PLoS ONE: Meta-Analyser af Microarray Datasæt Identificerer ANO1 og FADD som prognostiske markører for hoved- og halscancer

Abstrakte

hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) transkriptom er blevet profileret i udstrakt grad, alligevel, identificere biomarkører, der er klinisk relevant og dermed med translationel fordel, har været en stor udfordring. Formålet med denne undersøgelse var at bruge en meta-analyse baseret tilgang til katalog kandidat biomarkører med stort potentiale for klinisk anvendelse i HNSCC. Data fra offentligt tilgængelige microarray-serien (N = 20) profilerede hjælp Agilent (4X44K G4112F) og Affymetrix (HGU133A, U133A_2, U133Plus 2) platforme blev hentet og analyseret i en platform /chip-specifik måde (GeneSpring software v12.5, Agilent, USA). Principal Component Analysis (PCA) og klyngedannelse analyse blev udført iterativt for adskillelse outliers; 140 normale og 277 tumorprøver fra 15-serien blev medtaget i den endelige analyse. Analyserne identificeret 181 differentielt udtrykte, overensstemmende og statistisk signifikante gener; STRING analyse afslørede interaktioner mellem 122 af dem, med to store genklynger forbundet af flere noder (MYC, FOS og HSPA4). Validering i HNSCC-specifikke database (N = 528) i The Cancer Genome Atlas (TCGA) identificerede et panel (

ECT2

,

ANO1

,

TP63

,

FADD

,

EXT1

,

NCBP2

), der blev ændret i 30% af prøverne. Validering hos tidligere ubehandlede (gruppe I, n = 12) og efter behandling (gruppe II, N = 12) patienter identificeret 8 gener signifikant associeret med sygdommen (areal under kurve 0,6). Korrelation med tilbagefald /re-gentagelse viste

ANO1

havde højeste effekt (følsomhed: 0,8, specificitet: 0,6) til at forudsige fiasko i gruppe I.

UBE2V2

,

PLAC8

,

FADD

og

TTK

viste høj følsomhed (1,00) i gruppe i, mens

UBE2V2

og

CRYM

blev meget følsom ( 0,8) til at forudsige re-tilbagefald i gruppe II. Endvidere viste TCGA analyse,

ANO1

FADD

, beliggende ved 11q13, blev co-udtrykt ved udskrift niveau og signifikant associeret med overordnede og sygdomsfri overlevelse (

p

0,05). Metaanalysen fremgangsmåde i denne undersøgelse har identificeret kandidat markører korreleret med sygdom udfald i HNSCC; yderligere validering i en større kohorte af patienter vil etablere deres kliniske relevans

Henvisning:. Reddy RB, Bhat AR, James BL, Govindan SV, Mathew R, DR R, et al. (2016) Meta-Analyser af Microarray Datasæt Identificerer

ANO1

FADD

som prognostiske markører for hoved- og halscancer. PLoS ONE 11 (1): e0147409. doi: 10,1371 /journal.pone.0147409

Redaktør: Muy-Teck Teh, Queen Mary University of London, England

Modtaget: 8. oktober, 2015; Accepteret: 4 januar 2016; Udgivet: 25 januar 2016

Copyright: © 2016 Reddy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte informationsfiler

Finansiering:. projektet blev finansieret af indiske Råd for Medicinsk Forskning, Indien (No: 5/8 /10-18 (Oto) /CFP /11-NCD -1). (https://www.icmr.nic.in/). AS modtaget finansiering. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. To af forfatterne er tilknyttet det kommercielle selskab Strand Life Sciences. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Molekylær profilering af tumorer, herunder hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC), har været ansat at forstå mekanismerne i carcinogenese samt de underliggende årsager til behandling modstand. Den stigende globale forekomst af HNSCC sammen med manglen på signifikant forbedring i samlet overlevelse i løbet af de seneste fire årtier, nødvendiggøre nyere tilgange til at forstå de molekylære mekanismer i sygdommen og til at identificere potentielle markører for tidlig påvisning, prognose og som mål for terapi. Molekylær profilering i kombination med patient validering i kræft i prostata, æggestok og bryst har ført til klinisk anvendelse af markør-paneler som Mamma print og Oncotype Dx. [1, 2]. Lignende forsøg på at etablere diagnostiske eller prognostiske molekylære markører i HNSCC for klinisk anvendelse har været undvigende.

High throughput molekylær profilering hjælp af teknikker, som katalogisere forskellene på hele genomet, transkriptom [3] [4] [5], og proteomanalyse [6] niveauer er blevet gennemført i HNSCC. Disse undersøgelser har katalogiseret markører for progression [7] [8] og respons på behandling [9]. Ikke desto mindre, oversættelse af disse markører for kliniske fordele ikke er opnået på grund af de udfordringer, der er forbundet med højkapacitetsmetoder i form af markør udvælgelse og behovet for stor skala patient validering. Disse udfordringer er yderligere forvirrede på grund af problemer såsom betydelig uoverensstemmelse mellem forskellige high throughput undersøgelser, tilskrives forskelle i prøve behandling, type platforme anvendes, og de analytiske algoritmer anvendt [10] [11]. Dette problem er yderligere forstærket i transkriptom undersøgelser primært fordi ændringer udskrift niveau kan variere baseret på scenen, vævsspecifik og rumlige udsving i ekspression af forskellige gener.

Analytiske strategier, der kan udnytte de eksisterende databaser og identificere markører samstemmende tværs af studierne kan være en gavnlig metode til at indsnævre til markører for øget tillid og klinisk anvendelighed. Meta-analyse, med henvisning til en analyse af offentligt tilgængelige datasæt, kunne dermed potentielt muligt at identificere klinisk relevant pulje af markører; mange sådanne undersøgelser er blevet rapporteret i kræft i forskellige steder. Meta-analyse tilgange i bugspytkirtelkræft har ført til identifikation af nye mål og kandidat biomarkører [12]. I prostatakræft, markører kausale til den kræftfremkaldende proces blev identificeret ved hjælp af en lignende fremgangsmåde [13]. Hertil kommer, markører stærkt forbundet med prognose og behandling resultatet forudsigelse i brystkræft [14] [15] blev også identificeret igennem lignende meta-analyse tilgange. Det primære formål med dette studie var at gennemføre en cross-platform, cross-undersøgelse meta-analyse af offentligt tilgængelige microarray datasæt i hoved- og halscancer, identificere markører for biologisk relevans gennem en fælles analytisk pipeline og efterfølgende validere dem i kliniske prøver.

Materialer og metoder

søgekriterier og data Mining

Analyse af de offentligt tilgængelige microarray datasæt blev gennemført som pr retningslinjerne PRISMA [16]. De offentlige databaser, Gene Expression Omnibus (GEO) (NCBI-http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) og Array Express (EBI) [https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress ] blev søgt for tilstedeværelsen af ​​rådata microarray eksperimenter udført i hoved- og halscancer. Den valgte til analyse serien omfattede data fra i) undersøgelser i hoved og hals pladecellekræft patienter ii) undersøgelser, herunder behandling naive patienter og iii) undersøgelser, der udfører global profilering af transcriptomics ved hjælp af høj-density arrays. Undersøgelser /prøver, herunder skjoldbruskkirtlen, oropharynx og nasopharynx blev udelukket fra undersøgelsen på grund af deres forskellige ætiologier. De to platforme, der indgår i analyserne var Affymetrix [Affymetrix Inc., Californien, USA] og Agilent [Agilent Technologies, Californien, USA]. De rå data serien profileret af både platforme blev grupperet baseret på den enkelte teknologi og hver teknologi (enten platform) blev inkluderet i analysen, hvis mindst 2 serier var tilgængelige i databasen. Den generelle arbejde flow fulgte den trinvise protokol foreslået af Ramasamy

et al

til udførelse af meta-analyse [17]. Den grundlæggende arbejde algoritme er detaljeret beskrevet i figur 1.

De offentligt tilgængelige rå microarray data for hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) serien blev hentet og grupperet og analyseret i Genespring statistisk software. Normalisering blev udført på prøverne, som derefter blev opdelt i tumor og normal før udførelse genniveau eksperimentet. Principal Component Analysis (PCA) blev udført for at fjerne de diskordante prøver. Fold forandring og

s Drømmeholdet værdi blev beregnet for at opnå de betydelige gen enheder. Disse statistisk signifikante enheder blev anvendt til yderligere analyse; database anmærkninger (Gene ontologi, STRING og miRWALK) og patient validering (Eksperimentel validering af Quantitative Real Time PCR (qPCR) og The Cancer Genome Atlas (TCGA)).

Dataanalyse Brug Gene Spring

de rå datafiler er anvendt til analyse omfattede .CEL (Affymetrix platform) og TXT (Agilent) filer. Meta-analyse blev udført ved hjælp af Gene foråret software (https://genespring-support.com) [v12.5, Agilent, Californien, USA]. De rå data vedrørende hver chip blev uploadet på softwaren, hvor prøverne blev baseline transformeret og normaliseret ved Robust Multi-array analyse (RMA) i Affymetrix eller 75

percentil i Agilent platforme (én farve). De enkelte eksempelfiler blev derefter klassificeret i “normale” og “tumor” og re-analyseres som et enkelt forsøg. Genniveau eksperimentelle data (gennemsnit af alle prober kortlægning til det samme probe ID) blev dannet og kvalitetskontrol blev udført ved anvendelse Principal Component Analysis (PCA) i GeneSpring. Prøverne, der var store udsving i PCA parceller blev fjernet og klyngedannelse udført efterfølgende at sikre en klar lagdeling mellem de to kategorier af prøver (Normal og tumor). Processen blev udført med flere iterationer for at opnå en raffineret separation. Fold forandring analyse blev derefter henrettet på prøverne hvorefter uparrede

t

-test (ulige varians) blev udført for at opnå betydelige gen enheder.

s

-værdi beregning (asymptotisk) og multipel testning korrektion (Benjamini Hochberg FDR) blev yderligere udføres for at opnå gen enheder med

s

-værdi 0,05 og fold ændring (FC) af 2.0. Indbygget pathway analyse blev udført ved hjælp af den identificerede gen listen. Den betydelige gen listen og veje på tværs af de forskellige teknologier Affymetrix blev sammenlignet ved hjælp af gen-symbol /pathway navne som en identifikator. Den individuelle gen enhed liste fra hver teknologi blev udvundet fra Genespring software og eksporteres til excel filer. De overensstemmende gen enheder samt fælles veje blev identificeret på tværs af teknologier ved hjælp af Microsoft Access (Microsoft Inc. WA, USA). Lignende tilgang til at identificere alle de fælles gener og veje på tværs af de to platforme af Affymetrix og Agilent (figur 1).

Funktionel Annotation Brug af flere web Ressourcer

overensstemmende gen liste tværs af de forskellige platforme blev analyseret i de forskellige web ressourcer til at vurdere funktionelle klasser, protein-protein interaktioner og miRNA rettet generne. Gene ontologi Analyse blev udført ved hjælp af PANTHER (Protein Annotation gennem Evolutionary Relationship) klassifikationssystem (https://www.pantherdb.org/) [18] til at evaluere de funktionelle klasser af generne. STRING database (STRING v9.1) (http: //string-db.orgnewstring_cgi) [19] blev anvendt til at forudsige og katalogisere protein-protein interaktioner mellem de overensstemmende gener. De miRNA, der er målrettet disse gener blev undersøgt ved hjælp af miRWalk2.0 database (https://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html) [20].

Patient baseret Validation

overensstemmende gen listen blev også krydse sammenlignes med TCGA database (https://www.cbioportal.org) [21] for deres mutation, kopiere nummer variation (CNV) og mRNA-ekspression status. Den betydelige gen panel identificeret blev også vurderet for deres co-ekspression data, samlet og sygdomsfri overlevelse i sammenhæng med deres ekspressionsmønstre i TCGA kræft studier (hoved og hals Pladecellekræft, Foreløbig, N = 528 prøver)

validering af udvalgte gener blev også udført i HNSCC patienter, der anvender kvantitativ real time PCR. Undersøgelsen blev godkendt af Narayana Hrudayalaya Hospitaler Institutional Review Board [NH /IRB-CL-2012-058]. Kirurgiske prøver af patienter blev udvalgt fra bio repository af hoved og hals Oncology afdeling, Mazumdar Shaw Medical Center, Bangalore. Alle prøver blev opsamlet efter skriftligt informeret samtykke. Tidligere ubehandlede og tilbagevendende patienter diagnosticeret med HNSCC af alle websteder (ekskl skjoldbruskkirtlen, oropharynx og nasofarynx) og stadier i løbet af perioden marts 2010 til 2014, med oplysninger om opfølgning, blev inkluderet i undersøgelsen. Den normale vævsprøver blev indsamlet fra raske frivillige under tandudtrækning efter skriftligt informeret samtykke. De demografiske, kliniske og patologiske data for de patienter, blev indhentet fra de elektroniske patientjournaler og patienterne blev fulgt i en periode på 2 år.

Patienterne blev kategoriseret baseret på deres humant papillomvirus (HPV) status som identificeret ved p16 immunhistokemi ved anvendelse af etablerede protokoller. Formalin faste paraffin indlejrede sektioner af patienterne blev indsamlet fra afdelingen for patologi i centrum. Kort beskrevet tumorsnit (5 mikron) blev de-paraffinised og behandlet med 3% hydrogenperoxid for at stoppe endogen peroxidaseaktivitet. Snittene blev inkuberet med det primære antistof (anti-p16, Biogenex, Fremont, CA, USA) og efterfølgende detektion blev udført under anvendelse af peberrodsperoxidase (HRP) systemet ifølge producentens instruktioner (Dako REAL

™ EnVision

™ Detection System, Danmark). Sektioner behandlet på lignende måde, men uden det primære antistof blev taget som negative kontroller. Den scoring af de farvede objektglas var som pr etablerede studier [22]. Objektglassene blev vurderet ved anvendelse af lysmikroskopi og bedømt på en 0-3 skala under hensyntagen procent positivitet og intensiteten af ​​farvning; 0 (fuldstændigt fravær af tumor-farvning), 1 (svag farvning af tumorceller), 2 ( 50% tumorer celler farvet med moderat intensitet) og 3 ( 50% tumor farvning med moderat /intens farvning)

.

Marker Profilering for Validering af Quantitative Real Time PCR (qPCR)

RNA blev ekstraheret fra prøverne, arkiveres i RNA Senere (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA), ved hjælp af TRIZOL reagens (Sigma Aldrich , MO, USA) og behandlet med DNase (Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) og vurderet for kontaminering ved polymerasekædereaktion (PCR). Integriteten og kvaliteten af ​​RNA blev konstateret ved gelelektroforese og ratio 260/280. 1 pg af RNA (260/280: 1,8-2,0) omdannet til komplementær DNA ved højkapacitets cDNA Conversion kit (Applied Biosystems, CA, USA) i henhold til fabrikantens anvisninger. De udvalgte markører blev profileret anvendelse af specifikke primere, der er anført i S1 Bord og alle primere blev evalueret for specificitet ved hjælp Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analyse (National Center for Biologisk Information, NLM, US). Den qPCR effektivitet blev vurderet ved hjælp af hældningen af ​​den lineære regressionsmodel som pr standard protokoller. Cp blev målt på tværs af flere serielle fortyndinger af hver cDNA til opnåelse standardkurven og den tilsvarende hældning. Virkningsgraden beregnes ved hjælp af formlen, Efficiency = 10

(- 1 /hældning). Alle real time PCR reaktioner blev udført i triplikater under anvendelse af Roche Light Cycler 480 real time PCR-system (Roche Diagnostics, Germany) eller ABI Step One Real Time Machine (Applied Biosystems, CA, USA) under anvendelse af Kapa SYBR Green PCR Master Mix ( Kapa Biosystems, MA, USA). De termiske cyklusbetingelser var 50 ° C i 2 minutter efterfulgt af en indledende denatureringstrin ved 95 ° C i 10 minutter, 45 cykler ved 95 ° C for 30s, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 30 sek. Forsøgene blev udført i triplikat for hvert datapunkt. Overgangsstedet (Cp) og den efterfølgende analyse blev udført under anvendelse af anden afledede max metode i softwaren (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz). Alle reaktioner blev bekræftet for deres specificitet ved at smelte kurve analyse af prøven og det ikke-target-kontrol (NTC). Et sæt (N = 4) af reference- gener [(glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (

GAPDH

), 60S sure ribosomale protein P0 (

RPLP0

), 18S ribosomal ribonukleinsyre (

18SRNA

) og β-glucuronidase (

GUS

)] blev vurderet ved hjælp af RefFinder [23] i en delmængde af patienten kohorte (N = 26) og to af de bedste reference Gener (RGS) blev udvalgt til yderligere analyse. den relative ændring i ekspression blev vurderet ved anvendelse af geometriske gennemsnit af de valgte referencestoffer gener [24]. udtrykket i normale prøver tjente som kalibrator.

statistiske metoder Salg

statistisk analyse blev udført under anvendelse STATA11.1 (College Station, TX, USA). Receiver Operating karakteristik (ROC) kurve analyse blev anvendt til at evaluere forudsigelseskraft af hver af biomarkører, den optimale cut punkt, gav den maksimale følsomhed og specificitet var bestemt for hver biomarkør. ROC-kurver blev derefter afbildet på grundlag af det sæt af optimale sensitivitet og specificitet værdier. Areal under kurven (AUC) blev beregnet via numerisk integration af ROC kurver. Den biomarkør, der har det største areal under ROC-kurven blev identificeret som havende det stærkeste association med forekomsten af ​​hoved og hals tumor. Følsomheden og specificiteten af ​​sammenslutningen af ​​markørerne med tilbagefald /re-recidiv blev analyseret ved hjælp af klinisk lommeregner (https://vassarstats.net/clin1.html~~number=plural).

Resultater

Data Mining

Baseret på de søgekriterier, data mining af de forskellige databaser identificeret i alt 42 serier [Affymetrix platform: N = 32, Agilent: N = 10]. Efter yderligere filtrering af data baseret på inklusionskriterierne og eksklusionskriterier, blev 18-serien fra Affymetrix og to fra Agilent indgår i undersøgelsen (tabel 1). Den teknologi og chips, der var uforenelige med den analytiske pipeline og hvor kun én serie var tilgængelige, blev udelukket fra undersøgelsen. Det samlede antal analyserede prøver var 667 tumorer og 271 normal. Den Affymetrix platformen omfattede i alt 246 normal og 629 tumorer (U133 plus 2,0: N = 207, T = 419; U133A chip: N = 19, T = 147; U133A_2: N = 20, T = 63), mens Agilent platformen (4X44K G4112F) omfattede 25 Normal (N) og 38 tumor (T). Den sub sites undersøgt i den valgte serie var mundslimhinden, tunge, larynx, svælg, og alveolen og retro-molær trigone. De normale prøver var fra gingivobuccal sted i alle serier. Serien fra hver chip i hver platform blev analyseret separat ved hjælp af Gene forår analyse software og som pr den analytiske rørledning til at identificere de overensstemmende gen enheder lister.

Analyse på tværs af en enkelt platform.

i Affymetrix platform, blev 18 serier analyseret, som omfattede undersøgelser udført på U133 plus 2 (N = 13), U133 A_2 (N = 2) og U133A (N = 4) chips; i en af ​​de serier, blev data analyseret under anvendelse af to forskellige chips (tabel 1). Fem serier af U133 plus to blev udelukket, da prøverne var outliers under PCA og klyngedannelse; i alt 373 prøver blev inkluderet i den endelige analyse (N = 122, T = 251). Den statistisk signifikante gen liste med en FC 2,0 og en

s

-værdi på 0,05 blev anvendt til yderligere analyse. I alt 12.079 gener blev identificeret efter analyserne af U133 plus 2,0, mens 4134 blev identificeret fra U133A og 3438 gener gen fra U133A_2. Microsoft adgang analyse på tværs af disse gen lister afslørede en liste over 965 gen enheder, hvoraf 64,46% (N = 622) enheder er overensstemmende på tværs af de 3 chips (585 op regulerede og 37 ned reguleret) (S1A File) og 35,54% (N = 343 ) af generne viste forkerte tendenser i reguleringen. Ligeledes en vurdering af overensstemmelsen og uoverensstemmelse i regulering udført på tværs af teknologier viste forskellige tendenser (U133 Plus 2 Vs U133A Concordance = 76,53%, U133 Plus 2 Vs U133A_2 Concordance = 58,27%, U133A Vs U133A_2 Concordance = 86,11%).

de fælles veje på tværs af teknologier blev identificeret ved sammenligning af deres individuelle pathway lister. Listen (N = 54) blev derefter sorteret baseret på den procentdel af matchede enheder i forhold til det samlede antal pathway enheder. Tyve én veje blev identificeret med 30% eller mere matchede enheder i alle de 3 teknologier, blandt hvilke et flertal af dem er cellecyklus relaterede veje (S1B fil).

I Agilent platform (4x44k G4112F), 2 serie, hvorfra i alt 44 prøver (N = 18, T = 26) blev inkluderet i den endelige analyse i alt 8493 gener (op og ned reguleret) blev identificeret fra analysen (FC 2,0;

p

0,05); 338 af dem er meget signifikant (

s

0,001) med høj fold ændre forskelle (FC 25 gange). Anvendelse af en afskæringsværdi på 50% af matchede enheder fra det samlede antal enheder, blev 43 veje identificeret. De væsentligste veje ( 65% af matchede enheder) identificerede var inflammatorisk respons og ekstracellulær matrix organisation (ECM) (S1c og S1D fil)

Cross-platform Analyse

Listen.. af gener almindeligvis identificeret mellem de to platforme afslørede i alt 402 gener (

s

0,05 og FC 2,0), hvoraf 181 (45,03%; 13 ned reguleret og 168 op reguleret) var overensstemmende og 221 (54,97%) uharmonisk i reguleringen tendens. Den samstemmende liste over 181 gener findes i S2A Filer. Gene ontologi analyse foretaget for dette gen listen i databasen PANTHER for klassificeringen af ​​de gener, viste, at i de molekylære funktioner, bindingen kategori (GO: 0.005.488) viste maksimal repræsentation (28,5%, N = 49) med protein og nukleinsyre syre bindingsmolekyler der er de vigtigste komponenter. Ligeledes i biologiske processer, det cellulære (GO: 0.009.987; 20,10%, N = 75) og metaboliske proces (GO: 0.008.152, 18,8%, N = 70) var et flertal. 24.40% af de cellulære komponenter var celle dele (GO: 0.043.226) og ekstracellulære regioner (GO: 0.005.576). De fleste af de protein klasser identificeret var transportører (PC00227) (9,30%; N = 21) og receptorer (PC00197) (8,40%; N = 8) (S1A Fig)

De fælles veje (N. = 16) blev identificeret på tværs af de to platforme med MS Access. De væsentligste veje identificerede var dem i forbindelse med cytoskelet adfærd, kolesterol biosyntesen og IGF transport ( 70% matchede enheder på tværs af platforme). Oncostatin M signalering og Focal Adhæsion var de andre betydelige veje, der blev dysreguleret ( 25% matchede enheder på tværs af platforme). (S2B fil)

STRING database analyser identificeret et netværk af interaktioner mellem 122 gener fra overensstemmende liste . Den største interaktion netværk bestod af to store indbyrdes forbundne grupper med FBJ Murine osteosarkom Viral Oncogene Homolog (FOS), fibronectin 1 (FN1), cyklin-afhængig kinase 1 (CDK1), Heat shock 70 kDa protein 4 (HSPA4) og V-Myc Avian Myelocytomatosis (MYC) er knudepunkterne i forbindelse (figur 2). Den samstemmende liste, når yderligere analyseret for at identificere de eksperimentelt validerede gen mål for miRNA udtryk fra miRWalk2.0 databasen, to store familier af miRNA [

lad

(N = 17) og

mir

( N = 47)] blev identificeret, som målrettet mere end 5 gener fra listen (S3 File).

Analyse for protein-protein interaktion med STRING netværk identificeret to store sammenhængende klynger med høj grad samspillet mellem gener ( N = 122). Disse 2 store klynger indbyrdes forbundet ved knudepunkterne MYC, fn1, FOS og HSPA4. Antallet af linjer repræsenterer niveauerne af beviser, som angivet i farven legende. De forskellige størrelser af knudepunktet er baseret på omfanget af protein strukturel information til rådighed for hvert gen, mens farverne på knudepunktet er et visuelt hjælpemiddel, der anvendes til bedre repræsentation. Markørerne fra denne analyse udvalgt til patient validering er omringet.

TCGA Database og eksperimentel validering af generne i HNSCC Patienter

181 gen listen var kryds i forhold til TCGA databasen ( https://www.cbioportal.org) for at vurdere mutationen, kopiere nummer og mRNA udtryk status i hoved- og halscancer kohorte (N = 300). I alt 59 gener blev ændret i mindst 10% af patienterne, mens en undergruppe af 6 gener [(epitelcelle Transforming gen 2 (

ECT2)

, Anoctamin en

(ANO1)

, Tumor Protein P63

(TP63)

, Fas associeret Via Død domæne

(FADD)

, Exostosin-1

(EKS1)

og nuklear Cap Bindende proteinunderenheden 2

(NCBP2

)] blev ændret i mindst 30% af prøverne på mutation /CNV og mRNA-niveauer (S3 Fil og S1B Fig). de 20 gener baseret på de procentvise ændringer i TCGA er opført i tabel 2.

Eksperimentel validering ved hjælp af kvantitativ real time PCR (qPCR) blev udført i alt 34 prøver, herunder primære ubehandlede tumorer (gruppe i, N = 12), tilbagevendende prøver (gruppe II; . N = 12) og raske normale kontroller (N = 10) Størstedelen af ​​prøverne i patientens kohorte (N = 24) var mænd (75%, N = 18) og fra mundhulen sub websted (83,3%, N = 20) med avancerede stadie IV kræft (62,5%;. N = 15) Størstedelen af ​​patienterne var over en alder af 40 år (95,8%; N = 23) og 79,2% var enten rygere, tyggere eller alkohol forbrugere (N = 19). Patienterne i den primære kohorte enten gennemgik stråling efter operation eller havde ingen adjuverende behandling. Fem af disse patienter udviklede recidiv i løbet af opfølgning, mens tre var sygdomsfri (Fire patienter blev tabt for opfølgning) (S2 tabel). I den tilbagevendende kohorte, patienterne gennemgik kemoterapi og strålebehandling før den kirurgiske behandling

Generne for validering blev udvalgt fra 181 gen liste baseret på flere kriterier.; ned reguleres mere end 5 gange i 2 teknologier [Placenta-Specific 8 (

PLAC8

) og crystallin, Mu (

CRYM

)], knudepunkter i det String databasen (

FOS

,

TTK

, ubiquitinkonjugerende enzym E2 variant 2 (

UBE2V2)

Centrosomal Protein 55 kDa (

CEP55

)] og delmængde af gener med ændringer i mindst 30% af patienterne (mutation, CNV og udtryk) (

ECT2

,

ANO1

,

FADD

) i TCGA database. Alle primerne, når valideret viste en effektivitet der spænder fra 1,9 til 2,1 med den procentvise effektivitet er 93% til 110% (S2 fig). Analyse af RefFinder viste, at blandt de reference- gener vurderes,

RPLP0

18SRNA

blev evalueret som den mest stabile ( Geometrisk gennemsnit af ranking værdier:

RPLP0

: 1,19,

18SRNA

: 1,41,

GAPDH

: 3,0 og

GUS

: 4,00) efter analyse af multiple software (Delta CT, geNORM, Normfinder og Bestkeeper) (S3 fig). qPCR validering af de udvalgte gener (N = 9) blev derefter udført under anvendelse af relative kvantificering under anvendelse af det geometriske gennemsnit af to referencepunkter gener.

markørerne viste lovgivningsmæssige tendenser i begge grupper svarende til dem, der opnås fra meta-analyse (fig 3A-3D). Seks af de gener, viste mere end 70% validering i prøverne vurderes;

PLAC8

(91,67),

UBE2V2

(87,5%),

ECT2

(72,2%),

FADD

(69,5%),

CEP55

(69,5%) og

TTK

(76,2%). Vurdering af valideringen status i de to kohorter viste, at mens alle generne blev valideret over 60% i gruppe I, viste kun 4 gener en lignende validering i gruppe II (

PLAC8

,

CRYM

,

ECT2

UBE2V2

). ROC analyse af markører i Kohorte 1 viste, at

PLAC8 Hotel (AUC: 0,89),

FOS

(AUC 0,82),

ANO1 Hotel (AUC: 0,81) og

UBE2V2

(AUC: 0,82) havde den højeste association med sygdommen (fig 3E-3H)

Kvantitativ genekspression profilering af de udvalgte markører blev udført i gruppe i (primær, A). og gruppe II (tilbagevendende, B) kohorte.

PLAC8

og

UBE2V2

blev valideret i alle prøver (100%) af gruppe I med hensyn til regulering tendenser mens andre gener viste lignende tendens i 60% af prøverne. I gruppe II, 60% af patienterne udviste overensstemmende tendenser regulering i fire gener. Baseret på patientens opfølgning koncernen var jeg underopdelt i ikke-tilbagevendende (C) og tilbagevendende (D) og udtrykket blev yderligere vurderet. ROC kurve analyse i gruppe I patienter viste, at

PLAC8

(E),

FOS

(F),

ANO1

(G) og

UBE2V2

(H) havde højest association med sygdommen (AUC 0,8). Søjle repræsenterer medianen gange ændring af Normals.

Vurdering af HPV-status, ved hjælp p16 som surrogatmarkør, indikerede, at blandt patienten kohorten med tilgængelige prøver (n = 20), havde 12 patienter svag eller ingen farvning, medens resten havde moderat /stærk farvning af p16 (N = 8) (S4A-S4D fig). Korrelation af generne med HPV status (med HPV score på 2-3 betragtes som positive), viste, at den samlede ekspressionsmønster af markørerne ikke viser nogen sammenhæng med HPV status. Individuelle analyser viser, at blandt de markører, kun

FADD

viste en forening med HPV positivitet; større procentdel af patienterne (83%) med svag eller ingen farvning af HPV viste høj ekspression af

FADD

sammenlignet med patienter positive for HPV. (57%; p = 0,03) (S4E Fig)

Korrelation af Marker Profile med behandlingsresultat

de markører blev korreleret med behandlingsresultater (tilbagefald i gruppe i og re-gentagelse i gruppe II).

ANO1

viste den bedste effekt (følsomhed: 0,83, specificitet: 0,67) til påvisning af patienter, der ikke behandling i kohorte 1.

ANO1

også viste en 3 gange stigning i median fold udtryk i tilbagevendende kohorte (4/5) i gruppe i i forhold til ikke-tilbagevendende kohorte.

ECT2

(0,83),

FADD

og

UBE2V2

(1) viste også høj følsomhed i Gruppe I. I Gruppe II 7/9 (

UBE2V2

,

CRYM

,

FADD

,

CEP55

,

PLAC8

,

TTK

FOS)

viste høj følsomhed (0,67 på 1) at opdage behandlingssvigt. De andre markører viste lav følsomhed og specificitet (S3 tabel) i begge grupperne.

HPV positivitet blev en god prognosticator i den samlede kohorte med 37% (3/8) viser behandlingssvigt sammenlignet med 63% ( 7/11) i negative patienter. Men i kombination med FADD, den eneste markør, der viste signifikant association med HPV-status, viste en høj procentdel af behandlingssvigt (60%, 6/10), FADD

høje /HPV patienter sammenlignet med FADD

lav /HPV + patienter (33%, 1/3).

Blandt disse gener, kun

ANO1

FADD

viste signifikant sammenhæng med den samlede overlevelse (OS) og sygdomsfri