PLoS ONE: Sammenlignende Genomisk Analyse af primære og Synkron metastatisk kolorektal kræft

Abstrakt

Omkring 50% af patienter med primær kolorektal cancer udvikle levermetastaser. Forståelse af genetiske forskelle mellem primær tyktarmskræft og deres metastaser til leveren er vigtig for at udforme en bedre terapeutisk fremgangsmåde for denne sygdom. Udførte vi hele exome sekventering og kopiantal analyse for 15 tripletter, der hver omfatter normalt colorektalt væv, primær colorektal carcinom og dets synkrone matchede levermetastaser. Vi analyserede ligheder og forskelle mellem primær kolorektal carcinom og matchede levermetastaser i forhold til somatiske mutationer og somatisk kopi nummer alterationss. Den genomiske profilering viste mutationer i APC (73%), KRAS (33%), ARID1A og PIK3CA (6,7%) gener mellem primær kolorektal og metastatiske levertumorer.

TP53

mutation blev observeret i 47% af de primære prøver og 67% i leveren metastatiske prøver. De grupperede par, i hierarkisk klyngedannelse viste lignende somatiske kopi nummer ombygning mønstre, i modsætning til de i grupper, par. Mange mutationer (herunder kendte vigtige cancer driver gener) blev delt i de grupperede par. De i grupper par udviste tydelige mutation mønstre uden delte mutationer i centrale driver gener. Fire i grupper levermetastaser prøver havde mutationer i DNA fejlparringsreparationsgener sammen med hypermutationer og et betydeligt antal kopital ændringer. Vores resultater antyder, at omkring halvdelen af ​​metastatisk kolorektal carcinom havde samme klonoprindelse med deres primære colorektale carcinomer, mens de resterende tilfælde var genetisk forskellige fra deres primære carcinomer. Disse resultater understreger behovet for at evaluere metastaselæsioner separat for optimeret terapi, snarere end at ekstrapolere fra primære tumor data

Henvisning:. Lee SY, Haq F, Kim D, juni C, Jo HJ, Ahn SM, et al. (2014) Sammenlignende Genomisk Analyse af primære og Synkron metastatisk kolorektal kræft. PLoS ONE 9 (3): e90459. doi: 10,1371 /journal.pone.0090459

Redaktør: Harriet Wikman, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Tyskland

Modtaget: September 30, 2013; Accepteret: 30 Jan 2014; Udgivet: 5 mar 2014

Copyright: © 2014 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Videnskab, IKT Future Planning (nr 2012R1A1A1013369). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

nye begreb polyklonalitet vinder betydning i kræft biologi [1]. Det monoklonale evolution af en tumor fra en enkelt cancercelle er blevet grundigt undersøgt, og anses generelt for at involvere selektiv klonal ekspansion af dominerende tumor kloner. For nylig er den alternative begrebet polyklonalt evolution opstået. Denne model består af to centrale begreber: den selv-seeding hypotese og mutator fænotype model. Den tidligere foreslår, at tumor kloner forlader det primære sted, indtaste systemiske kredsløb via tumorvaskulatur, kolonisere en fjern site, hvorved der skabes en ny subpopulation [2], [3]. Den mutatorfænotype model foreslår et lille antal meget forskellige tumor-cellekloner (polyklonale) i stedet for et par konkurrerende klonale subpopulationer; faktisk flere solide tumorer, herunder coloncancer, er blevet foreslået at være yderst polyklonale [4].

identificere oprindelsen for kræft er afgørende at forstå de genetiske hændelser, der er involveret i tumor initiering og progression [5] . Som med primære cancere, kan metastaser også have enten en enkelt eller polyklonalt oprindelse [6], [7]. Generelt metastaser bære lignende mutationer til dem af de primære kræftformer, hvorfra de stammer, men yderligere mutationer opstå efter transformation [6], [8]. Den kontinuerlige, og ofte accelererende virkninger af mutationer resulterer i genetisk heterogenitet mellem primære og metastatiske cancere; dette hovedsagelig forøger modstanden over for behandling i sidstnævnte, som er den dominerende årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [6], [9].

colorectalt carcinom (CRC) er den tredje mest almindelige malignitet og den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald i mange lande [10], [11]. Næsten 50% af CRC patienter udvikler kolorektal levermetastaser (CLM) [12]. Uden behandling patienter med CLMs har en median overlevelse på kun 5-10 måneder, med mindre end 0,5% overlevende ud over 5 år [13]. Flere undersøgelser har behandlet klonoprindelse og genetisk heterogenitet CRC’er [14], [15]. Ingen har skabt bred enighed fra dette som, selv om man Rapporten konkluderede, at tumorer stammer hovedsageligt fra en enkelt klon [15], resultaterne af andre undersøgelser antydet, at størstedelen af ​​tumorer har en polyklonal oprindelse [16], [17]. For nylig er hele genomet sekventering af matchede primær og metastatisk melanom acral også afsløret betydelige genetiske heterogenitet mellem de primære og metastatiske tumorer, som det fremgår af

de novo

, ikke-synonym enkelt nukleotid variation [18]. Pancreascancer metastaser er også blevet sekventeret for at vurdere de klonale forhold mellem primære og metastatiske cancere, føre til identifikation af klonale populationer, der gav anledning til fjerne metastaser [19], [20]. Det er derfor afgørende at forstå forskellige begreber vedrørende oprindelsen af ​​kræft og den genetiske heterogenitet mellem en primær tumor og dens fjernmetastaser til udvikling af effektive terapeutiske strategier [21], [22].

For at vurdere den polyklonalitet og genetisk heterogenitet i CRC, vi vurderet den genetiske og klonslægtskab mellem primære CRC’er og deres matchede CLMs ved at udføre målrettet exome sekventering og høj opløsning kopi nummer variation (SCNA) analyse af 15 trillinger af normalt kolorektal væv, primær CRC, og matches CLM prøver. Vores resultater giver værdifuld indsigt i den klonslægtskab og genetiske forskelle mellem primære CRC’er og deres matchede CLMs, og vil derfor hjælpe med at definere potentielle mål for systemiske behandlinger.

Resultater

Patient kohorte beskrivelse

den mediane alder af patienter i undersøgelsen var 61 (tabel 1). Kohorten omfattede 1 T2 stadium, 10 T3 fase, og 4 T4 CRC tumorer, som alle er primære resektion prøver. Seks patienter havde enkelt hepatisk metastaser, mens 9 patienter havde to eller flere levermetastaser ved resektion. Klinisk og histo-patologiske oplysninger til kohorte, der bruges i den pågældende undersøgelse i tabel 1.

SCNA analyse

Vi udførte SCNA analyse på 15 trillinger af normalt kolorektal væv, CRC og CLM prøver. Brug af parret analyse (dvs. normal colorektal væv vs. CRC eller normalt colorektalt væv vs. CLM), identificerede vi somatiske SCNAs i enten CRC eller CLM prøver (tabel 2 og figur S1). CRC og CLM par fra 11 patienter viste et tilsvarende antal SCNAs (tabel 2); Men de resterende 4 par (# 250, # 262, # 526 og # 721) viste en betydelig stigning i det samlede antal SCNAs i CLM prøver, især dem, der involverer homozygot kopi tab og tab af heterozygositet (LOH) (tabel 2).

Vi udførte ukontrollerede hierarkisk gruppering af de somatiske SCNA data fra 15 par CRC og CLM prøver for at vurdere den genetiske diversitet mellem de primære og metastatiske CRCs. Uovervåget hierarkisk clustering af SCNA data er tidligere blevet anvendt til at bestemme de genetiske forhold mellem primære og metastatiske cancere [23]. Nærværende analyse er baseret på den antagelse, at genetisk lignende CRC’er og deres matchede CLMs vil være tæt forbundet i hierarkisk klyngedannelse. Fifty-tre procent (8 af 15) af de primære CRCs var nært relateret til deres matchede CLMs, hvilket indikerer klonal og genetisk lighed i disse CRC-CLM par. De resterende 47% (7 ud af 15) af de CRC-CLM-par var kun fjernt beslægtet, hvilket antyder forskellige genetiske forbindelser mellem disse CRCs og deres matchede CLMs (figur 1).

8 CRC-CLM par (53 %), er hvert par nærmest beslægtet i hierarkisk træ (Red); i 7 CRC-CLM par (47%), er hvert par fjernt beslægtede, hvilket indikerer, at primære CRCs og deres matchede CLMs har særskilte genetiske træk (blå). De somatiske mutationer i kræftrelaterede gener nævnes også.

Af note. SCNA mønstre af 8 nært beslægtede par var ens, mens de af de 7 fjernt beslægtede CRC-CLM par var tydelig (figur S2). Vi har også beregnes og sammenlignes det gennemsnitlige antal én kopi gevinster, tab én kopi, høje kopi gevinster, homozygote tab og LOH mellem grupperet og i grupper, CRC-CLM par (figur S3). Grundig sammenligning af hierarkisk klyngedannelse og genetiske ligheder er beskrevet i næste afsnit af resultaterne.

Exome sekventering

Vi udførte hele exome sekventering på 15 trillinger normale kolorektal væv, CRC, og CLM prøver . Anvendelse af en PCR-baseret mikrosatellit assay, bekræftede vi, at alle 15 primære CRC prøver var mikrosatellit-stabile. Mutationer blev detekteret og filtreret i henhold til vores in-house bioinformatik arbejdsgang (Figur S4). I alt blev 1079 og 4366 mutationer identificeret i CRC og CLM prøver (tabel S1). Mutationen spektre observeret i CRC og CLM prøver var i overensstemmelse med tidligere observationer i solide tumorer og var ikke signifikant forskellig mellem CRC og CLM prøver (Figur S5) [24].

Hypermutation og SCNA

Fire CLM prøver (# 250, # 262, # 525 og # 721) blev hypermutated (tabel S2). For at identificere årsagen til hypermutation, vi evaluerede mutationer i DNA-polymerase gener (poln, meningsmåling, POLQ, polh, stang, POLD1 og Polg) og DNA mismatch reparation pathway gener, herunder

MLH1

,

MLH3

,

MSH2

,

MSH6

,

PMS2

,

PMS6

,

ERCC2

,

ERCC5

,

ERCC6

,

MUTYH

,

RAD9A

,

EXO1

,

SLX4

,

ATR

og

BLM

. Resultaterne viste, at kun de fire hypermutated CLM prøver (# 250, # 262, # 526 og # 721) havde en eller flere missense mutationer i DNA-polymerase-generne og DNA fejlparringsreparationsgener (Tabel S3). Disse fire hypermutated prøver viste også en høj grad af SCNAs forhold til deres matchede primære CRCs (tabel 2), og det var særligt bemærkelsesværdigt, at hypermutation signifikant var forbundet med en høj frekvens af LOH (

P

= 2,782 × 10

-9) (Figur 2).

prøver med hypermutation indeholder også høj LOH frekvens (P-værdi = 2.782e-09).

somatiske mutation profiler og væsentligt ændrede veje

Vi fandt, at 2.224 gener havde mindst en ikke-synonym, splejsning, eller rammeskift mutation i CRC’er eller CLMs (tabel S5). Disse data blev derefter anvendt til at undersøge mutationsstatus af de store signalveje ændret i CRC (dvs. de, centreret på P53, Wnt, TGF-beta, og VEGF), ved at sammenligne frekvenser, som er involveret i disse veje gener blev muteret (figur 3). Dette viste, at

APC

var muteret i 73% af både CRC og CLM prøver,

TP53

i 47% af CRC prøver og 67% af CLM prøverne, og

KRAS

i 33% af både CRC og CLM prøver.

Smad4

,

FAT4

, og

BRAF

blev også muteret i CRC og CLM prøver med varierende frekvenser. I VEGF signalvejen, fandt vi mutationer i

KDR

(0% og 27%),

FLT1 Hotel (7% og 7%), og

FLT4

( 0% og 7%) gener af CRCs og CLMs, henholdsvis (figur 3). Mutationer i VEGF pathway gener hovedsageligt begrænset til CLM prøver, det mest slående eksempel på, hvor er den

KDR

gen, som kun var muteret i hypermutated CLM prøver (tabel 3).

evaluering genetiske relationer på grundlag af mutationer og SCNA

at evaluere genetiske relationer mellem de 15 par CRC og CLM prøver, vi vurderet, om de samme genotypeforandringer og mutationer i store kræft driver gener opstået i hvert par. Denne evaluering var baseret på den antagelse, at CRC og CLM par med lignende genetiske ændringer vil sandsynligvis dele mutationer i de store driver gener. I otte tilfælde, CRC-CLM parret gjorde faktisk deler mutationer i centrale CRC-relaterede gener (

APC

,

KRAS

,

TP53

,

Smad4

,

BRAF

, og

FAT4

) (tabel S4). I disse par, blev ingen signifikant forskel observeret i antallet af mutationer mellem CRC og CLM prøver (

P

= 0,28) (tabel 4). Omvendt i de resterende syv tilfælde, ingen af ​​CRC-CLM par delte en mutation i vigtige CRC-beslægtede gener; Men det samlede antal mutationer afveg betydeligt mellem CRC og CLM prøver (

P

0,05) (tabel 4 og tabel S4)

Det er vigtigt, konkordans analyse af. mutation data forenes med dataanalyse i SCNA. Alle CRC-CLM par, som nøje var relateret i ukontrollerede hierarkiske clustering af SCNA data, delte mutationer i centrale CRC-relaterede gener (53%). Men de syv CRC-CLM par, der kun blev fjernt relateret i den hierarkiske gruppering af de SCNA data, delte ikke en mutation i vigtige CRC-relaterede gener (47%).

Alle disse resultater viser at der i 53% af tilfældene, hver CRC-CLM parret havde lignende genetiske ændringer, mens de i de resterende 47% af tilfældene havde tydelige genetiske ændringer.

diskussion

Ved at sammenligne SCNA data og mutation profiler af 15 parrede CRC og CLM prøver, vi fandt, at omkring halvdelen af ​​dem viste genetiske heterogenitet med hensyn til deres tilsvarende primære CRC. Så vidt vi ved, er dette den første omfattende undersøgelse for at bruge genomisk profilering af primære CRC’er og deres matchede metastaser og definere de forskellige funktioner i de metastatiske læsioner i form af deres mutation og SCNA profiler.

Fifty -Tre procent af CRC-CLM par i klynger gruppe delte et højt antal mutationer, herunder nogle i

APC

,

KRAS

,

TP53

, og

Smad4

gener (Tabel 4, figur 1). Tilstedeværelsen af ​​mange fælles mutationer (30-65%), at somatiske mutationer kan akkumuleres i mikromiljøet af en primær kræft, før formidle til deres metastatiske steder, noget almindeligvis betegnes som den lineære progression model af tumor evolution [22]. De resterende 47% af CRC-CLM-par, som blev grupperet uafhængigt af hinanden, viste signifikante forskelle i deres mutation profiler og SCNA data. De havde ingen delte mutationer i kræft indlede gener og ingen signifikante forskelle i SCNA profiler (Figur 1). Den tydelige sammenhæng og fremtrædende genetisk heterogenitet i disse par indikerer, at CLMs kunne stamme fra en gruppe af genetisk forskellige primære CRC-kloner interagerer tæt med polyklonale model af tumor progression.

Seks CRC-CLM par havde somatiske KRAS mutationer i mindst én prøve. Tre par havde de samme KRAS-mutationer, og de tre andre ikke gjorde. Derfor er uoverensstemmelse på KRAS mutation mellem CRC-CLM parrene var 50% (3/6) (figur 1 og tabel S4). Knijn og kolleger [25] rapporterede høje konkordans på KRAS-mutationer mellem primære CRC og CLM tumorer. I modsætning hertil har en række undersøgelser vist høj uoverensstemmelse sats, mellem CRC-CLM par, af KRAS-mutationer der spænder fra 8% -60% [26] – [28]. I vores undersøgelse, blev disse tre CRC-CLM par med uharmonisk KRAS mutation status også grupperet tydeligt af SCNA analyse. Den uoverensstemmelse af KRAS mutation, sammen med tydelige SCNA clustering mønstre, mellem disse CRC-CLM par understøtter vores hypotese om, at primære CRC’er og deres tilsvarende CLMs kan have forskellige klonale oprindelse i disse prøver.

polyklonale tumor progression model kan hjælpe direkte terapeutiske strategier [4]. Den største ulempe ved et monoklonalt tumor oprindelse model er den antagelse, at de fleste af de indledende begivenheder, der førte til den primære kræft vil også findes i de metastaseret celler, som har udsigt over muligheden for, at små populationer af tumorceller med tydelige genetiske karakteristika i nærheden til hinanden, kan være ansvarlig for metastase [4]. Sådanne metastatiske celler, der stammer fra primære tumorer, kan have en forskellig respons på terapi.

Hypermutation forårsaget af tabet af DNA fejlparringsreparationsaktivitet betegnes MSI [29]. Vi fandt, at fire CLM prøver var ustabile mikrosatellitter, hvilket resulterer i hypermutationer.

KDR

gen, en betydelig prognostisk markør i kolorektal cancer [30], blev muteret kun i hypermutated prøver. Det er også bemærkelsesværdigt, at der var en tilsyneladende sammenhæng mellem hypermutation og kromosomal ustabilitet. For nylig, en særskilt kopiantal status af DNA fejlparringsreparationsgenet

MLH1

blev vist at være associeret med forhøjede niveauer af mutation i pancreascancer [31]. Tidligere undersøgelser viste modstridende beviser om MSI tumorer og kromosom ustabilitet i tarmkræft. Nogle undersøgelser rapporteret, at MSS tumorer viser højere kromosom ustabilitet end MSI tumorer [32] – [35]. Andre undersøgelser rapporterede betydelig overlapning mellem MSI tumorer og kromosom ustabilitet [32], [35] – [38]. Notatet blev alle disse undersøgelser udført med primære CRC prøver, og forholdet mellem MSI og kromosom ustabilitet i CLM prøver er endnu ikke afsløret. Vi fandt, at MSI tumorer blev forbundet med et stort antal af gen deletioner /amplifikationer og øget hyppighed af LOH, med andre ord, kromosomal ustabilitet i CLM tumorer. Der kræves yderligere forskning for at afsløre forholdet mellem MSI, kromosom ustabilitet og metastase af primære CRC’er.

Angiogenese reguleres hovedsageligt af interaktioner mellem vaskulære endotel vækstfaktorer og VEGF-receptorer og spiller en central rolle i væksten af ​​kræft og metastaser [ ,,,0],39], [40]. Adskillige undersøgelser har rapporteret den genetiske polymorfisme af KDR-genet implicerer risikoen for sygdomme i kranspulsåren [41], [42]. Men den klar rolle for individuel KDR SNP’er og deres fysiologiske funktioner i kræft progression og prognose forbliver ukendt. I den aktuelle undersøgelse, alle af patienterne med KDR SNP’er (dvs. rs187037 og rs2305948) havde tilbagefald efter kurativ resektion af CRC og leveren (p = 0,925; data ikke vist). Men på grund af lille prøve KDR mutation var ikke statistisk signifikant. Der er behov for et større antal prøver at validere KDR mutation og dens karakteristiske rolle i tumor tilbagefald.

gennemsnitlige overlevelsestid for patienter med metastatisk CRC er steget fra 6-8 måneder til mere end 2 år på grund af den fremkomsten af ​​målrettet behandling og forbedrede kirurgiske resektioner. Ikke desto mindre, at den terapeutiske mulighed for ikke-respondenter oxaliplatin- eller irinotecan-baseret kemoterapi med eller uden cetuximab eller bevacizumab, er meget begrænset. Derfor bedre behandlingsstrategier for metastaserende CRC skal udvikles. En spirende mængde beviser tyder på, at den primære CRC kan præsentere som polyklonale karakter, og at de resulterende metastaser derfor kan have en genetisk forskellig fra størstedelen af ​​den primære tumor. I sådanne tilfælde kan biologi og genetiske profil af den primære tumor være væsentligt forskellig fra metastaser. Dette ville være et vigtigt indsatsområde i målrettet, personlig terapi. Vores resultater tyder på, at mutationelle profiler af ca. 50% af metastatiske levertumorer kan være forskellig fra den primære tumor, hvilket understreger behovet for at evaluere metastatiske sites separat for identifikation af potentielle mål for systemisk terapi.

Materialer og metoder

studiepopulation

Mellem juni 2009 og juni 2011 53 patienter gennemgik helbredende resektion af CRC og levermetastaser ved Gachon University Gil Hospital (Incheon, Sydkorea). Kriterierne for optagelse i dette studie var som følger: (1) nedsat metastase fra CRC bekræftet af spiral abdominopelvic computertomografi; (2) levermetastaser som den første manifestation af M1 sygdom uden nogen dokumenteret dissemineret sygdom, som bestemt ved præoperativ billeddannelse; (3) ingen forudgående historie neoadjuverende chemoradiation eller kemoterapi, herunder molekylær målrettede agenter; (4) helbredende resektion udført for både primære kolorektale og leverlæsioner; (5) de resektion prøver skal være synkrone tumorer (samtidig resektion,

n

= 11; to-trins resektion inden for 6 måneder,

n

= 4); og (6) mikrosatellit stabile primære CRCs. Vi valgte 15 patienter med CRC og matches levermetastaser baseret på disse inklusionskriterier. De grundlæggende karakteristika for de patienter, er vist i tabel 1. Alle tumorer blev revideret af en enkelt patolog, og kun prøver med 70% tumor indhold blev inkluderet i analysen. Studieprotokollerne blev godkendt af Institutional Review Board of Gachon University Gil Hospital (IRB godkendelsesnummer: GIRBA 2535). Skriftligt informeret samtykke var påkrævet fra alle deltagere. Information, såsom køn, alder, tumor fase, blev ekstraheret fra den kliniske database for denne kohorte.

PCR-baseret mikrosatellit assay

Et sæt mikrosatellitmarkører bestående af to mononukleotidbyggeblokken gentagne markører ( BAT25 og BAT26) og tre dinukleotid gentage markører (D2S123, D5S346 og D17S250), som anbefalet af National Cancer Institute Consensus Group, blev anvendt til at bestemme tumor i mikrosatellit instabilitet (MSI) status. Alikvoter indeholdende 50 ng DNA blev amplificeret i 20-pi reaktionsblandinger indeholdende 2 pi 10 x buffer (Roche, Mannheim, Tyskland), 1,7-2,5 mmol /l MgCl

2, 0,3 uM hver primer pair, 250 uM deoxynukleotidtriphosphater og 2,5 U DNA-polymerase (Roche, Mannheim, Tyskland). PCR blev udført med et indledende denatureringstrin på 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cykler af 1 min ved 94 ° C, 1 min ved 55 ° C, og 1 min ved 72 ° C og en endelig forlængelse trin på 10 min ved 72 ° C. Prøverne blev analyseret på en ABI Prism 3100 Genetic Analyzer under anvendelse 0,7 pi amplificeret prøve kombineret med 0,3 pi GeneScan 500 Size Standard og 9 pi Hidi Formamid ifølge producentens retningslinjer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Data blev analyseret ved hjælp af ABI Prism 3100 Dataindsamling software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

dna-ekstraktion, bibliotek forberedelse, og målrettet exome sekventering

DNA blev ekstraheret ved hjælp af en DNeasy Blood Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA). DNA kvalitet blev kontrolleret ved 1% agarosegelelektroforese, og DNA-koncentrationen blev målt under anvendelse af en PicoGreen dsDNA Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). SureSelect sekventering biblioteker blev fremstillet ifølge producentens instruktioner (Agilent SureSelect Alle Exon Kit 38 Mb; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) under anvendelse af en Bravo automatiseret væskehåndteringsudstyr. Kvaliteten af ​​de amplificerede biblioteker blev verificeret ved kapillarelektroforese (Bioanalyzer; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), hvorefter parret-end DNA-sekvenser blev opnået fra bibliotekerne vha Illumina HiSeq platform (Illumina, San Diego, CA, USA).

Bioinformatik analyse

Sequence data blev tilpasset til det menneskelige henvisning genom GRCh37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc/human /index.shtml) ved anvendelse af Burrows-Wheeler aligner [43] med default parametre. Vi sekventeret på gennemsnitlig dybde på 52.44X for målrettede regioner. PCR dubletter blev fjernet under anvendelse af Picard algoritmen (https://picard.sourceforge.net). Vi udførte udretning og kvalitet rekalibrering for de ordnede data ved hjælp af Genome Analysis Toolkit (GATK) [44]. Efter justering, vi brugte Varscan [45], Strelka [46], og Mutect [47] for at ringe mutationer, herunder indsættelser og sletninger (indels), for hver kromosomal position og også brugt GATK [44] for Indel detektion med 15 triplet prøver bestående af normal colorektal væv, primære CRC, og matchede CLMs. Vi kommenteret mutationerne hjælp ANNOVAR [48] med Ensembl Gene annotation database for menneskelige genom bygge 37 (https://www.ensembl.org/) og søgt efter kampe i dbSNP137 (http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/projects/genome/assembly/grc/human/index.shtml), 1000 genomer oplysninger [49], og COSMIC database [50]. Vi filtreret mutationerne fra de målrettede regioner og udvalgte ikke-synonyme, synonym, gevinst eller tab af stopkodonen, rammeskift indels, ikke-rammeskift indels, og splejsning webstedet mutationer.

SCNA analyse

Den enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) array af CytoScan ™ HD (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA) blev anvendt. SCNA analyse af CytoScan ™ HD Array blev udført ved hjælp BioDiscovery Nexus Copy Number 6.1 (https://www.biodiscovery.com/software/nexus-copy-number/) software. Den SNP-Fast Adaptive stater segmenteringsteknik 2 segmentering algoritme blev anvendt med standardparametre.

Clustering

Komplet kobling hierarkisk klyngedannelse blev udført for at vurdere overensstemmelsen mellem de primære CRC og CLM prøver. Gennemsnit og enkelt kobling hierarkisk klyngedannelse blev også anvendt; men alle klyngedannelse metoder gav tilsvarende resultater. Parret

t

-test og to-stikprøve

t

-test blev anvendt til statistiske analyser, og

P

. 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans

data Link

Hele exome sekventering data: Sequence Hent Arkiv (SRA) tiltrædelse nummer er SRP034161

Cytoscan matrix data:.. GEO tiltrædelse nummer er GSE53799

Støtte Information

figur S1.

Workflow til kopi nummer variation (CNV) analyse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s001

(TIF)

Figur S2. Salg SCNA mønstre af CRC-CLM par. Gevinster er repræsenteret i blå, tab i rødt og LOH i brun. 8/15 CRC-CLM grupperede par viste stor lighed i SCNA mønstre i forhold til resten af ​​de 7/15 CRC-CLM i grupper par

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s002

(TIF)

Figur S3.

Gennemsnitlig SCNA frekvenser af grupperede og i grupper, CRC-CLM par. (A) Høj kopi gevinster, homozygote tab og LOH er meget variabel i i grupper, CRC-CLM par. Højt kopiantal gevinster i grupperet CRC-CLM viste også variabilitet. (B) tab et eksemplar i i grupper, CRC-CLM par viste variabilitet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s003

(TIF)

Figur S4.

Workflow for hele exome sekventering analyse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s004

(TIF)

Figur S5.

Mutation spektre af CRC’er og CLMs. (A) Mutation spektrum af CRCs og deres matchede CLMs undtagen hypermutated prøver. (B) Mutation spektrum af fire hypermutated CLM prøver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s005

(TIF)

tabel S1. .

Antal somatiske mutationer i CRC’er og CLMs

doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s006

(DOCX)

tabel S2. .

Antal mutationer i hver CRC-CLM par

doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s007

(DOCX)

tabel S3.

mutationsstatus af DNA mismatch reparation pathway gener og DNA-polymerase gener i CRC’er og CLMs

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s008

(DOCX)

Tabel S4.

Mutationsanalyse overensstemmelse mellem CRC og CLM par. Alle nært beslægtede CRC-CLM par i hierarkiske klyngedannelse delte mutationer i centrale CRC-relaterede gener

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s009

(DOCX)

tabel S5.

Mutationer og muterede gener i CRC’er og CLMs (tabellen er tilvejebragt som Excel-filer)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090459.s010

(XLSX)