PLoS ONE: Den PNPLA3 rs738409 148m /M Genotype er en risikofaktor for leverkræft i Alcoholic Skrumpelever men viser ingen eller svag sammenhæng i Hepatitis C Skrumpelever

Abstrakt

Baggrund

En isoleucin methionin mutation ved position 148 i PNPLA3 genet (p.I148M, rs738409) er for nylig blevet identificeret som en modtagelighed faktor for leverskader i steatohepatitis. Her studerede vi, om

PNPLA3

rs738409 polymorfi påvirker også disposition til hepatocellulært carcinom (HCC).

Metoder

Vi sammenlignede fordelinger af

PNPLA3

genotyper i 80 og 81 kaukasiske patienter med alkoholisk og hepatitis C-virus (HCV) associeret HCC til 80 og 81 alders- og køn-matchede patienter med alkoholrelaterede og HCV-relateret cirrose uden HCC hhv.

PNPLA3

genotyper i 190 raske personer fra samme population tjente som reference. Potentielle confoundere fedme, diabetes, HCV genotype og HBV co-infektion blev kontrolleret af univariate og multivariat logistisk regression med fremad variabel udvælgelse.

Resultater

PNPLA3

genotyper var i Hardy -Weinberg ligevægt for alle studiegrupper. Frekvensen af ​​148 allelen var signifikant (p 0,001) steg i alkoholisk cirrose med (53,7%) og uden HCC (36,2%), men var ikke forskellig mellem raske kontroller (22,9%) og patienter med cirrose (25,3%; p = 0,545) og HCC (30,2%; p = 0,071) som følge af hepatitis C. HCC risiko var højest i 148m /M homozygote patienter med alkoholisk leversygdom (odds ratio (OR) 16,8 versus raske kontroller; 95% konfidensinterval (CI) 6,68 -42,43, s 0,001). Endelig multivariate regression bekræftede 148m /M homozygositet (OR 2,8; 95%-CI: 1,24-6,42; p = 0,013) som HCC risikofaktor i alkoholisk skrumpelever. I HCV-relateret cirrose kun HCV genotype 1 blev bekræftet som en HCC risikofaktor (OR 4,2; 95%-CI: 1,50-11,52; p = 0,006).

Konklusion

PNPLA3

148 variant er en fremtrædende risikofaktor for HCC hos patienter med alkoholisk cirrhose mens dens virkninger er ubetydelige i patienter med skrumpelever på grund af HCV. Denne polymorfi giver et nyttigt redskab til at identificere personer med særlig høj HCC risiko hos patienter med alkoholisk leversygdom, der bør tages i betragtning i fremtidige undersøgelser forebyggelse HCC

Henvisning:. Nischalke HD, Berger C, Luda C, Berg T, Müller T, Grünhage F, et al. (2011)

PNPLA3

rs738409 148m /M Genotype er en risikofaktor for leverkræft i Alcoholic Skrumpelever men viser ingen eller svag sammenhæng i hepatitis C skrumpelever. PLoS ONE 6 (11): e27087. doi: 10,1371 /journal.pone.0027087

Redaktør: Yujin Hoshida, Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology og Harvard University, USA

Modtaget: 26 juli, 2011; Accepteret: 10. oktober 2011; Udgivet: November 7, 2011

Copyright: © 2011 Nischalke et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Deutsche Krebshilfe (tilskud 107.865 til HDN og USA, https://www.krebshilfe.de/english.html) og SFB tr57 TP01 TP12 af Deutsche Forschungsgemeinschaft (https://www.dfg.de/en/index.jsp) til FL, JN og USA. CK blev støttet af en bevilling af BMBF netværk “Susceptbility og Modstand mod Hepatitis C” til USA og JN (tilskud 01KI0792, https://www.bmbf.de/en/index.php). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er en førende årsag til kræft dødsfald på verdensplan [1], [2]. HCC skyldes primært kronisk viral hepatitis B og C i udviklingslande [3], mens ca. 45% af HCCs i Europa og Nordamerika er forårsaget af øget alkoholforbrug [4].

Stor interesse er kommet fra en genom-dækkende forening undersøgelse, der identificerede en enkeltnukleotidpolymorfi (rs738409C /G) i

PNPLA3

gen på kromosom 22, der koder for et isoleucin → methionin substitution (p.I148M) af patatin-lignende phospholipase A3, også betegnes adiponutrin som risikofaktor for steatohepatitis og skrumpelever i alkoholiske og ikke-alkoholiske fedtlever sygdom [5], [6]. Adiponutrin er et transmembrant protein udtrykt i humant fedtvæv og lever. Selv om dens præcise in vivo funktion er stadig ukendt, aktuelle data indikerer en central rolle i lipid homeostase. Adiponutrin ekspression nedreguleres under faste og induceres under high kalorieindtag fordi genaktivitet opreguleres som respons på glucose, insulin og thyroidhormoner. Således adiponutrin er en vigtig regulator af hepatisk lipidmetabolisme under ernæringsmæssige overskydende [6], [7]. Imidlertid var dette genetisk variant ikke korreleret til BMI, visceral eller subkutan fedtindhold insulinfølsomhed eller perifere blod lipid-niveauer [8], [9]. Desuden korreleret omvendt med halspulsåren intima tykkelse, hvilket tyder på, at I148M polymorfi selektivt påvirker fedtaflejring i leveren, men er ikke knyttet til en generel stofskiftesygdom [6], [10], [11]. Imidlertid blev 148 variant korreleret med hævede serum alanin-aminotransferase [12], [13], [14] forhøjet hepatisk fedtindhold og en større procentdel af fibrose i alkoholiske og ikke-alkoholiske fedtlever sygdom [15], [16]. Her studerede vi hvis adiponutrin 148 allelen haft nogen effekt på risikoen for HCC udvikling blandt cirrosepatienter med alkoholisk leversygdom sammenlignet med kronisk hepatitis C, en alternativ stærk risikofaktor for HCC.

Materialer og metoder

Etik Statement

de rapporterede studier blev godkendt af Institutional Review Boards i Bonn og Berlin University etiske komitéer. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra patienterne før prøvetagning. Prøverne blev kodet og lagret anonymt.

Studiegrupper

Vi rekrutterede 161 patienter med hepatocellulært carcinom (HCC) på Bonn og Berlin University departementerne Gastroenterology mellem 2005 og 2009. I 80 patienter HCC var relateret til alkoholisk skrumpelever og i 81 patienter til kronisk hepatitis C. Disse HCC patienter blev sammenlignet med 80 og 81 køn og alder (± 3 år) -matched patienter med alkoholisk cirrose og HCV-associeret skrumpelever, der ikke havde leverkræft. Cirrosepatienter uden leverkræft havde mindst et års opfølgning for at sikre mod muligheden for okkult malignitet. 190 raske frivillige fra samme baggrund befolkningen tjente som reference. Patienter blev anset for at have alkoholisk skrumpelever, hvis deres historie angivne gennemsnitlige alkoholforbrug at overstige 300 g ethanol pr uge. Patienter med blandet HCV-infektion og øget alkoholforbrug ( 300 g /uge) var blevet udelukket fra denne undersøgelse. Fordelingen af ​​HCV-genotyper var 90,0% genotype 1, 1,3% genotype 2, 7,5% genotype 3, 1,3% genotype 4 i patienter med leverkræft og 61,7% genotype 1, 22,2% genotype 2, 8,6% genotype 3, 7,4% genotype 4 i HCV-inficerede cirrosepatienter uden HCC. Alle emner i dette studie var kaukasiere. Yderligere demografiske og kliniske karakteristika er anført i tabel 1.

Alle patienter gennemgik omhyggelig klinisk undersøgelse, standard laboratorieforsøg og abdominal ultralyd. Kronisk viral hepatitis blev diagnosticeret ved rutinemæssig testning for hepatitis B-overfladeantigen, HBV-DNA, HCV-RNA og HCV-antistoffer, henholdsvis. Serum niveauer af ferritin, transferrin mætning, hvis det er nødvendigt HFE gentest samt kvantitative immunglobuliner og autoantistoffer blev bestemt til at udelukke andre ætiologier af leversygdom. Skrumpelever blev diagnosticeret enten ved leverbiopsi, forbigående elastografi (stivhed 15 kPa), og tegn på portal hypertension (splenomegali, øsofagusvaricer, ascites). Diagnosen HCC blev lavet derimod forbedret magnetisk resonans og computertomografi ifølge nyligt etablerede diagnostiske kriterier [EASL 2009 und AASLD 2010 retningslinjer].

Bestemmelse af rs738409 p.I148M alleler

Genomisk DNA blev ekstraheret fra 200 pi EDTA-blod ved hjælp af QIAamp Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens protokol. Bestemmelse af

PNPLA3

rs738409 polymorfi blev udført af LightCycler real time PCR (Roche, Mannheim, Tyskland) ved hjælp af en kommerciel LightSNiP (SimpleProbe) assay fra TIB-MolBiol (Berlin, Tyskland) i henhold til producentens anbefalinger.

Statistisk analyse

genotypefrekvenser blev bestemt og testet for sammenhæng med Hardy-Weinberg ligevægt bruger en eksakt test. Allel og genotypefrekvenser blev sammenlignet mellem cases og kontroller af Pearson godhed-of-fit chi

2 test og Armitage trend test, henholdsvis (https://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1. pl). Forskelle mellem grupper blev analyseret ved t-test og Mann-Whitney-U-test efter behov.

Power beregninger blev udført ved hjælp af Lenth, RV (2006-9) Java Applets for Power og Sample Size [Computer software], hentet 25 august 2011 fra https://www.stat.uiowa.edu/~rlenth/Power. Power beregning var målrettet for at sikre 80% statistisk styrke på 5% alfa-fejl.

For at tage hensyn til yderligere potentielle confounding risikofaktorer for leverkræft virkningerne af HCV-genotype, HBV-infektion, diabetes og fedme blev vurderet af univariate sammenligninger (ANOVA og chi

2-statistik) efterfulgt af multivariat logistisk regression med fremad variabel valg. Denne analyse blev udført separat i patienter med alkohol- og HCV-relaterede leversygdomme. Parametre med effekter på p 0,1 blev indgået den multivariate analyse med P 0,05 for inklusion og p 0,1 til udelukkelse som udvælgelseskriterium for parametre i den endelige statistiske modeller

Statistisk analyse blev udført med SPSS 18.0 (. SPSS, München, Tyskland). Data er rapporteret som middelværdi ± standardafvigelse, medmindre andet er angivet.

Resultater

studiepopulation

Fedme og diabetes forekom hyppigere hos alkoholisk skrumpelever uden HCC end i alkoholiske patienter med HCC (tabel 1; p 0,05). Betydeligt højere GGT værdier, hvis observeret i de to grupper med alkoholisk leversygdom end hos patienter med HCV-infektion (p 0,001).

PNPLA3 (r

s738409) genpolymorfisme og leverkræft

de fordelinger af

PNPLA3

p.I148M alleler var i overensstemmelse med Hardy Weinberg ligevægt i alle studiegrupper (tabel 2). Notatet fordelingen af ​​

PNPLA3

I148M alleler var ens hos raske kontroller og patienter med HCV-associeret skrumpelever og HCV-relateret HCC giver anledning til 22,9%, 25,3% (p = 0,545) og 30,2% (p = 0,071) frekvenser af 148 allelen hhv. I modsætning hertil forekomsten af ​​patienter bærer en

PNPLA3

148 variant blev øget betydeligt i de to grupper med alkoholisk leversygdom og nåede allelfrekvenserne på 53,7% (p 0,001 versus raske kontrolpersoner) og 36,2% (p = 0,033 versus raske kontroller) hos patienter med og uden hepatocellulært carcinom, henholdsvis (figur 1).

Denne figur illustrerer frekvenserne af 148I (grå del af kolonner) og 148m (mørke del af kolonner) alleler af

PNPLA3 Hotel (rs738409) polymorfi hos patienter med HCV-associeret og alkoholrelaterede HCC patienter med alkoholisk og HCV-relateret cirrose, der ikke har leverkræft, og raske kontrolpersoner, hhv. Forskelle mellem grupper blev sammenlignet ved chi

2-statistik

De fordelinger af

PNPLA3

p.I148M genotyper er sammenfattet i tabel 2:. Patienter med alkohol -relaterede HCC omfattede væsentligt mere 148I /M heterozygote og 148m /M homozygote personer end de raske kontrolpersoner, og de to grupper af patienter med alkoholisk skrumpelever uden leverkræft. Hyppigheden af ​​

PNPLA3

148 allel blev øget både i alkohol-induceret skrumpelever (OR = 1,92; 95%-CI: 1,28-2,86; p 0,002) og alkohol-associeret levercancer (OR = 4,37; 95%-CI: 2,97-6,43; p 0,001) sammenlignet med raske kontroller. Hos patienter med alkoholisk cirrhose risikoen for HCC var særligt knyttet til den homozygot 148 /M-genotypen (OR = 16,84; 95%-CI: 6,68-42,43; p 0,001). Når vi sammenlignet risikoen for PNPLA3 I148M polymorfisme mellem alkoholholdige patienter med og uden HCC, forskelle i allel frekvens (OR = 2,28; 95%-CI: 1,47-3,55; p 0,001) og frekvensen af ​​den homozygote 148 /M genotype (OR = 4,33; 95%-CI: 1,68-11,16; p 0,002) stadig viste en signifikant virkning af 148 allel på progression af alkoholisk levercirrhose dybt leverkræft. Vi kunne ikke finde nogen signifikante associationer mellem PNPLA3 I148M polymorfi og serumniveauer af leverenzymer eller markører for det metaboliske syndrom (fedme, diabetes mellitus eller serum lipider) (data ikke vist).

For at udelukke, at de observerede forskelle i fordelingen af ​​Child-Pugh klasser kan have påvirket vores analyse, vi stratificeret patienter i de to klasser A /B versus C. Derefter vi matchede vores alkoholiske patienter til køn, alder og den dikotomiseret Child – Pugh klasse. Efter at matche stået til rådighed 42 par for en supplerende analyse: I disse matchede par af alkoholiske patienter med og uden hepatocellulært carcinom de PNPLA3 148 allelfrekvenserne var 53,6% vs. 31,0% (OR = 2,57; 95%-CI: 1,37-4,84; p = 0,003), henholdsvis. Ligeledes frekvenser af den homozygote 148m /M genotype var 31,0% vs. 9,5% hos matchede patienter med og uden HCC (OR = 6,50; 95%-CI: 1,68-25,16; p = 0,004).

Endelig vi afkrydset hvis

PNPLA3

p.I148M polymorfi forblev en selvstændig HCC risikofaktor, når andre kendte risikofaktorer for HCC såsom fedme, diabetes, og HBV-infektion blev også taget i betragtning. Herunder alle patienter med alkohol- og HCV-induceret leversygdom henholdsvis beregnede vi separate Cox regressionsmodeller at identificere HCC risikofaktorer hos patienter med alkoholisk cirrose (tabel 3) og HCV-associeret cirrhose (tabel 4). Homozygot

PNPLA3

148 /M-genotypen (OR 2,83; 95%-CI: 1,24-6,42; p = 0,013) blev bekræftet som en risikofaktor for HCC i alkoholisk skrumpelever. Endvidere HCV genotype 1 (OR 4,16; 95%-CI: 1,50-11,52; p = 0,006) blev bekræftet som en risikofaktor for HCC i HCV-associeret skrumpelever

Diskussion

Kronisk hepatitis C og alkoholforbrug er de førende årsager til HCC i europæiske befolkninger. Her har vi udført en tværgående analyse at undersøge potentielle rolle

PNPLA3

p.I148M variant i leverkræft associeret med alkoholisk leversygdom sammenlignet med patienter med HCV-induceret HCC. Vi fandt en støt stigende forekomst af den 148-allelen hos patienter med alkoholisk cirrose (36,2%) og alkohol-associeret HCC (53,7%) sammenlignet med raske kontrolpersoner (22,9%), mens forskelle i forekomsten af ​​denne genetiske variant mellem raske kontroller og HCV-associeret cirrhose (25,3%) og HCV-relateret HCC (30,2%) var minimale og ikke statistisk signifikant. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere observationer i alkoholisk leversygdom og styrker konceptet, at PNPLA3 148 variant forbundet med mere alvorlige leverskader og skrumpelever i alkoholisk leversygdom [17], [18]. Her, vi tilføjer den hidtil ukendte iagttagelse, at denne genetiske variant er også en stærk genetisk risikofaktor for alkohol-associeret HCC, hvilket bidrager til en ca. 4 gange forøget risiko i homozygote bærere af 148 allel selv i nærvær af etablerede cirrose. Denne idé understreges yderligere af vores multivariat regressionsmodel, som bekræftede

PNPLA3

148m homozygoti som selvstændige risikofaktorer for HCC blandt vore patienter med alkoholisk leversygdom. På den anden side,

PNPLA3

148m variant kun havde mindre indvirkning på HCC risiko ved cirrose forbundet med kronisk hepatitis C antyder, at denne genetiske variant er ikke et tumor-gen som sådan, men kun virker i kombination med en betydelig alkohol eksponering og hepatisk lipid ophobning.

To nylige undersøgelser fra Italien rapporterede stærke virkninger af

PNPLA3

148 variant også på risikoen for HCC i kronisk hepatitis C [19], [20], mens en tredje italiensk undersøgelse antydede, at denne allel overvejende var forbundet med metaboliske cirrose [21]. I overensstemmelse med denne sidstnævnte rapport, fandt vi kun ringe effekt af

PNPLA3

148 variant på risikoen for HCC i vore patienter med HCV-infektion, i hvem bias fra samtidige alkoholforbrug var blevet udelukket med stor omhu. I vores HCV-inficerede patienter

PNPLA3

148m /M homozygositet afslørede en odds ratio på 1,666 for risikoen for leverkræft (tabel 4), der har undladt at statistisk signifikans med vores stikprøvestørrelse. Power beregning angivet behovet for 670 patienter pr studiegruppe for at afsløre statistisk signifikans (p 0,05) for denne formodede foreningen. På den anden side de observerede uoverensstemmelser mellem de forskellige undersøgelser kan afspejle utilsigtede kosten forskelle mellem undersøgelsens populationer eller sandsynligvis det faktum, at patienter med kombineret HCV-infektion og alkohol indtag ( 300 g /uge) var ikke taget tilstrækkelig taget i betragtning. Denne forklaring vil være i overensstemmelse med det koncept, at hepatisk lipidakkumulering i kronisk hepatitis C genotype 1 er forbundet med tilstedeværelsen af ​​andre yderligere metaboliske faktorer såsom diabetes og fedme [22]. Vigtigt er det, at effekten kan henføres til

PNPLA3

p.I138M polymorfi i ernæringsmæssig cirrhosis var ikke korreleret til alder, køn, body mass index eller diabetes i overensstemmelse med tidligere rapporter [8].

Endelig der var en markant ubalance i leversygdom sværhedsgrad mellem patienter med og uden HCC blandt alkohol-induceret skrumpelever. Denne ubalance muligvis afspejler, at patienter med tidlig alkohol-induceret skrumpelever (Child Pugh klasse A) kun sjældent til stede ved sygehusvæsenet, hvis HCC er fraværende. Således patienter i alkoholrelaterede kontrolgruppe uden HCC havde betydeligt mere fremskreden cirrose end patienter med alkohol-induceret skrumpelever og HCC. For at kontrollere om dette fund var forudindtaget vores analyse, vi analyserede også den undergruppe af patienter, som kunne matches til Child-Pugh klasser ud over køn og alder. I tråd med vores hypotese bekræftet denne supplerende analyse en signifikant sammenhæng mellem

PNPLA3

148 allel – og især den

PNPLA3

148m /M genotype – og HCC (OR = 6,50; 95% – CI:. 1,68-25,16; p = 0,004)

er stadig uklart den fysiologiske rolle PNPLA3 protein.

PNPLA3

gen koder for et enzym, der udviser både triglycerid hydrolase og transacylation aktivitet in vitro [23]. Den methionin substitution på position 148 forstyrrer triglycerid hydrolase aktivitet [24], men PNPLA3 ablation i to forskellige musestammer havde ikke resulteret i nedsat lipid ophobning og leverskader under en række forskellige diæter [25]. På den anden side overekspression af

PNPLA3

148 i mus øget hepatisk lipid indhold begunstige en gevinst af funktion mutation [24]. Desuden er en række andre intracellulære interaktioner også diskuteret som potentielle alternative patogene mekanismer [26]. I forbindelse med ikke-alkoholisk steatohepatitis

PNPLA3

risiko allel fremmer nedsat lipid ophobning og sværhedsgraden af ​​fibrose [6], [8], [10], [27], [28]. Ligeledes regelmæssig alkoholforbrug forårsager leverskader via steatohepatitis. Der er også tegn på, at leverbiopsier fra bærere af en

PNPLA3

148 allel, især 148 homozygote fag, udviser større hepatisk inflammation og leverskader end patienter med vildtype genet ved samme omfang af lipid deposition [27 ]. Det kan således være forøget hepatisk inflammatorisk aktivitet og fibrose som reaktion på lipidakkumulering, som er forbundet med den

PNPLA3

148m variant, der øger risikoen for HCC i alkoholisk cirrose.

Uanset den underliggende mekanismer, forbindelsen mellem PNPLA3 polymorfi og HCC i alkoholisk leversygdom synes stærk nok til at bære praktiske konsekvenser: tilstedeværelsen af ​​en

PNPLA3

148 allel, og især

PNPLA3

148 homozygositet, kan give et nemt værktøj til at identificere enkeltpersoner med særlig risiko for HCC i alle faser af alkoholiske leverskader. Derfor bør fremtidige strategier forebyggelse og behandling HCC også tage hensyn til den kombinerede effekt af den

PNPLA3

p.I148M polymorfi og alkohol hos patienter med kronisk leversygdom.