt tumorlevedygtighed i H441 og A549 lungekræft celler end SAHA (fig. 1C), hvilket indikerer, at SL142 og SL325 er mere effektive HDAC-hæmmere end SAHA. I vores tidligere rapport, SL142 og SL325 viste signifikant p21 promoter aktivitet og cytostatisk aktivitet i prostata kræftceller LNCaP [17]. Men i denne undersøgelse, disse små molekyler inducerede også signifikant caspase-3-aktivitet og subG

0 /G

1 befolkning i H441 og A549 lungecancerceller. Disse resultater antyder, SL142 og SL325 kunne inducere apoptose i lungekræft.

Retinoinsyrer modulere normal, præmaligne og maligne cellefænotyper af ændringer i genekspression, som er medieret gennem binding til to klasser af nukleare hormonreceptorer, den RAR og RXR’er. ATRA binder RAR med høj affinitet, men binder ikke til RXR, mens

9-cis

RA er en ligand, der binder og transaktiverer både RAR og RXR’er [39], [40]. Retinsyrer regulere differentiering i luftvejene epitel og undertrykke carcinogenese for lungekræft og hoved og halskræft [41], [42], [43]. Vigtigere er det blevet rapporteret, at kombinationsbehandling af HDAC-hæmmere og retinsyrer øget antitumoraktivitet i maligne celler [44], [45], [46], [47]. Endvidere Epping et al. rapporterede, at retinsyrereceptor (RAR) pathway er målrettet efter HDAC inhibitor, og at antitumorvirkningen af ​​HDAC inhibitor i tumorceller er, delvis gennem derepression af retinsyre [48]. I vores undersøgelse kombinationsbehandlingen af ​​SL142 eller SL325 med disse retinsyrer synergistisk øget apoptose og undertrykt kolonidannelse i cellerne (fig. 3A, 3B, 4A og 4B). Desuden transkriptionsaktivitet genereret af RARE efter kombinationsbehandlingen var meget højere end for en enkelt behandling (fig. 5A). RAR er kendt for at danne en heterodimer med RXR og binder til en retinsyre-responsivt element (RARE) [49], [50]. Imidlertid ekspression af disse receptorer blev ikke øget efter behandlingen i H441 lungecancer-celler (fig. 5B) [45], [51]. Både retinsyrer og HDAC-inhibitorer er blevet rapporteret at aktivere cellecyklus eller apoptose gener og inducere celledifferentiering eller apoptose i cancerceller [52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59], [60], [61]. I vores rapport, blev udtryk for p21 klart steget efter SL142 behandling H441 lungekræft celler og endnu vigtigere, blev Bax udtryk steg efter kombinationsbehandling af HDAC-hæmmere og retinoinsyrer. Ekspression af p27 blev ikke ændret efter SL142 eller SL325 og /eller retinoid behandling [16]. Promotoren for p21-genet indeholder et funktionelt RARE [62], og dette er i overensstemmelse med vores resultater (fig. 5A). Imidlertid p21 blev oprindeligt identificeret som et molekyle, der regulerer overgangen fra G1-fasen til S-fasen af ​​cellens cyklus og overekspression af p21 har vist sig at inducere differentiering i forskellige celler snarere end inducere caspase-3-aktivitet og apoptose [63] , [64], [65], [66]. På den anden side overekspression af Bax inducerer caspase-3-aktivitet og apoptose i mange slags celler [67], [68], [69]. I denne undersøgelse kombinationsbehandling af SL325 og retinsyrer signifikant induceret celledød i H441 lungecancerceller. Alligevel kombinationsbehandlingen næppe forøget p21-ekspression (fig. 6A). Som vist i fig. 6A, blev p53-ekspression ikke ændret efter behandlingen og H441 ikke-små lungecancerceller bære muteret p53. Disse resultater antyder, at opregulering af Bax kan have en afgørende rolle for antitumorvirkningen af ​​kombinationsbehandlingen af ​​SL142 eller SL325 og ATRA eller

9-cis

RA i H441 lungecancerceller [54] og Bax var op reguleret i p53 uafhængig vej. Som vist i fig. 6A, blev p53-ekspression ikke ændret efter behandlingen og H441 ikke-små lungecancerceller bære muteret p53. På den anden side, som vist i fig. 1C og fig.