PLoS ONE: Cytohesins /ARNO: Funktionen i Colorectal Cancer Cells

abstrakt

epidermal vækstfaktor (EGF) og insulin-lignende vækstfaktor-I (IGF-I) er kritiske regulatorer af celledifferentiering, overlevelse, proliferation og migration i cancere. Denne undersøgelse viste, at ARNO (cytohesin-2), en aktivator af EGF og IGF-I-veje, blev mere stærkt udtrykt i kolorektal cancer væv end i godartet tilstødende kolorektal væv. Når ARNO-siRNA eller kemisk inhibitor SecinH3 blokeret ARNO, nedstrøms af EGF og IGF-I-veje faldt i kolorektale cellelinjer HT29 og HCT116. Denne blokering svækket også celleproliferation, invasion, og migration in vitro. Desuden EGF-receptor (EGFR) -afhængige kolorektale tumorxenoplantater i nøgne mus udøvede anti-proliferative og vækst undertrykkelse effekter ved at injicere secineH3. Disse data tydede på, at inhibering cytohesins eller ARNO som cytoplasmatiske aktivatorer af EGFR og IGF-I i kolorektal cancer resulterede i anti-proliferation, reducerede invasion, nedsat migration, og undertrykt vækst in vivo og in vitro. Derfor kan cytohesins eller ARNO være en potentiel terapi mål for nogle kolorektal cancer

Henvisning:. Pan T, Sun J, Hu J, Hu Y, Zhou J, Chen Z, et al. (2014) Cytohesins /ARNO: Funktionen i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 9 (3): e90997. doi: 10,1371 /journal.pone.0090997

Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Republikken Korea

Modtaget: August 27, 2013; Accepteret: 6 feb 2014; Udgivet: marts 11, 2014

Copyright: © 2014 Pan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet fra National High Technology Research and Development Program Kina (nr 2012AA02A506), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LD13H160015) og Zhejiang Provincial centrale videnskabelige og teknologiske forskningsprojekter Internationalt samarbejde (nr 2009C14010). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er fortsat at være den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd og den anden hos kvinder trods væsentlige forbedringer i sin prognose tilskrives fremskridt i diagnose og terapi modaliteter. Over 1,2 millioner nye kræfttilfælde og 608 700 dødsfald registreres årligt [1]. De effektive behandlinger af kolorektal cancer er kirurgi, kemoterapi, og målrettet terapi. Fremskridt i konventionel kemoterapi har forlænget levetid, men effektiviteten for mange patienter er fortsat lav, især for dem med metastaser. Søgningen efter mere effektive og mindre giftige behandlinger har givet anledning til en ny generation af antitumormidler. Den mest almindelige er den målrettede biologiske middel [2]. Epidermal vækstfaktor (EGF) receptor (EGFR) og tilhørende signaltransduktionsveje er dukket op som vigtige molekylære terapeutiske mål for colorectal cancer [3].

EGFR /ErbB1, sammen med Her2 /ErbB2, Her3 /ErbB3, og ErbB4, er et medlem af ErbB-familien. EGFR /ErbB1 regulerer kroppens medfødte immunforsvar [4] samt celledifferentiering, overlevelse, spredning, invasion, og migration. EGFR indeholder et ekstracellulært ligandbindende domæne, en enkelt membran-udspændende region og en cytoplasmisk tyrosinkinasedomæne [5]; [6]. Ligander binder til det ekstracellulære domæne forårsager receptordimerisering, hvorved der induceres konformationel ændring af intracellulære phosphorylering komponenter og muliggøre nedstrøms signalering [7].

dag, mange målrettede biologiske agenser spiller vigtige roller i EGFR-signalvejen. Anti-EGFR monoklonale antistoffer og EGFR tyrosinkinaseinhibitorer har vist sig effektivt at inhibere proliferationen af ​​cancere, især colorektale og nasopharyngeale cancere [8]; [9]. Cetuximab og Panitumumab, antistoffer mod EGFR, er almindeligt anvendt til behandling af kolorektal cancer. Patienter med tiden udvikle resistens over for disse stoffer [10]. En almindelig hypotese om Cetuximab-resistens er EGFR eller nedstrøms molekylære mutation i tumorceller, såsom erhvervet EGFR ektodomæne mutation S492R [10]. Derudover vedvarende EGFR blokering øger andre end EGFR pathway pathways, såsom Her2, Her3, insulin-lignende vækstfaktor (IGF) -I receptor (IGF -IR) signalveje [11] – [13].

IGF-i og IGF-II spiller centrale roller i cellevækst, differentiering, overlevelse, transformation, og metastase. De biologiske virkninger af IGF’er medieres af IGF-IR, en receptor-tyrosinkinase med homologi til insulin receptor. Forskere nylig fundet, at dereguleringen af ​​IGF-systemet er en vigtig bidragyder til udviklingen af ​​flere kræftformer, med IGF-IR aktivering øger tumorigent potentiale af bryst-, prostata-, lunge-, tyktarms-, samt hoved og hals planocellulært karcinom [14 ]; [15].

Cytohesins som aktivatorer af ErbB receptorer er blevet rapporteret af Bill et al. [16]. De viste, at cytohesins forbedre EGFR aktivering ved direkte at interagere med de cytoplasmatiske domæner af dimeriserede receptorer og ved at lette de konformationelle omlejringer af disse domæner. Cytohesins end udtryk forbedrer EGFR-signalering i humane lungekræft, mens den kemiske hæmning eller knockdown af cytohesins reducerer EGFR aktivering. Ligeledes har vores tidligere undersøgelser vist, at blokering cytohesins af SecinH3 eller vælte ARNO af ARNO-siRNA kan reducere EGFR aktivering i kolorektal cancer cellelinjer HT29 [17]. EGF og IGF’er er kritiske regulatorer af celledifferentiering, overlevelse, proliferation og migration i kræft. De er også involveret i apoptose, transformation, invasiv vækst, og fjernmetastaser af tumorceller [15]. Cytohesins er blevet foreslået som en ny effektiv mål for reduktion af invasion, metastase, og Cetuximab eller panitumumab-resistente celler i patienter med tarmkræft. Muligheden for, at cytohesins kan være nye mål for resistente eller forskud-stadie kræftpatienter er blevet udforsket. Derfor undersøgte vi cytohesins eller ARNO som en ny anti-kolorektal cancer agent i denne undersøgelse.

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser

cellekulturmedier 1640 og McCoy S 5A blev erhvervet fra Gibco (Gibco, USA). De kanin eller mus monoklonale anti-humane antistoffer anvendte var ARNO (Abcam, ab56510), pEGFR (Py1068, Epitomics, 1138-1), pErk1 /2 (T202 /Y204, Bioworld, BS5016), EGFR (Cell Signaling, 3197), GAPDH (Bioworld, AP0063), IGF-IR (Abcam, ab39675), pIGF-IR (Abcam, ab39398), Pirs (Abcam, ab52167), Pakt (Abcam, ab106693), pIRS1 (Abcam, ab66153), pShc (Abcam, ab155170), og Ki-67 (Cell Signaling, 9027). Andre reagenser og udstyr, der anvendes, var som følger: SecinH3 (Merck-565.725 /sc-203.260), siRNA oligo (Genephama), MTT (sigma, m5655), DMSO (sigma, D5879), humane EGF (Peprotech, AF-100-15 ), human IGF-1 (Peprotech, AF-100-11), FBS (Gibco, USA), og 0,25% trypsin (Sigma), immunhistokemisk kit (Zhongshan, Kina).

cellelinjer og dyrkning

de humane kolorektal cancer cellelinjer HT29 og HCT116, der blev identificeret uden mutation i KRAS og BRAF, blev opnået fra Key Laboratory of cancer Prevention og Intervention, cancer Institute, Second Affiliated Sygehus, School of Medicine, Zhejiang University, Kina. Cellekulturerne var som følger: HT29 cellelinje ved 1640 (med 10% FBS + 1% streptomycin /penicillin) og HCT116 cellelinie ved McCoy ‘s 5A (med 10% FBS + 1% streptomycin /penicillin). Alle cellelinier blev dyrket i et CO 37 ° C 5%

2 inkubator og passeret med 0,25% trypsin (Sigma) i 0,2 M phosphatbufret saltvand (PBS).

tumorprøver

Før den humane tumorprøver forskning, skal var blevet opnået patienternes informerede samtykke. Vi havde indsendt en erklæring fra vores hospital etiske udvalg og modtaget godkendelse af forskningen. Alle tumorprøver stammer fra Biobank på Key Laboratory af forebyggelse Kræft og Intervention, Cancer Institute, Zhejiang University, Kina. Alle tumorer blev klinisk og patologisk identificeret som værende den primære og eneste neoplastisk læsion og klassificeret i henhold til World Health Organization (WHO) Klassificering af tumorer i fordøjelsessystemet (2010).

Immunfarvning

For immunfarvning, vi brugte kanin monoklonale antistoffer mod ARNO (Abcam, ab56510), mus antistoffer mod pEGFR (Py1068, Epitomics, 1138-1), kanin polyklonale antistoffer mod pIGF-IR (Abcam, ab39398) og kanin monoklonale antistoffer mod Ki-67 (Cell Signaling, 9027) som primære antistoffer. Før ansøgning blev alle antistoffer fortyndet (primære antistoffer fortyndet 1:100, alle andre sekundære antistoffer fortyndet 1:200) i PBS (150 mM NaCl, 10 mM Na

2HPO

4, 10 mM NaH

2PO

4, pH 7,4). Immunhistokemi blev udført ifølge producentens anvisninger. Farvningsintensiteter blev individuelt evalueret af tre uafhængige observatører ved anvendelse af en fire-lags pointsystem som beskrevet [18].

MTT

HT29 eller HCT116-celler podedes på plader med 96 brønde ved en densitet på 3000 celler /brønd. Celler blev dyrket med 1% FBS og reagenser (50 ng /ml EGF eller 25 ng /ml IGF-1, SecinH3 med forskellig koncentration (0 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM)) i 24, 48 og 72 timer ved 37 ° C og 5% CO

2. Derefter blev 5 mg /ml MTT blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer. Derefter 200 pi DMSO blev tilsat til en målrettet MTT substrat, og absorbansen blev målt ved 570 nm under anvendelse af et Spectra MAX mikro-pladelæser (Bio-Rad, USA)

Western blot-analyse

Celler blev opsamlet og ekstraheret med en eukaryot celle lysis buffer ifølge producentens anvisninger. Proteiner blev adskilt ved 12% SDS-PAGE og blottet på en nitrocellulosemembran med en våd overførselsindretning (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Blottet membraner blev blokeret med 10% skummetmælk i PBS Tween-20 i 1 time. Efter vask af membranerne tre gange med Tris-pufret saltopløsning Tween-20 (TBST), blev de inkuberet med primært antistof fortyndet 1:1000 ved stuetemperatur i 1 time og derefter inkuberet i HRP-mærket sekundært antistof fortyndet 1:10 000 ved stue temperatur i 1 time. Efter skylning af membranerne, blev visualisering udført med en forøget kemiluminescens Western blot-analyse (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK), og celler blev udsat for røntgenfilm (Kodak). GAPDH protein blev anvendt som en indre kontrol. Boltene opdages og analyse af software Alpha Imager EP (Version: 3.2.2.0).

Cell migration analyser

Cell migration blev udført ved hjælp af 24-brønd Tran svulme plader (8 um pore størrelse, Costar). Ca. 1 × 10

4 celler (HT29 eller HCT116) blev fyldt i de øvre kamre. De nedre kamre blev fyldt med medium (1640 plus 1% FBS) i fravær (DMSO 0,2%) eller tilstedeværelse af SecinH3 (10, 20, eller 40 uM). TRAN Swell Pladerne blev derefter inkuberet i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 48 timer. Efter rensning af celler fra oversiden af ​​polycarbonatmembran og hematoxylin-eosin-farvning, blev polycarbonatmembranen skæres og placeres på et objektglas, dækning sled og undersøgt under mikroskopet. Det totale migreret celle antallet og procentdelen blev derefter talt.

xenograft tumormodeller

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Zhejiang University Love for dyrebeskyttelse og godkendt af Zhejiang University dyrebeskyttelse udvalg . Tumorer blev genereret ved subkutane injektioner af 5 × 10

6 HT29 celler i nu /nu athymiske hanmus ifølge Ullrich et al. [19]. Efter etablering tumorer (ca. 6 mm i diameter) blev fjorten mus randomiseret i to grupper. Mus i SecinH3 gruppe blev behandlet med daglige intraperitoneale injektioner af SecinH3 (100 pi, 2,5 mM; i 75% glucoseopløsning (5%) /25% DMSO). Mus i kontrolgruppen blev behandlet med det samme volumen 75% glucoseopløsning og 25% DMSO, indtil den 14. dag. Under behandling, målte vi den største tumordiameter hver 2 dage ved ultralyd og derefter aflivet musene til at indsamle tumorerne. Vi udførte derefter immunhistokemisk farvning for Ki-67 til at detektere spredning inhibering af SecinH3 i xenotransplantat-tumormodeller. Det samlede Ki-67 positive celletal og procentdel blev derefter talt.

Statistik Salg

Resultaterne er angivet som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien (SEM). Den statistiske software SPSS16.0 blev anvendt til statistisk analyse. Parvise sammenligninger blev udført af Students

t

-test. Pearson korrelation analyse blev udført, med

s

0,05 (mærket “*”), og

s

. 0,01 (mærket “**”) anses for signifikant forskellig eller signifikant korreleret

Resultater

ARNO overekspression var korreleret med EGFR og IGF-IR-niveauer i human colorectal cancer væv

EGFR og IGF-IR signalering spiller kritiske roller i mange typer af kræft [16 ] og vores gruppe fandt, at ARNO og andre cytohesins forbedre EGFR aktivering i de kolorektale cancerceller [17]. Spekulerede vi således, om ARNO var overudtrykt i patienternes cancervæv og overekspression blev korreleret med EGFR og IGF-IR signalering. Derfor brugte vi immunhistokemi til at undersøge primære humane kolorektale adenokarcinomer med et antistof påvisning ARNO, pEGFR (pY1068), og pIGF-IR (pY1185). Resultaterne viste, at den normale kolorektal væv eller godartet tilstødende kolorektal væv kun havde baggrund (30/36) eller svag farvning (6/36). Desuden viste alle karcinomer ARNO positiv farvning, 93,1% var moderat eller stærk. Vi fandt en meget signifikant (

r

= 0,712,

s

= 0,012 for pEGFR;

r

= 0,684,

s

= 0,031 for pIGF- IR,

n

= 36) korrelation mellem ekspressionsniveauet af ARNO og pEGFR eller pIGF-IR (Fig.1). Vores tidligere undersøgelser rolle ARNO i kolorektal cancer væv har afsløret en høj korrelation med pEGFR og pIGF-IR, tyder på, at ARNO muligvis øger aktivering og signalering af EGFR og IGF-IR.

Patientrettigheder kolorektal kræft eller godartede tilstødende væv konsekutive sektioner blev farvet for ARNO (a), pEGFR (b), og pIGF-IR (c). Repræsentative billeder af normal colorektal væv (venstre kolonne) og moderat (højre kolonne) ARNO ekspression er vist (oprindelig forstørrelse x 100). Diagrammet i (a) viser fraktionen og frekvenser af tumorer med baggrund (-), svag (+), moderat (++) eller stærk (+++) farvning for ARNO. Diagrammerne i (b) og (c), skildrer korrelationen af ​​phosphoryleringsniveauerne af de respektive proteiner med ARNO score (

s

= 0,012 for pEGFR,

s

= 0,031 for pIGF-IR ,

n

= 36). Det afslører, at ARNO overekspression var korreleret med forbedret EGFR og IGF-IR.

Kemisk hæmning af cytohesins og knockdown af ARNO reduceret celle signalering

At påvise funktion cytohesins eller ARNO i vejen for kolorektal cancer celler, SecinH3 og ARNO-siRNA EGF (valgt af de primære eksperimenter) hæmmer cytohesins /ARNO i HT29-celler [17]. I assayet HT29-celler blev dyrket i 35 mm glas-bottom retter markeret som gruppe A, B eller C. Alle celler blev dyrket med 1% FBS dyrkningsmedium. SecinH3 (20 uM eller en blanding af 100 pmol ARNO-siRNA i 5 pi Lipofectamine 2000) blev tilsat til retter fra gruppe B, når cellerne havde bredt til at dække 70% af retterne i 10 timer. Samtidig blev 0,2% DMSO (eller 5 pi Lipofectamine 2000) tilsat til retter fra gruppe A og C som en kontrol, og derefter 50 ng /ml EGF blev tilsat til retter fra grupperne A og B i 5 min. Western blot-analyse blev anvendt til at teste ekspressionen af ​​EGF pathway-associerede molekyler, herunder ARNO, EGFR, pEGFR, pIRS1, pShc, og pErk1 /2. Resultaterne viste, at når SecinH3 blokerede cytohesins eller ARNO hæmmes af ARNO-siRNA blev ARNO udtryk reduceret i HT29-celler. Derudover blev phosphorylerede molekyler af reaktionsvejen EGF herunder pEGFR, pShc, og pErk1 /2 nedreguleret i HT29-celler (fig. 2).

(a og b) SecinH3 og ARNO-siRNA reduceret EGFR receptor signalering. Western blot analyse af HT29-celler behandlet med SecinH3 (a) eller ARNO-siRNA (b) og stimuleret med EGF vises. Phosphorylering af de angivne proteiner blev bestemt ved immunodetektion hjælp phosphospecifikt antistoffer. Glyceraldehyder fosfat (GAPDH) tjente som en belastning kontrol. Diagrammerne viser relative phosphoryleringsniveauerne efter normalisering for GAPDH. De ubehandlede ligand-stimulerede celler blev sat som 3 (

n

= 3). Data er repræsenteret som gennemsnittet ± SEM. *

s

0,05, **

s

. 0,01

For at opdage funktion cytohesins eller ARNO i IGF vej, SecinH3 og ARNO -siRNA [17] i HCT116 celler hæmmes cytohesins /ARNO. I assayet HCT116 celler blev dyrket i 35 mm glas-bottom retter markeret som gruppe A, B eller C. Alle celler blev dyrket med 1% FBS dyrkningsmedium. SecinH3 (20 uM eller en blanding af 100 pmol ARNO-siRNA i 5 pi Lipofectamine 2000) blev tilsat til retter fra gruppe B, når cellerne havde bredt til at dække 70% af retterne i 10 timer. Samtidig blev 0,2% DMSO (eller 5 pi Lipofectamine 2000) tilsat til retter fra gruppe A og C som en kontrol, og derefter 25 ng /ml IGF-1 blev tilsat til retter fra grupperne A og B i 5 min. Western blot-analyse blev anvendt til at teste ekspressionen af ​​IGF pathway-associerede molekyler herunder ARNO, IGF-IR, pIGF-IR, Pirs, og Pakt. Resultater viste, at når cytohesins blev blokeret ved SecinH3 eller inhiberet af ARNO-siRNA blev ARNO ekspression reduceres i HCT116-celler. Derudover blev phosphorylerede molekyler af IGF pathway herunder pIGF-IR og Pakt nedreguleret i HCT116-celler (Fig. 3).

(a og b) SecinH3 og ARNO-siRNA reducerede IGF-IR receptor signalering. Western blot analyse af HCT116 celler behandlet med SecinH3 (a) eller ARNO-siRNA (b) og stimuleret med IGF-1 er vist. Phosphorylering af de angivne proteiner blev bestemt ved immunodetektion hjælp phosphospecifikt antistoffer. Glyceraldehyder fosfat (GAPDH) tjente som en belastning kontrol. Diagrammerne viser relative phosphoryleringsniveauerne efter normalisering for GAPDH. De ubehandlede ligand-stimulerede celler blev sat som 3 (

n

= 3). Data er repræsenteret som gennemsnittet ± SEM. *

s

0,05, **

s

. 0,01

Blokering cytohesins reduceret proliferation og migration af kolorektal celler

immunhistokemi af patienternes kræft væv viste, at ARNO overekspression var korreleret med forbedret EGFR og IGF-IR. Dette fund fik os til at tænke over muligheden for nedsat proliferation eller migration af EGFR /IGF-følsomme celler, når ARNO er ​​blokeret. For at vælge EGFR /IGF-følsomme cellelinjer, vi udførte MTT assay ved dyrkning af kolorektal cancer cellelinjer HT29, SW620, SW480, HCT116 og LoVo i 1% FBS med EGF eller IGF. Vi fandt, at HT29 var EGFR-afhængige cellelinie og HCT116 blev IGF følsomme (data ikke vist). Begge cellelinier blev identificeret som vildtype for KRAS og BRAF (data ikke vist). At påvise forholdet mellem ARNO med celleproliferation og migration i colorektal cancer, føjet vi sesinH3 til dyrkningsmediet og fundet det kan reducere proliferation (MTT-assay med SecinH3 i 0 (DMSO), 10, 20, og 40 uM i 24, 48 og 72 h) (fig. 4b), og migration (Tran kvælde med SecinH3 i 0 (DMSO), 10, 20 og 40 uM i 48 timer) af HT29 og HCT116-celler (fig. 4a). Det viser, at SecinH3 kan hæmme infiltration og migration af HT29 og HCT116 celler. Og virkningerne er proportional med koncentrationen af ​​SecinH3 og tiden for operationen.

Venstre kolonne i diagram (a) er repræsentative billeder af Tran svulme assay af HT29 og HCT116 celler behandlet med SecinH3 i 0, 10, 20 og 40 uM hhv. De venstre billeder er resultatet af HT29 celler uden SecinH3 (DMSO 0,2% i 48 timer) og med SecinH3 (20 uM i 48 timer) (oprindelig forstørrelse x 100). Det ser ud til, at SecinH3 kan hæmme migration af HT29 og HCT116 celler. Resultaterne er korrelation med koncentrationen af ​​SecinH3 og tiden. Diagrammerne (b) viser relative celleantal af HT29 og HCT116 bestemt ved MTT-assay i nærvær af SecinH3 i 0, 10, 20, og 40 uM i 24, 48 og 72 timer. Det forekommer, at SecinH3 kan inhibere infiltration af HT29 og HCT116-celler. Resultaterne er også korrelation med koncentrationen af ​​SecinH3 og tiden. Data er repræsenteret som gennemsnittet ± SEM. * P 0,05, ** p. 0,01 (

n

= 5)

SecinH3 reducerede væksten af ​​kolorektale HT29 tumorxenoplantater

Den stærke udtryk ARNO i kolorektal cancer væv og dets signifikant sammenhæng med pEGFR og pIGF-IR fik os til at spekulere på, om at blokere cytohesins in vivo kan hæmme spredning af tumorceller. For at undersøge denne hypotese, HT29-celler, der har den højere ekspression af EGFR end andre colorektale cancerceller [17], blev udvalgt til at gøre det xenotransplantat musemodel. Så vi injiceret subkutant HT29-celler i nøgne mus til at generere tumorxenoplantater. Når tumoren xenograft størrelse nåede 6-7 mm i mus, der var blevet injiceret de HT29-celler i næsten en uge, begyndte musene til behandling med eller uden SecinH3. De tumorer i SecinH3 gruppe blev inhiberet vækst naturligvis efter behandling med SecinH3 i mere end en uge. De to grupper havde tydelige forskelle indtil den 11. dage efter behandlingen (fig. 5a). Immunhistokemisk farvning af celleproliferationen markør Ki-67 i operativt fjernede tumorer bekræftede reduceret celleproliferation. Det samlede Ki-67 positive celletal og procentdel blev derefter talt. Vi fandt meget signifikant forskellig ekspression plan mellem af musene behandlet med eller uden SecinH3 efter behandlingen på 14 dage (p = 0,0083, n = 7) (Fig.5b, c, d). Western blot-analyse blev anvendt til at teste ekspressionen af ​​EGF pathway-associerede molekyler i tumorer mus behandlet i 2 uger, herunder ARNO, pEGFR. Resultaterne indikerer, at når SecinH3 blokerede cytohesins, ARNO og pEGFR udtryk blev reduceret i HT29 implanteret. (Fig.5e).

Diameteren af ​​xenograft tumor etableret i mus blev målt ved ultralyd hver 2 dage under behandlingen (diagram a). T

1 var kontrolgruppen. T

2 var SecinH3 gruppen. De tumorer i SecinH3 gruppe blev hæmmet vækst naturligvis, efter daglige intraperitoneale injektioner af SecinH3 i mere end en uge. Der var signifikant forskel mellem de to grupper i 11

th, 14

th dage efter behandlingen. Diagram (b) og (c) repræsenterer immunhistokemiske belastende resultater for Ki-67 tumor fra mus efter behandling med (b), eller uden SecinH3 (c) i 14 dage, (oprindelig forstørrelse x 200). Det seams at SecinH3 nedsætter ekspressionen af ​​Ki-67 i HT29 implanteret. Diagram (d) viser den positive udtryk på Ki-67 i tumorer i mus med HT29 xenografter i 14

th dage efter behandling med eller uden SecinH3. Diagram (e) viser den positive ekspression af ARNO, pEGFR i tumorerne i mus, der bar HT29 xenografter efter behandling med eller uden SecinH3 i 2 uger. Arno og pEGFR udtryk for de to grupper har signifikant forskel. Diagrammerne viser relative phosphoryleringsniveauerne efter normalisering for GAPDH. Data er repræsenteret som gennemsnittet ± SEM. *

s

0,05, * *

s

0,01, n = 7.

Diskussion

EGF og IGF er kritiske regulatorer af biologiske karakteristika celler, især i kræft [20]. Vores tidligere undersøgelse har vist, at ARNO er ​​den vigtigste cytohesin og overudtrykt i kolorektale cancer cellelinjer som en aktivator, som spiller en afgørende rolle i EGFR vej signalering [17].

For at verificere den hypotese, at ARNO er relateret til tarmkræft ved at aktivere EGF og IGF, vi udførte immunhistokemi af reseceret menneskelige kolorektale adenokarcinomer farves af ARNO, pEGFR, og pIGF-IR. Sammenlignet med normal kolorektal væv eller godartet tilstødende kolorektal væv, ARNO, pEGFR, og pIGF-IR var over udtrykt i adenokarcinomer. Vi fandt også en højsignifikant korrelation mellem ekspressionsniveauerne af ARNO og pEGFR eller pIGF-IR.

Derudover brugte vi siRNA og SecinH3-hæmmede ARNO /cytohesins i kolorektale cancer cellelinjer at udforske aktiviteten af ​​ARNO og dets associering med EGFR og IGF-IR signalsystem. Vi derefter opdaget nedstrøms af EGFR og IGF-IR i samarbejde med kolorektale kræft incidensrater. Når vi hæmmede cytohesins eller ARNO blev de efterfølgende molekyler af EGF pathway afspejles i den reducerede aktivering af pEGFR, pIRS1, pShc, og pErk1 /2. Beviser foreslog, at blokering cytohesins eller ARNO kunne reducere vejen EGF-systemet. På alle tidspunkter, vi har registreret IGF vej nedstrøms herunder IGF-IR, pIGF-IR, Pirs, og Pakt. Disse molekyler blev nedreguleret da ARNO blev hæmmet kemisk eller ved siRNA. Disse regler om indikerede, at signalforstærkning og transduktionsveje blev effektivt inhiberet [21]; [22]. Således cytohesins eller ARNO var stærkt korreleret med EGF og IGF-aktivering i kolorektal cancer [23].

I en cellulær kontekst, vi brugte de menneskelige kolorektale cancer cellelinjer HT29 og HCT116 identificeret uden mutation i KRAS og BRAF . Når ARNO-siRNA eller SecinH3 blokeret ARNO eller cytohesins blev spredning af kolorektal cancer celler reduceret i MTT. Endvidere blev reduktionen spredning positivt korreleret med SecinH3 koncentration. For invasionen og migration assay blev Tran svulme assay udføres. Porerne i Tran svulme membraner blev blokeret med en gel (matrigel) bestående af ekstracellulær matrix til at efterligne typiske matrixer at tumorceller støde på under invasionen proces in vitro. Ved at placere de kolorektale celler på oversiden af ​​gelen at blive tiltrukket af en højere serumkoncentration på den anden side af brønden, blev invasion bestemt ved tælling af de celler, der havde gennemkøres celle-permeable membran med invaderede og migrerede mod højere serumkoncentrationen. I denne analyse fandt vi, at hæmmende cytohesins ved SecinH3 faldt invasionen og migration af kolorektal cancer celler. Forskere har for nylig rapporteret lignende reduktioner i lunge- og prostatakræft [6]; [19]; [24]. Denne reduktion kan bidrage til nedregulering af EGF og IGF-I-vejen signalamplifikation og transduktion. I in vivo-undersøgelse, vi injicerede SecinH3 dagligt efter de HT29 tumorxenografter blev frembragt i nøgne mus. Vi fandt, at væksten af ​​tumor naturligvis blev hæmmet efter 9 dages SecinH3 injektion. Efter 14 dages behandling blev tumorproliferation i mus også inhiberes.

I en nylig forskning, er det finder, at ARNO udtrykkes kraftigt i colorektal cancer, og ekspression er korreleret med EGFR og IGF-IR pathways . ARNO hæmning kan reducere signalering og ledning af disse veje, samt mindske spredning, invasion, og migration af kolorektal cancer celler in vivo og in vitro. Ludovini [25] rapporterede, at hvis både IGF-IR og EGFR er meget co udtrykt i opereret ikke-småcellet lungecancer, kan patienterne opnår kortere sygdomsfri overlevelse. Choi et al. [26] viste, at kombineret inhibition af IGF-IR signalering øger vækstinhiberende og apoptoseinducerende virkninger af EGFR inhibitor. Men kræftceller altid har mange signal kanal måder at gengive, og EGFR og IGFR er kun to af disse måder. Selv ARNO kan være en ny terapi mål for nogle kolorektal cancer celler, kan den højere koncentration af ARNO i kræftceller end i normale celler skyldes andre årsager såsom spredning og immunitet. Mekanismen af ​​migration kan også være relateret til integrin β [27]. Alle disse hypoteser skal undersøges i fremtiden.

Tak

Vi takker Dr. Zhou Jiaojiao og Dr. Tan Chunwen for deres cellelinier (HT29, HCT116), og vi også takke for deres støtte og entusiasme. Vi vil gerne undskylde over for de forfattere, hvis uvurderlige arbejde er ikke nævnt og citeret i ovenstående.