PLoS ONE: Deregulering af MitCN, LIN28B og LET7 i en Molecular Undertype af Aggressive High-Grade serøs æggestokkene Cancers

Abstrakt

Molekylære undertyper af serøs ovariecancer er for nylig blevet beskrevet. Ved hjælp af data fra uafhængige datasæt, herunder over 900 primære tumor prøver, viser vi, at deregulering af

Lad-7

vej er specifikt forbundet med C5 molekylære undertype af serøs kræft i æggestokkene. DNA-kopi nummer og genekspression af

HMGA2

, alleler af

Lad-7

,

LIN28

,

LIN28B

,

MYC

,

MitCN

,

DICER1

, og

RNASEN

blev målt ved hjælp af microarray og kvantitativ revers transkriptase PCR. Immunhistokemi blev udført på 127 prøver ved anvendelse væv microarrays og anti-HMGA2 antistoffer. Fluorescens in situ hybridisering af bakterielle kunstige kromosomer hybridiseret til 239 ovarietumorer blev anvendt til måling translokation på

LIN28B

locus. Lille interfererende RNA knockdown i æggestokkene cellelinier blev anvendt til at teste funktionaliteten af ​​associationer observeret. Fire molekylære undertyper (C1, C2, C4, C5) af high-grade serøse ovariecancere blev robust repræsenteret i hver datasæt og viste lignende mønster af patientens overlevelse. Vi fandt meget specifik aktivering af en vej, der involverer

MitCN

,

LIN28B

,

Lad-7

og

HMGA2

i den molekylære undertype C5 defineret af

MitCN

forstærkning og overekspression, overekspression af

MitCN

mål, herunder den

Lad-7

repressor

LIN28B

, tab af

Lad -7

udtryk og

HMGA2

forstærkning og overekspression.

DICER1

, en kendt

Lad-7

mål, og

RNASEN

var overudtrykt i C5 tumorer. Vi så ingen tegn på translokation på

LIN28B

locus i C5 tumorer. Den rapporterede interaktion mellem

LIN28B

Lad-7

blev sammenfattet af siRNA knockdown i æggestokkene kræftceller. Vores resultater associeret deregulering af

MitCN

og nedstrøms mål, herunder

Lad-7

onkoføtalt gener, med serøs kræft i æggestokkene. Vi definerer for første gang, hvordan elementer af et onkogent pathway, der involverer multiple gener, der bidrager til stamcelle fornyelse, er specifikt ændret på en molekylær undertype af serøs ovariecancer. Ved at definere driverne af en molekylær undertype af serøse ovariecancer giver vi en ny strategi for målrettet terapeutisk intervention

Henvisning:. Helland Å, Anglesio MS, George J, Cowin PA, Johnstone CN, House CM, et al . (2011) Deregulering af

MitCN

,

LIN28B

og

LET7

i en Molecular Undertype af Aggressive High-Grade Serøse ovariecancer. PLoS ONE 6 (4): e18064. doi: 10,1371 /journal.pone.0018064

Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

Modtaget: den 18. november 2010; Accepteret: 18 februar 2011; Udgivet: 13 April, 2011

Copyright: © 2011 Helland et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. AOCS var støttet af USA Army Medical Research og Materiel Kommando under DAMD17-01-1-0729, The Cancer Råd Tasmania, The Cancer Foundation of Western Australia og National Health og Medical Research Council of Australia. Denne forskning blev understøttet af en victoriansk Life Sciences Computation Initiative (VLSCI) tilskud på Peak Computing Facility på University of Melbourne, et initiativ fra den victorianske regering, og også ved tilskud fra Radium Hospital Foundation og Fredriksen Foundation for æggestokkene Cancer Research . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

forvaltningen af ​​kræft i æggestokkene er i forandring. Det er mere og mere klart, at ovariecancer er en kompleks serie af forskellige tumortyper [1], der kræver behandling rettet molekylære træk fælles for undertyper af sygdommen. High-grade serøse ovariecancer (HG-SOC) tegner sig for størstedelen af ​​sygdomsrelaterede dødsfald. Mens responsrater er høje til platin-taxan adjuverende kemoterapi, har der været en lille forbedring i patientens overlevelse i det seneste årti eller mere, på trods af omfattende klinisk undersøgelse [2]. PARP-inhibitorer, der udnytter mangler i homolog rekombination reparation [3], [4], har vist stor løfte, især hos kvinder med kimcellelinje

BRCA1

eller

BRCA2

mutationer. HG-SOC er i øjeblikket behandles som en enkelt enhed. En dybere forståelse af de molekylære førere af denne sygdom er afgørende, hvis der skal udvikles mere effektive behandlingsformer [2]. For nylig, genekspression profilering afslørede glemmes mangfoldighed inden HG-SOC ved afgrænse fire forskellige molekylære undertyper. En undergruppe (C1) blev defineret ved en reaktiv stroma signatur, korrelerer med omfattende desmoplasia i sådanne prøver. Tumorer med C2 signatur blev karakteriseret ved intra-tumor-infiltration af immune celler, mens C4 tumorer havde en forholdsvis lav ekspression af stromale gener og høje niveauer af cirkulerende CA125. C5 undertype afspejlede en mesenchymal celle genekspression signatur, og disse tumorer havde sparsomme immun celle infiltration og var forbundet med lave niveauer af cirkulerende CA125 [5]. De genetiske begivenheder, der giver anledning til hver molekylær undertype af HG-SOC og styrer deres kliniske adfærd er i øjeblikket ukendte.

Lad-7

s er en familie af tolv sekvens-relaterede mikro (mi ) RNA fordelt over otte genomiske klynger, der ofte nedreguleret i cancer [6], [7], [8].

Lad-7

er opstået som en del af en kompleks og vigtig regulerende netværk i kræft, hvis reducerede udtryk fører til re-udtryk for en række onkoføtalt proteiner [6], [9]. Som med andre miRNA,

Lad-7

molekyler genkender og binder til deres målsekvenser, hvilket resulterer i både translationel undertrykkelse og mRNA henfald [10], [11], [12]. På et cellulært niveau,

Lad-7

har omfattende virkninger på differentiering og selvfornyelse [13].

HMGA2

gen er en udstrakt grad karakteriseret mål af

Lad-7

familie af miRNA [6], [9], [11], [14] og koder en DNA-bindende og kromatin modificere protein, der regulerer både differentiering og stamcelle fornyelse [15]. Højniveauekspression af HMGA2 har også været forbundet med dårligt resultat i en række solide cancere, herunder ovariecancer [16]. Balancen mellem

HMGA2

Lad-7

udtryk er blevet bundet til vedligeholdelse af en udifferentieret tilstand i cancerceller [9], [14]. En negativ feedback loop involverer højt niveau udtryk for

Lad-7

repressorer,

LIN28

LIN28B

, har været forbundet med flere maligniteter [14], [17 ], [18]. De onkogener c-myc og N-myc er positive regulatorer af

LIN28

LIN28B

henholdsvis [19], [20]. Derfor deregulering af forskellige aspekter af en vej, der involverer MYC proteiner,

Lad-7

repressorer

LIN28

og

LIN28B

, forskellige

Lad-7

alleler og onkoføtalt mål som

HMGA2

er blevet rapporteret i en række cancerformer.

Vi har udnyttet genomiske datasæt fra over 900 HG-SOC at dechifrere de veje, der styrer denne sygdom. Vi viser, at C5 undertype af HG-SOC er defineret ved

Let7

og

MitCN

de-regulering, der præsenterer en ny mulighed for målrettet terapeutisk intervention i kræft i æggestokkene.

Metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af det menneskelige forskningspotentiale etiske komitéer på Peter MacCallum Cancer Centre, Queensland Institute of Medical Research, University of Melbourne og alle deltagende hospitaler. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere i denne undersøgelse.

Genomisk datasæt

Microarray genekspression data blev opnået fra fire kohorter, kaldet AOCS, TCGA, NCI og Norge. Den AOCS datasæt (n = 285) blev genereret ved hjælp af Affymetrix U133 2.0 arrays og er tilgængelig på Gene Expression Omnibus (GEO). Den Cancer Genome Atlas datasæt (TCGA, n = 476) blev genereret ved hjælp af Affymetrix HTHGU133a arrays, og som opnås ved TCGA data portalen. Den NCI datasæt (n = 185) blev genereret på Affymetrix U133a arrays og fås fra Michael Birrer, Massachusetts General Hospital. Den Norge datasættet [21], [22] (n = 64) blev genereret ved hjælp af brugerdefinerede cDNA arrays og opnåede gennem laboratoriet af en af ​​os (A.H.). Kliniske oplysninger om hver datasæt er opsummeret i tabel S1.

Patienter og prøver

Prøver til immunohistokemi og RNA valideringsundersøgelser blev opnået fra den australske kræft i æggestokkene Study (AOCS), en populationsbaseret kohorte af kvinder med epitelial kræft i æggestokkene rekrutteret mellem 2002-2006 [5]. Alle patienter underskrevet en institutionelt godkendt patientinformation og samtykke dokument. Nærmere oplysninger om processer til patientens periodisering, indsamling af klinisk opfølgning oplysninger, patologisk gennemgang, isolation af nukleinsyrer, og forberedelse af væv microarrays er beskrevet tidligere [5].

Bioinformatik analyser

En detaljeret beskrivelse af det multiple bioinformatiske analyser anvendt i denne rapport findes i supplerende metoder S1.

Kvantitativ realtid polymerasekædereaktion (Q-RT-PCR)

Måling af ekspressionen af ​​kodning gener blev udført som tidligere beskrevet [23], under anvendelse af enten TaqMan genekspression assays (Applied Biosystems) eller SYBR green (Applied Biosystems). PCR-amplifikation blev udført tre gange for hver prøve. Endogene kontroller

HPRT1

ACTB

blev inkluderet for alle assays og relative kvantificering af mRNA-ekspression blev beregnet ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode [24]. Ekspressionen af ​​modne miRNA til

Lad-7

alleler blev bestemt ved anvendelse af et TaqMan miRNA assay (Applied Biosystems) efter producentens instruktioner. Yderligere detaljer, herunder primere og cyklustider, er tilvejebragt i supplerende metoder S1.

Immunhistokemi og fluorescens in situ hybridisering

HMGA2 proteinekspression blev målt i HG-SOC prøver på et væv microarray (n = 127) som beskrevet i supplerende metoder S1. Scoring var som følger: 0 – ingen /svag eller moderat nukleare udtryk, en – mindre end 10% tumorceller med stærke kernekraft farvning, 2 – 10-50% tumorceller med stærke kernekraft farvning, 3 – mere end 50% tumorceller med stærk nuklear farvning. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) af bakteriel kunstigt kromosom (BAC) prober til metafase kerner blev som tidligere beskrevet [17].

Funktionelle assays i cellelinier

Knockdown (KD) af target mRNA’er blev opnået ved hjælp Dharmacon On-Target Plus Smartpools (Dharmacon, Thermo-Scientific) for alle gener undtagen

MitCN

, der var målrettet hjælp Qiagen siRNA Hs_MYCN_3 (Qiagen). Controls inkluderet Dharmafect1 alene, Dharmacon ikke-tavshed kontrol pool,

GAPDH

smartpool, og All-Stars negativ kontrol (Qiagen) for

MitCN

analyser. Nærmere oplysninger om cellekultur og KD transfektionsbetingelser findes i supplerende metoder S1.

Resultater

Molekylær undertyper af HG-SOC

Vi udviklede en klassifikatør baseret på de molekylære undertyper (C1, C2, C4, C5) identificeret i vores tidligere undersøgelse af 215 tumorer fra den australske kræft i æggestokkene Study (AOCS) [5]. Brug af klassificeringen og en overvåget procedure læring blev prøver fordelt i en af ​​de fire molekylære undertyper i datasæt fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) (n = 476), Norge (n = 64) [21], [22] og national Cancer Institute (n = 185) [25] (figur 1A, tabel S1). Konsekvent mønstre af genekspression og kliniske udfald blev observeret på tværs af datasæt. C5 tumorer blev konsekvent forbundet med dårligt resultat i forhold til C2 subtype (Figur 1B-D). Vi bemærker, at der var en vis variation i den relative hyppighed af de molekylære undertyper i de forskellige datasæt, og det kan være forbundet med forskelle i inklusionskriterier anvendes i hver undersøgelse.

(A) Heatmap af genekspression data taget fra AOCS, TCGA, NCI og Norge datasæt viser, at tumorer inddeles i 4 molekylære undertyper. Gener er grupperet af Pearson korrelation og prøver bestilles ved molekylær undertype. Mens den oprindelige K-midler clustering fra Tothill et al. er vist for AOCS kohorten, blev en procedure overvåget indlæring anvendes til klassificering af tumorer i andre datasæt (se supplerende metoder S1). (B) Kaplan-Meier-overlevelseskurverne for prøver plottes. Samlet overlevelse bruges som slutpunktet i alle fire datasæt. Cox proportional hazard model anvendes til at beregne den statistiske signifikans af forskellen i overlevelse mellem alle fire grupper. Log-rank test p-værdi er rapporteret. (C) Prøver fra alle datasæt blev kombineret for at estimere overlevelsesegenskaber. Undertyper blev sammenlignet med C5 og log rank test p-værdi er angivet i tabellen. (D) Kaplan-Meier kurver afbildes at skildre overlevelsesfunktionen af ​​prøver i de fire forskellige undertyper efter at kombinere prøverne.

HMGA2 overekspression og lad-7 nedregulering

at identificere undertype-specifikke veje vi fokuseret på C5 tumorer, som er karakteriseret ved reduceret cirkulerende CA125 immunreaktivitet, begrænset immun celle infiltration, en udifferentieret fænotype [5], og generelt dårlig patient overlevelse (figur 1B).

HMGA2

er den stærkest overudtrykt C5-specifikt gen (AOCS p 0,0001; TCGA p 0,0001; NCI p 0,0001, to-sidet Mann-Whitney test figur 2A, tabel S2). Andre markører for en udifferentieret fænotype, der er stærkt C5-specifik omfatter

DACH1

,

Pax2

,

LAMA1

,

MitCN

,

SOX11

, samt høj mobilitet gruppens medlemmer

TOX

og

TCF7L1

.

Lad-7

målgener, herunder

HMGA2

er specielt dereguleret i C5 molekylære undertype af høj kvalitet serøse kræftformer. (A) mRNA udtryk for

HMGA2

er signifikant højere i den molekylære undertype C5. (B) immunhistokemisk analyse af HMGA2 udtryk i kræft i æggestokkene prøver viser konsekvent overekspression i C5 tumorer. Eksempel på en stærk (3+) farvning (øverst) og ingen farvning (nederst) panel. (C) En kerne af

Lad-7

regulerede målgener (onkoføtalt gener) identificeret af Boyerinas et al [6] er overrepræsenteret i C5 gen signatur. (D)

Lad-7

målgener opnået fra TargetScan5.0 er beriget i C5 tumorer. Betydningen af ​​overlapning mellem C5-specifikke og

Lad-7

målgen sæt blev bestemt ved ensidet Fishers eksakte test. Bar plot skildrer foreningen vises. (* Angiver p 0,0001)

immunhistokemisk analyse viste også, at C5 tumorer konsekvent udtrykker høje niveauer af HMGA2 protein (~ 95% ved 3 +;. P = 0,02, to-sidet Fishers eksakte test, figur 2B og tabel S3). På proteinniveauet, stærkt udtrykkende tumorer var også til stede i andre undertyper, omend i et lavere frekvens. Disse resultater tyder på, at en særlig mekanisme til at regulere

HMGA2

mRNA udtryk eller stabilitet opererer overvejende i C5 tumorer, og at post-transkriptionelle mekanismer kan påvirke HMGA2 proteinekspression i andre undertyper.

HMGA2

forstærkning var mere almindelig i C5 tumorer (p = 0,005, Mann-Whitney test, Tabel S4). Dette kunne dog ikke højde for de fleste af prøverne viser C5-specifikke overekspression, som

HMGA2

er betydeligt i udtrykt i C5 prøver uden forstærkning af

HMGA2

locus (figur S1). Derfor, mens

HMGA2

forstærkning er mere almindelig i C5 tumorer, forstærkning-uafhængig mekanisme (r) skal redegøre for C5-specifikke overekspression af mRNA og protein.

HMGA2

er den mest forudsagt mål af

Lad-7

familie af microRNA (miRNA) i genomet [6], [9], [11], [14], hvilket tyder på reduceret

Lad -7

udtryk som en alternativ forklaring på mønster af

HMGA2

udtryk i C5 tumorer. I overensstemmelse med dette, vi observerede C5-specifikke overekspression af andet gen normalt undertrykt af

Lad-7

, herunder en kerne af tolv onkoføtalt gener defineret af Boyerinas

et al.

[6 ] (Figur 2C; p = 4,8 × 10

-8, to-sidet Fishers eksakte test). En uafhængigt afledt gen sæt af de 100 mest højt rangeret

Lad-7

målgener forudsagt ved hjælp af en miRNA mål forudsigelse model [26] var også signifikant beriget i C5 undertype (p 0,0001, ensidet Fishers eksakte test) (figur 2D).

Vi derefter måles direkte udtryk for den

Lad-7

familie i AOCS prøver ved hjælp af en TaqMan assay og sammenlignet resultaterne med miRNA microarray data fra TCGA datasættet. Vi fandt, at

Lad-7b

,

-7d

, og

-7i

var betydeligt under udtrykt i C5 tumorer sammenlignet med andre undertyper i både AOCS og TCGA kohorter ( tabel 1).

Lad-7c

,

-7e

og

-7f

blev også betydeligt under udtrykt i C5 i enten TCGA eller AOC datasæt. Forskellen mellem de to kohorter med disse alleler kan vedrøre analysens følsomhed platform, der anvendes, miRNA mikroarrays til TCGA og TaqMan analyser for AOC prøver.

Deregulering af Let-7

Vi udforskede mulige årsager til lavt niveau udtryk for

Lad-7

alleler. Genomisk sletninger, analyseret af SNP-baserede arrays i TCGA datasættet, viste, at tab, der involverer den kromosomale region 22q13.31, der omfatter

Lad-7b

Lad-7A3

, var mere almindelig i C5 tumorer (p = 0,018) (tabel S5). Selvom tab af 22q13.31 kan tegne sig for reduceret ekspression af

Lad-7b

i nogle tumorer, det ville ikke forklare de observerede med effekter andre

Lad-7

alleler, som er fordelt over 8 loci og er mere tilbøjelige til at blive de-reguleret i

trans

. Fejl i miRNA maskiner, herunder reducerede niveauer af Dicer (

DICER1

) og drosha (

RNASEN

), har været forbundet med dårligt resultat i HG-SOC [27], dog højere udtryk af

DICER1

blev observeret i C5 undertype (figur S2).

DICER1

niveauer har vist sig at være negativt reguleret af

Lad-7b

[28], [29], potentielt forklare C5-specifikke overekspression af

DICER1

.

Lin28 og Lin28B negativt regulere

Lad-7

niveauer ved at binde til de terminale løkker af forløberne for

Lad-7

familie miRNA, hvilket blokerer forarbejdning til modne miRNA [17], [30], [31], [32]. Vi fandt, at ekspressionen af ​​

LIN28B

, men ikke

LIN28

, var stærkt beriget i C5 tumorer (AOCS p 0,0001, TCGA p 0,0001, to-sidet Mann Whitney test figur 3A og Figur S2). Translokation mellem

HACE1

LIN28B

er blevet foreslået at resultere i de-regulering af

LIN28B

og resultere i sænkede

Lad-7

niveauer [17 ]. Fisk på en TMA af 239 tumorer i æggestokkene, herunder 73 kendte molekylære undertype fundet beviser for omlejring mellem

HACE1

LIN28B

i kun en enkelt kerne fra en HG-SOC tumor af ukendt molekylær undertype (tabel S6), hvilket tyder på denne mekanisme for

LIN28B

opregulering er sjælden i ovariecancer.

(A) Boxplots skildre forskellen udtryk for

LIN28B

MitCN

i forskellige molekylære undertyper af serøs ovariecancer AOCS datasæt. (B) DNA-kopier nummer niveauer og ekspressionsniveauer af

MitCN

er stærkt korreleret. C5 prøver (kodet med rødt) er overvejende fordelt i øverste højre hjørne af plottet. Prøver med segmenteret kopi nummer log-forholdet er større end 0,3 blev anset for at have en gevinst på

MitCN

og prøver med segmenteret log forholdet mindre end -0,3 blev anset for at have et tab. Fishers eksakte test blev anvendt til at beregne den statistiske signifikans af foreningen. (C) associering mellem

MitCN

mål og C5 gen sæt.

MitCN

mål blev ekstrapoleret fra skæringspunktet mellem to gensekvenser lister, (1) gener bundet af N-myc i muse embryonale cellelinier og (2) gener med 2-fold stigning i ekspression efter transfektion af N-myc i muse embryonale celler (se supplerende metoder S1). Ved hjælp af data fra AOCS eller TCGA genekspression sætter gener blev klassificeret som høj eller lav i C5 tumorer versus alle andre tumorer (C1-C4) ved P 0,001 ved tosidet t-test. Betydningen af ​​overlapning mellem C5 gensæt og

MitCN

gensæt blev bestemt ved en ensidig Fishers eksakte test. Bar plot skildrer foreningen vises.

Deregulering af

MitCN

For nylig har både c-myc og N-myc vist til positivt at regulere

LIN28

LIN28B

udtryk [19], [20], men vi fandt ingen forskel i udtryk for

MYC

mellem C5 og ikke-C5 tumorer. Interessant gevinst på

MYC

var mere almindelig i ikke-C5 tumorer (p 0,01) (Tabel S4). Derimod

MitCN

blev betydeligt i udtrykt i C5 tumorer (AOCS p 0,0001, TCGA p 0,0001, to-sidet Mann Whitney test figur 3A). I TCGA datasæt, hvor var tilgængelige både kopi nummer og udtryk data,

MitCN

kopi nummer gevinst var stærkt beriget med C5 undertype (p 0,0001, to-sidet Mann-Whitney test, figur 3B). Mens der var en signifikant sammenhæng mellem

MitCN

kopi nummer og genekspression, nogle C5 prøver i løbet udtrykte

MitCN

uden genamplifikation, hvilket tyder på andre mekanismer undertype regulering. Yderligere bevis på N-Myc-aktivitet blev opnået ved at undersøge ekspression af kendte målgener i AOCS og TCGA kohorter [33]. I begge datasæt observerede vi en signifikant berigelse i ekspression af N-myc målgener i C5 tumorer (AOCS p 0,0001, TCGA p 0,0001, ensidet Fishers eksakte test, figur 3C), herunder trans-aktivering af

LIN28B

.

MitCN

HMGA2

udtryk blev også stærkt signifikant korreleret (Figur S3). Vi observerede meget specifik deregulering af enkelte medlemmer af

MitCN-Lin28B-Let7

vej i C5 tumorer, samt et bredere sæt

MitCN

og

Let7

transkriptionelle mål . For at forstå, i hvilket omfang den

Let7

vej definerer C5 tumorer, brugte vi en nyligt beskrevet signalvejen konsekvensanalyse (SPIA) [34] til at undersøge andre signalvej afhængigheder. Blandt 87 signalveje testet,

Let7

var den mest markant regulerede vej i C5 tumorer (tabel S7). Signature gener for alle undertyper er præsenteret i tabel S8.

Funktionel analyse af pathway foreninger

For at udforske den funktionelle betydning af vores resultater i primære tumorer, vi søgte genomiske data fra 40 æggestokkene cellelinjer. A2780 og CH1 tilnærmet C5 tumorer bedst, som begge udtrykte lave niveauer af

Lad-7

alleler, og høje niveauer af

HMGA2

LIN28B

(figur S4A, s4b ). Det er dog kun CH1 udtrykte

MitCN

viste ingen linje forstærkning af

MitCN

locus, og begge stærkt udtrykt

LIN28

, at paralog af

LIN28B

(Figur s4b, S4C). Efter systematisk knock-down af

LIN28

,

LIN28B

og

MitCN

vi overvågede udtryk for de

Lad-7

alleler. I både A2780 og CH1 celler, kombineret siRNA knock-down (KD) af både

LIN28

LIN28B

resulterede i opregulering af stort set alle Lad-7 familiemedlemmer (Figur S5A-B ), i overensstemmelse med tidligere rapporter [17], [31]. KD af

LIN28B

var generelt ikke så væsentlig som

LIN28

(maksimalt opnåede 70% KD, sammenlignet til 90% KD) og var forbundet med mindre indvirkning på

Lad-7

udtryk. Af særlig note,

Lad-7

opregulering efter

LIN28 /LIN28B

KD var ikke umiddelbart; trods

LIN28

LIN28B

mRNA undertrykkes inden for 48 timer,

Lad-7

opregulering var ikke påviselig indtil 96 timer. KD på

MitCN

RNA var vanskeligt at opnå (supplerende metoder S1) i CH1 cellelinjen. I bedste en reduktion på 60% mRNA-ekspression blev opnået (figur S5B) og lille effekt på

LIN28B

eller

Lad-7

ekspression blev observeret. Hverken KD af

LIN28

,

LIN28B

eller

MitCN

havde en signifikant effekt på HMGA2 protein eller mRNA-ekspression (figur S5C). Men som hos nogle C5 tumorer, CH1 celler har forstærkning af

HMGA2

(figur s4b), hvilket tyder på denne cellelinje har en alternativ mekanisme HMGA2 overekspression.

Diskussion

en omfattende serie af GAIN- og tab-af-funktion eksperimenter i cellelinier har vist en funktionel interaktion mellem N-myc og Lin28B [20]; Lin28B og lad-7 [17], [30], [31], [32]; og lad-7 og HMGA2 og andre onkoføtalt proteiner [6]. Her har vi vist, at hver pathway element specifikt udtrykkes på en måde, der ville forklare den dybe overekspression af HMGA2 og andre onkoføtalt proteiner i en stor del af C5 tumorer (figur 4, tabel S9). Gevinst eller overekspression af

MitCN

har ikke tidligere været forbundet med serøs kræft i æggestokkene. Mens et niveau af amplifikation ikke er så høj som typisk beskrevet i neuroblastom [35], finder vi signifikant overekspression af N-myc målgener i C5 tumorer støtter det synspunkt er det funktionelt aktivt. Nye oplysninger viser, at selv lavt niveau kopi nummer gevinst på

kan MitCN

væsentlig indflydelse patient resultat i medulloblastom [36].

MitCN

overekspression var yderst C5-specifikke og mekanismer i tillæg til forstærkning vil kunne bidrage til dette

Hver begivenhed er væsentligt beriget med C5 versus ikke-C5 høj kvalitet serøse tumorer.:

MitCN

forstærkning p 0,0001;

MitCN

overekspression p 0,0001; overekspression

MitCN

henvender p 0,0001;

LIN28B

overekspression p 0,0001; under-udtryk

Lad-7

alleler p 0,01 til 0,0001;

HMGA2

forstærkning p 0,001,

HMGA2

overekspression p 0,0001 (TCGA data). Kumulativt tab af Let-7b, og /eller gevinst på HMGA2, og /eller gevinst på MitCN forekommer i 77,8% af prøverne i C5 undertype (p 0,0001, tosidet Fishers eksakte test, Tabel S4).

Det er sandsynligt, at flere mekanismer fører til

HMGA2

undertype særligt udtryk, herunder

MitCN

forstærkning, tab af specifik

Lad-7

alleler herunder

Lad 7b

, og forstærkning af

HMGA2

selv. For eksempel i CH1 celler

LIN28

LIN28B

er begge over udtryk og undertrykke

Lad-7

udtryk, men disse celler viser også

HMGA2

amplifikation. Vi fandt også en signifikant sammenhæng mellem den molekylære fænotype og tab af

Lad-7b

C5. Udtrykket af

Lad-7b

blev reduceret i både AOCS og TCGA datasæt, og det er bemærkelsesværdigt, at blandt

Lad-7

alleler,

Lad-7b

har været tidligere rapporteret som værende under udtrykt i HG-SOC [37]. Selv om de forskellige alleler af

Lad-7

synes at målrette meget ens sekvenser, tilstedeværelsen af ​​multiple uafhængige gener, deres differentiel ekspression under udvikling [7] og vores data indebærer de udfører selektive roller.

den overekspression af

MitCN

Lad-7

mål i C5 tumorer tilføjer vægt på den funktionelle betydning af forstærkning og overekspression af

MitCN

og betydelig reduktion i ekspression af

Lad-7

alleler. Knockdown af

LIN28

LIN28B

udtryk resulterede i re-udtryk for

Lad-7

give yderligere beviser for en kæde af interaktioner i ovarietumorer. Imidlertid blev andre etablerede interaktioner ikke er observeret i de æggestokkene kræft celle testet her linjer. For eksempel, selv om

HMGA2

er et veldefineret mål af

Lad-7

[6], både i gevinst og tab-af-funktion eksperimenter, restaurering af

Lad-7

udtryk ikke mærkbart påvirke

HMGA2

udtryk. Disse resultater kan forklares ved begrænset eksperimentel undertrykkelse af

LIN28B

MitCN

, det faktum, at hverken CH1 eller A2780 cellelinjer trofast phenocopy alle de molekylære defekter set C5 tumorer, og forstærkning af

HMGA2

i CH1 celler. Vi bemærker også, at

Lad-7

ekspression blev gendannet efter en længere periode (96 h) i siRNA-medieret knockdown af

LIN28

LIN28B

, hvilket tyder på, at det er vanskeligt at reinitiere vejen når den er blevet nedreguleret. Yderligere validering af vores resultater vil kræve cellelinjer afledt af C5 tumorer, der i højere grad deler de molekylære karakteristika deres primære modstykker.

Mens elementer af denne vej er tidligere påvist at være de-reguleret i ovariecancer [37 ], [38], vores rapport er den første til at vise komplette sti forstyrrelser og dens tilknytning til en bestemt undertype af HG-SOC. Vores analyse viser, at

Lad-7

vej er unikt fremtrædende blandt signalering arrangementer afbrudt i C5 tumorer, og synes at forme deres transskriptionsprofilen. Identifikationen af ​​molekylære undertyper af brystkræft [39], [40] og visse hæmatologiske kræftformer såsom diffust storcellet B-celle lymfom [41], [42], [43] har givet kraftige udgangspunkter at opdage subtypespecifik førere af sygdom. Samtidig nedregulering af

Lad-7

og augmented

HMGA2

udtryk resulterer i mindre differentierede tumorer med stamcelletransplantation-lignende egenskaber [6], [9], [13], [14], [15]. Disse observationer er i overensstemmelse med den lave udtryk for differentiering markører i C5 tumorer [5], herunder

MUC16

, målet for CA125 antistof, der anvendes klinisk til ovariecancer diagnose og prognose. Vores arbejde for første gang definerer en vej hos HG-SOC, der er forbundet med og synes at drive den biologiske og kliniske adfærd for en særskilt molekylær undertype af ovariecancer, hvilket antyder en målrettet terapeutisk fremgangsmåde i denne gruppe patienter.

Støtte Information

Figur S1.

HMGA2 gen er signifikant opreguleret i C5 tumorer fra TCGA. (A) mRNA udtryk for

HMGA2

baseret på alle prøver fra TCGA (B) HMGA2 er overudtrykt i prøver uden forstærkning af HMGA2 locus

doi:. 10,1371 /journal.pone.0018064.s001

(TIF)

Figur S2.

Ekspression af en række C5 specifikke gener målt under anvendelse QRT-PCR. Dette er gjort for at bekræfte microarray udtryk data fra AOCS kohorte. Boxplots skildrer forholdet mellem ekspressionsniveauer af disse gener og molekylære undertype (C5 eller Non-C5) er vist, p-værdier er beregnet ved hjælp af Wilcox på rank sum test

doi:. 10,1371 /journal.pone.0018064.s002

(TIF)

Figur S3.

HMGA2 og MitCN ekspressionsniveauerne. (A) HMGA2 og MitCN ekspressionsniveauerne er korreleret i TCGA prøver.