PLoS ONE: Funktionelle genetiske variationer på microRNA Binding-Site i CD44 Gene er forbundet med risiko for kolorektal cancer i kinesiske populationer

abstrakt

CD44 som en af ​​de mest formodede stamcellemarkører spiller en central rolle i mange cellulære processer, herunder cancer cellevækst og migration. Funktionelle enkelt nukleotid polymorfier (SNP) af

CD44

kan modulere dets gen funktioner og dermed kræftrisiko. I den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi, om polymorfier i 3′-utranslaterede region (UTR) af

CD44

er forbundet med øget modtagelighed for kolorektal cancer (CRC) ved at gennemføre en case-kontrol undersøgelse af 946 CRC patienter og 989 cancer-fri kontroller. Tre polymorfier (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /A) i 3′-UTR af

CD44

blev genotype. Vi fandt, at variante genotyper (CT og TT) i rs13347 (justeret odds ratio (OR) = 1,79, 95% konfidensinterval (CI) = 1,50-2,17) steg et individs modtagelighed for CRC, sammenlignet med rs13347CC homozygote genotyper. Vi fandt også, at CRC patienter med CT /TT genotypen havde en 1,6 gange øget risiko for at udvikle avancerede (stadie III + IV) CRC. Desuden viste funktionelle assays, at C til T baseændring ved rs13347C /T forstyrrer bindingssted for den microRNA HSA-mir-509-3p, og derved øge

CD44

transkriptionsaktivitet og ekspressionsniveau. Disse resultater tyder på, at rs13347C /T i microRNA bindingssted kan være potentielle biomarkører for genetisk disposition for CRC

Henvisning:. Wu XM, Yang HG, Zheng BA, Cao HF, Hu ZM, Wu WD (2015) Funktionelle genetiske variationer på microRNA Binding-site i

CD44

Gene er forbundet med risiko for kolorektal cancer i kinesiske populationer. PLoS ONE 10 (5): e0127557. doi: 10,1371 /journal.pone.0127557

Academic Redaktør: Yifeng Zhou, Medical College of Soochow University, KINA

Modtaget: Februar 13, 2015; Accepteret: 16. april, 2015; Udgivet: May 26, 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (nr 2013C33106). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindeligt diagnosticeret mavetarmkanalen verdensplan [1], og dens forekomst og dødelighed har været stærkt stigende i de seneste årtier i Kina [2]. Epidemiologiske undersøgelser har vist, at miljømæssige risikofaktorer samt livsstilsrelaterede faktorer såsom kost, rygning og alkoholindtagelse betragtes som bidragsydere i ætiologien af ​​CRC [3, 4]. Flere og flere undersøgelser har allerede erkendt, at genetiske faktorer væsentligt kan modulere modtagelighed for kolorektal cancer. Især single nucleotide (SNP’er) i gener ændrer dets ekspression eller aktivitet ved at ændre aminosyresekvensen kan prædisponere til CRC tumorgenese [5-7].

Kræft er en klasse af sygdomme karakteriseret ved ukontrolleret cellevækst og dele sig. Som en lille population af celler i en tumor, kan cancer stamceller (CSC) bidrager til de mest aggressive former af sygdommen med kan igangsætte tumorvækst og deres resistens over for lægemidler egenskaber. Akkumulerende undersøgelser har fokuseret på eksistensen af ​​kolorektal cancer stamceller i human kolorektal cancer [8-10]. Derved kan præcis identifikation af tyktarmen CSC og deres egenskaber bidrage væsentligt fremme effektiv kræftbehandling. Formodede kolon CSC populationer kan identificeres ved ekspression af specifikke CSC markører. CD44 er en af ​​de velkendte stamcelle markør for CRC [11].

CD44

gen kodede for et celleoverfladeglycoprotein involveret i mange biologiske processer, herunder lymfocytaktivering, hæmatopoiese, homing og embryonal udvikling [12]. I mellemtiden,

CD44

spiller en uundværlig rolle i tumor cellevækst, differentiering, invasion og motilitet som svar på et cellulært mikromiljø, og dermed forbedre cellulær sammenlægning og bidrage til udvikling og progression af tumorer [13-15]. Nylige undersøgelser har vist den signifikant sammenhæng mellem niveau af

CD44

ekspression og brystcancercelle højere tumorigenicitet og metastatisk potentiale [13, 16], hvorved der fremhæver en vigtig rolle

CD44

i tumorudvikling og metastase. Tilsvarende knockdown af

CD44

med specifikke siRNA (lille interfererende RNA) i humane colon cancerceller kunne dramatisk suppresse vækst og tumorceller progression

in vitro

in vivo

, kraftigt antyder en potent regulator af

CD44

i progressionen af ​​CRC [17, 18]. Desuden har flere undersøgelser også udtalt, at genetiske varianter i

CD44

gen var forbundet med kræft risiko og prognose [19, 20]. 3′-UTR’er (uoversatte regioner) af gener er de vigtigste områder er omfattet af microRNA og har en central rolle rolle i genets mRNA stabilitet og eventuel modulere reguleringen af ​​beslægtede proteiner. SNP’er placeret ved microRNA-bindingssteder kan påvirke bindingsevne microRNA og teoretisk forstyrre ekspressionen af ​​

CD44

og kan således predisposite for sygdommen modtagelighed. Vi hypotesen, at SNPs i

CD44

3′-UTR er forbundet med CRC risiko ved at påvirke genets udtryk.

I den nuværende sygehus-baserede case-kontrol undersøgelse vi genotype tre polymorfier (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /A) i 3′-UTR af

CD44

og analyseret sammenhængen mellem de genetiske variationer og CRC risiko. Efterfølgende funktionelle assays blev yderligere udført for at undersøge betydningen af ​​og biologiske funktioner af disse SNPs.

Materialer og metoder

studiepopulation

Undersøgelsen bestod af 946 Han-kinesisk CRC patienter og 989 etnisk matchede kræft-fri kontrol. I undersøgelsen blev kolorektal cancer patienter eller raske kontrolpersoner, der for nylig havde blodtransfusioner udelukket. De kræftpatienter med histopatologisk bekræftet CRC fortløbende rekrutteret på Zhejiang Provincial Folkets Hospital (Hangzhou). Desuden var ingen alder, scene og histologi begrænsning for kolorektal kræftpatienter, der. I mellemtiden, alle raske personer tilfældigt rekrutteret i undersøgelsen ikke havde nogen dokumenteret historie kræft og køn frekvens-matchede kræft-fri kontrol baseret på deres alder (± 5 år). De blev også tilfældigt rekrutteret fra en 3500 individuelle ernæringsmæssige undersøgelse foretaget i Zhejiang-provinsen i næsten samme periode, hvor kræftpatienters blodprøver blev opsamlet, med en svarprocent på 90%. Tumoren, node, metastase (TNM) klassifikation og tumor iscenesættelse blev vurderet i henhold til den amerikanske Blandede 2002 om kræft iscenesættelse system. Informeret samtykke blev underskrevet af hver deltager til analyse af molekylære korrelater, og hver deltager var planlagt til et interview med udvalgte oplysninger såsom røg status, alkoholforbrug, slægtshistorie og andre potentielle forstyrrende faktorer. Fordelingerne af udvalgte kliniske funktioner i case-kontrol status er sammenfattet i tabel 1. 5 ml blodprøver blev opsamlet ved tilmelding til hvert af fagene. Denne undersøgelse blev godkendt af medicinsk etik udvalg Zhejiang Provincial People Hospital.

Genotypning analyse

Genomisk DNA blev ekstraheret fra hver blodprøve opnået fra alle deltagere ved hjælp af en Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) og opbevaret ved -80 ° C. Tre polymorfier (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /A) i 3′-UTR af

CD44

blev udvalgt og genotypet af allelspecifik MALDI-TOF massespektrometri analyse som tidligere beskrevet [21]. Primere par og multiplex reaktioner blev designet af reals NP.com Website. Ca. 10% MALDI-TOF massespektrometri analyserede prøver blev tilfældigt udvalgt til en blindet gentagelse. Til kontrolformål kvalitet, blev 50 prøver analyseres igen ved direkte sekventering og resultaterne var i 100% overensstemmelse.

Konstruktion af luciferase journalister

Genotypning efter

CD44

SNPs viste, at rs13347C /T var signifikant forbundet med CRC risiko. På baggrund af bioinformatik analyse (SNPinfo webserver: https://snpinfo.niehs.nih.gov/), den rs13347C til rs13347T overgangen fået en ny binding af microRNA HSA-mir-509-3p. Derfor vi antaget, at SNP rs13347C /T på microRNA-bindende sites kan påvirke bindingen evne HSA-mir-509-3p, og dermed havde nogen effekt på

CD44

udtryk. For at teste denne hypotese 358bp 3′-UTR fragment af det humane

CD44

gen flankerer rs13347C eller rs13347T allel blev syntetiseret ved den Genewiz Company (Suzhou, Kina), og blev derefter klonet ind i psiCHECK2 Basic Vector (Promega, Madison, WI, USA) med renilla og ildflueluciferase gensekvenser (figur 1A). De to konstruktioner (psiCHECK2-

CD44

-rs13347C og psiCHECK2-

CD44

-rs13347T) blev sekventeret for at bekræfte allel og integritet hver indsats.

(A) Repræsentant graf af luciferaseaktivitet af variant allel på luciferase reportergener bærer 358bp af 3′-UTR fragment af det humane

CD44

gen flankerer rs13347C /T-polymorfi. Relativ luciferaseaktivitet af psiCHECK2-

CD44

-rs13347C og psiCHECK2-

CD44

-rs13347T konstruktioner cotransficeret med eller uden 40pmol HSA-mir-509-3p eller 40pmol HSA-mir-509-3p inhibitor, henholdsvis udføres i SW260-celler (B) og SW116-celler (C). Seks gentagelser blev udført for hver gruppe, og eksperimentet blev gentaget mindst tre gange. Asterisk angiver en signifikant ændring (

P

0,05). Data er gennemsnit ± SEM. (D)

CD44

udtryk niveau i 37 CRC væv fra personer med forskellig rs13347C /T genotyper (15 rs13347CC, 16 rs13347CT og 6 rs13347TT);

CD44

udtryk var normaliseret til

GAPDH

gen og præsenteres som gennemsnit ± SEM. De viste data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. (E) Ekspressionsniveauet af HSA-MIR-509-3p i 37 CRC væv grupperet efter rs13347C /T genotyper. HSA-MIR-509-3p mRNA-ekspression blev beregnet i forhold til ekspression af

U6

mRNA ved beregning af de relative ekspressionsniveauer. Dataene er gennemsnit ± SEM,

P

= 0,579. Forskellene i ekspressionsniveauerne blev analyseret med envejs ANOVA test.

Forbigående transfektioner og luciferaseassays

To humane kolorektal cellelinjer SW116 og SW620 blev opretholdt i L-15 medium (Gibco, Los Angeles, Californien, USA) med 10% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich, MO) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. 1 × 10

5 celler per brønd blev podet i 24-brønds plader (BD Bio videnskaber, Bedford, MA, USA) før transfektion. Efter 24, blev cellerne derefter kortvarigt transficeret som beskrevet tidligere [22, 23] med 1.5μg reporter plasmider (rs13347C eller rs13347T allel) med eller uden 40pmol har-mir-509-3p efterligner eller 40pmol inhibitorer af Lipofectamine 2000 ifølge protokollen (Invitrogen, Carlsbad, CA). For luciferaseassays blev celler høstet efter transfektion i 24 timer, og renilla luciferaseaktiviteten blev kvantificeret med Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI).

Real-time PCR

RNA’er fra 37 CRC væv med forskellige rs13347C /T genotyper blev ekstraheret og revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af oligo-dT primer. Allel diskrimination af rs13347 polymorfismer af

CD44

genet blev udført med ABI Prism 7500 Sequence Detection system til at evaluere

CD44

GAPDH

mRNA-niveauer baseret på SYBR-Green metode. Al l kvantificeringer blev udført med

GAPDH

som den interne standard. Endvidere blev TaqMan miRNA tests (Applied Biosystems) anvendes til at detektere baggrunden ekspression af har-mir-509-3p i CRC væv ifølge producenternes protokol. Angivelse af universelt udtrykte

U6

lille nukleare RNA blev også brugt til en intern kontrol. Den relative kvantificering af

CD44

udtryk blev analyseret af 2

-ΔΔCT metode. Hvert assay blev udført tre gange.

Statistisk analyse

To-sidede chi-square tests blev anvendt til at sammenligne forskelle i fordelingerne af klinisk-patologiske træk mellem de tilfælde og kræft-fri kontrol. For case-kontrol undersøgelse blev Hardy-Weinberg ligevægt (HWE) testet for at sammenligne de forventede genotypefrekvenser med observerede genotypefrekvenser i kontrol af en goodness-of-fit chi-square test. Korrelationen mellem genetiske varianter og kliniske parametre blev undersøgt under anvendelse af Chi square test efter behov. De odds ratio (OR) og 95% konfidensintervaller (CIS) blev anslået til at vurdere sammenhængen mellem rs13347C /T polymorfi og CRC risiko ved brug en ubetinget logistiske regressionsmodeller. Stratificeret analyse blev også udført for at vurdere den mulige interaktion mellem

CD44

polymorfier og udvalgte variable på CRC risiko. Statistiske sammenligninger af mere end to grupper blev evalueret ved envejs ANOVA tests. Den statistiske styrke blev beregnet ved hjælp af PS Software (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSample-Size). De statistiske analyser blev udført ved anvendelse af STATA software (version 10; STATA Corporation). Foreningen blev betragtet som signifikant, når

P

-værdi var mindre end 0,05.

Resultater

genotyper og risikoen for CRC

I alt 946 CRC sager og 989 raske kontrolpersoner blev rekrutteret i vores analyse og genotype for at vurdere sammenhængen mellem

CD44

rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /A og CRC risiko. Genotypen fordelinger af de tre polymorfier mellem cases og kontroller er sammenfattet i tabel 2. De observerede genotypefrekvenser af disse SNPs undersøgt hos raske kontroller viste sig at være i overensstemmelse med HWE. Genotypebestemmelse resultater viste, at kun rs13347 statistisk signifikant associeret med CRC risiko, blev ingen signifikante associationer bemærket i andre SNPs. Patienter med

CD44

polymorfi rs13347TT genotyper var forbundet med øget risiko for kolorektal cancer mellem cases og kontroller. Desuden bærer med den kombinerede variant genotype CT /TT udviste en signifikant højere risiko for CRC (OR = 1,79, 95% (CI) = 1,50-2,17),

P

10

-4) sammenlignet med genotypen CC.

Vi yderligere udført stratificeret analyse for rs13347C /T af kliniske eller patologiske karakteristika såsom alder, køn, rygning status, alkoholforbrug og familie historie af kræft. Som det fremgår af tabel 3, var der en signifikant interaktion mellem polymorfismen rs13347C /T og tumor fase. Vi observerede, at sammenlignet med den rs13347CC genotypen, patienter med CT /TT genotypen havde over 1,6 gange øget risiko for at udvikle avancerede (stadie III + IV) CRC (

P

= 0,004). Dog blev der ikke fundet forskelle i andre undergrupper.

Effekt af SNP rs13347C /T på reportergen aktivitet

To luciferasereporteren konstruktioner indeholdende rs13347C eller rs13347T allel forbigående blev cotransficeret med efterligner eller inhibitor af HSA-mir-509-3p der blev bygger binding til rs13347C /T polymorfe site af bioinformatik analyse for at undersøge virkningen af ​​SNP rs13347C /T på

CD44

3′-UTR transkription aktivitet. Som vist i figur 1B og 1C, de microRNA HSA-mir-509-3p efterligner transfekterede CRC celler i væsentlig grad kan formindske luciferaseaktiviteten af ​​reportergen med rs2735383C allel sammenlignet med rs2735383T allel (

P

= 0,007 for SW620 og

P

= 0,02 for SW116). I modsætning hertil aktiviteten af ​​reportergenet med rs13347C allel trended at vende efter transient transfektion af celler med HSA-mir-509-3p mimic og dens tilsvarende inhibitor. Imidlertid blev ingen eventuelle væsentlige virkninger på reportergener med rs2735383T allel med behandling af HSA-mir-509-3p efterligner og hæmmer observeret. Disse resultater viste, at C til T baseændring af rs13347C /T forstyrrer bindingsstedet for HSA-mir-509-3p, Derved øgede transkriptionelle aktivitet af

CD44

gen.

Association mellem rs13347C /T genotyper og

CD44

udtryk

Vi udførte realtids-PCR til at evaluere effekten af ​​rs13347C /T på

CD44

udtryk ved hjælp 37 tumorvæv fra ubehandlet CRC patienter med forskellige genotyper. Som illustreret i fig 1D, afslørede resultaterne, at patienter med rs13347T genotyper (CT- og TT) rummede et signifikant højere

CD44

mRNA-niveauer (gennemsnit ± standardfejl på middelværdien (SEM): 0,565 ± 0,057), sammenlignet med bærere af rs13347CC genotyper (gennemsnit ± SEM: 0,305 ± 0,050; ANOVA test:

P

= 0,003). Og vi derefter analyseret sammenhængen mellem HSA-mir-509-3p udtryk og

CD44

rs13347C /T genotyper. HSA-mir-509-3p udtrykkes konstitutivt i de 37 tumorvæv fra ubehandlede CRC patienter med forskellige genotyper; men der var ingen signifikant sammenhæng mellem baggrunden udtryk for HSA-mir-509-3p og

CD44

rs13347C /T genotyper (0,037 ± 0,008 for CC, 0,027 ± 0,005 for CT og 0,029 ± 0,011 for TT ; ANOVA test:.

P

= 0,579) (fig 1E)

diskussion

i denne nuværende molekylær epidemiologisk undersøgelse, undersøgte vi sammenslutninger af tre SNP’er i 3 ‘ -UTR af

CD44

gen med risiko for kolorektal cancer i kinesiske befolkning og fandt, at rs13347C /T signifikant var forbundet med en øget risiko for CRC. Vi observerede også en signifikant forhøjet risiko for CRC tumor fase er forbundet med rs13347T variant i en allel-dosis måde. Yderligere funktionelle eksperimenter viste, at rs13347T variant væsentligt kan ændre HSA-mir-509-3p-medieret

CD44

transkriptionsaktivitet og udtryk aktivitet. Resultaterne indikerer, at varianter i

CD44

gen kan være værdifulde for risikovurdering, diagnostik og genetisk epidemiologisk analyse af CRC.

CD44

gen ligger til kromosomale locus 11p13 og koder for et bredt udtrykt celleoverflade transmembrane glycoprotein i en række celletyper. Proteinet omfatter hovedsagelig med N-terminalen (resterne 38-46) og C-terminale del af det ekstracellulære domæne (resterne 150-162), som vides at være nødvendige for binding en forskelligartet repertoire af ligander såsom hyaluronsyre (HA), osteopontin og matrixmetalloproteinase [24]. Der er flere linjer af eksperimentel dokumentation for en rolle for

CD44

involveret i en bred vifte af cellulære processer, herunder lymfocytaktivering, apoptose, hæmatopoiese, recirkulation og målsøgende [25-27].

CD44

har en veldokumenteret tumor-fremmende aktivitet, der omfatter fremme tumorcellevækst, differentiering og metastase [28]. Mange molekylærbiologiske undersøgelser har identificeret at

CD44

ekspression er tæt forbundet med de forskellige maligniteter forekomst, progression og prognose [29-32]. Unexceptionally,

CD44

viste sig også at spille en vigtig rolle i CRC udvikling. En nylig undersøgelse baseret på 234 CRC patienter har vist, at den øgede

CD44

ekspression i CRC er korreleret med metastase, øget tidlig tumor tilbagefald og kemoresistens [33]. Seneste eksperimentelle beviser fra både

in vitro

klonogene og

in vivo

tumorigen assay viste, at CD44 (+) CRC celler vist egenskaberne for kræft stamceller [18], hvilket indikerer en funktionel betydning

CD44

i CRC initiering og udvikling. Konsekvent, har vi etableret genetisk sammenhæng mellem ekspressionen af ​​

CD44

og risikoen for CRC. Derudover viste funktionelle analyser, at

CD44

rs13347C /T SNP kan påvirke

CD44

udtryk ved at ændre HSA-mir-509-3p binding til 3′-UTR af

CD44

gen. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at HSA-mir-509-3p kan spille en vigtig rolle som et tumorsuppressorgen under dannelsen cancer [34, 35]. Og ikke signifikant sammenhæng mellem baggrunden ekspression af HSA-mir-509-3p og

CD44

rs13347C /T genotyper iagttoges i undersøgelsen, hvilket indikerer, at nogle ikke-genkendte mekanismer modulere effekten af ​​HSA-mir-509- 3p om rs13347T genotyper kan eksistere. Vores Resultatet viste, at C til T baseændring af rs13347C /T muligvis forstyrrer bindingsstedet for HSA-mir-509-3p, forøger den transkriptionelle aktivitet af

CD44

gen og var således mere modtagelige for CRC.

i den foreliggende undersøgelse, vi først vist, at

CD44

rs13347C /T variation bidrager til en øget risiko for CRC. Den aktuelle undersøgelse er baseret på en relativt stor, tilfældig, etnisk homogen prøve, hvilket betyder at det er muligt at undgå confounding bias. Notatet blev statistisk styrke forøges til at være 0,91 (tosidet test, α = 0,05) til at opdage en OR N for rs13347CT + TT genotyper (forekommer med en frekvens på 41,56% blandt kontrollerne) sammenlignet med rs13347CC genotypen . Hertil kommer, at foreningen er biologisk plausibelt, hvilket tyder dette fund er bemærkelsesværdigt.

Som konklusion, dette er den første rapport for at finde sammenhæng mellem polymorfi rs13347C /T placeret i HSA-mir-509-3p bindingssted, som kan påvirke

CD44

mRNA-ekspression niveau og risikoen for CRC. Derudover vores undersøgelse viste, at sammenlignet med den CD44 rs13347CC genotype, variant genotyper (CT + TT) giver en øget risiko for CRC populationer. Derudover er risikoen virkningen af ​​denne polymorfi er mere indlysende i tumor stadium (III + IV) i CRC patienter. Større, fortrinsvist er nødvendige for at bekræfte sammenhængen mellem case-control studier populationsbaserede

CD44

polymorfier med forskellige menneskelige maligniteter i forskellige etniske grupper.

Tak

Denne undersøgelse var støttet af Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (nr 2013C33106).