PLoS ONE: Insulin, CCAAT /Enhancer proteiner og laktat Reguler menneskelige 11β-hydroxysteroiddehydrogenase Type 2 genekspression i Colon Cancer Cell Lines

Abstrakt

11β-hydroxysteroid dehydrogenaser (11beta-HSD) modulere mineralkortikoid receptor transaktivering med glukokortikoider og regulere adgangen til glukokortikoid-receptoren. Isozymet 11beta-HSD2 udtrykkes selektivt i mineralocorticoid målvæv og dets aktivitet er reduceret i forskellige sygdomstilstande med unormal natriumretention og hypertension, herunder den tilsyneladende mineralkortikoid overskud. Som 50% af patienter med essentiel hypertension er insulinresistente og hyperinsulinæmisk, vi hypotese, at insulin nedregulerer 11beta-HSD2 aktivitet. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at insulin reducerede 11beta-HSD2 aktivitet i kræft kolon cellelinier (HCT116, SW620 og HT-29) på det transskriptionelle niveau, i et tidsrum og dosisafhængig måde. Nedreguleringen var reversibel og krævede nye proteinsyntese. Pathway-analyse under anvendelse mRNA profilering afslørede, at insulinbehandling modificeret ekspression af transkriptionsfaktoren familie C /EBPs (CCAAT /enhancer-bindende proteiner), men også af glycolyse beslægtede enzymer. Western blot og real time PCR bekræftede en opregulering af C /EBP beta isoformer (LAP og LIP) med en mere udtalt stigning i den hæmmende isoform LIP. EMSA og reportergenassays demonstrerede rolle C /EBP beta isoformer i HSD11B2 genekspression regulering. Desuden sekretion af lactat, et biprodukt af glycolyse, viste sig at mediere insulinkrævende HSD11B2 nedregulering. Sammenfattende viser vi, at insulin nedregulerer HSD11B2 gennem øget LIP udtryk og augmented laktat sekretion. Sådanne mekanismer er af interesse og potentielle betydning for natrium reabsorption i tyktarmen

Henvisning:. Andrieu T, Fustier P, Alikhani-Koupaei R, Ignatova ID, Guettinger A, Frey FJ, et al. (2014) Insulin, CCAAT /Enhancer proteiner og laktat Reguler menneskelige 11β-hydroxysteroiddehydrogenase Type 2 genekspression i Colon Cancer Cell Lines. PLoS ONE 9 (8): e105354. doi: 10,1371 /journal.pone.0105354

Redaktør: Jaap A. Joles, University Medical Center Utrecht, Holland

Modtaget: 24. maj 2013; Accepteret: 23, 2014 Udgivet: 18 August, 2014

Copyright: © 2014 Andrieu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Schweiziske Foundation for Videnskabelig Forskning Nr. 3100-122135, 3100 til 61505,00, 3100A0-102153 /1 og 3100A0-138670 (BMF FJF). Nationale centre for Kompetence i forskning (NCCR), TransCure (FJF). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mineralcorticoidreceptoren (MR) er afgørende for renal natrium håndtering i epitelvæv såsom tyktarmen og nyre og for blodtrykskontrol hos mennesker. Den fysiologiske ligand af MR er aldosteron [1]. En anden adrenal steroid, cortisol, udviser en lignende affinitet og transaktivering potentiale for MR som aldosteron. Serumkoncentrationer af cortisol er 100 til 1000 gange højere end aldosteron. Mekanismen tillader aldosteron at være den foretrukne ligand for MR

in vivo

trods de højere koncentrationer af cortisol er et enzym, som inaktiverer cortisol, specielt i MR udtrykkende celler [2]. Dette enzym, 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (11beta-HSD2) kodes af den HSD11B2 genet og omdanner biologisk aktivt cortisol i cortison, et steroid med ubetydelig affinitet og aktivering potentiale for MR [3]. Således er en reduceret aktivitet af 11beta-HSD2 forårsager cortisol-medieret MR-aktivering, hvilket fører til nedsat natriumretention, suppression af renin og et salt-følsomme blodtryksstigning [4], [5]. Salg

Mange patienter med type 2-diabetes har lav renin-aktivitet i plasma og er saltsensitiv [6] – [8]. Desuden har vi for nylig observeret en sammenslutning af salt-følsomhed og nedsat aktivitet af 11beta-HSD2 i afkom af type 2 diabetes patienter [9]. Således er det rimeligt at spekulere, at insulin nedregulerer HSD11B2, og ved denne mekanisme, forårsager cortisol-medieret nyre- eller colon natriumretention med deraf følgende renin undertrykkelse.

Det er vist, at, at insulin og hyperinsulinæmi regulere familien af transskription faktorer CCAAT /forstærker bindende proteiner (C /EBPs) [10], [11], og at medlemmer af denne familie kontrol transskription af HSD11B1 [12] – [14]. Analysen af ​​promotoren af ​​HSD11B2 genet ved transkriptionsfaktoren database (TRANSFAC) programmet afslørede flere formodede bindingssteder for C /EBPs ved positionerne -4362 bp, -1985 bp, -177 bp og ved -198 bp fra transkriptionelle start websted af humant HSD11B2 gen. Derfor vi hypotese, at insulin nedregulerer HSD11B2 gennem C /EBPs.

Materiale og metoder

Reagenser og forsyninger

Cell kultur materiale var fra Becton Dickinson Labware (Basel, Schweiz) og Corning (Bodenheim, Tyskland). Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og Mc Coy s blev indkøbt fra Sigma Chemicals (Buchs, Schweiz). Føtalt bovint serum (FBS) var fra Biochrom AG (Berlin, Tyskland). Insulin, cycloheximid (CHX), PD098059, Sodium dichloracetat (DCA), Sodium L-lactat og 5,6-dichlorbenzimidazol 1β-D-ribofuranosid (DRB) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Fluka AG, Buchs, Schweiz). Følgende cellelinier blev indkøbt fra ATCC (Manassas, VA): human carcinom cellelinie colon HT-29 (accession nummer: HTB-38), SW-620 (CLL-227), HCT116 (CCL-247) og JEG-3 (HTB-36). Akt Inhibitor VIII var fra Calbiochem (Merck, Zug, Schweiz). Adenosin 5′-trifosfat [gamma

32P] ([gamma

32P] ATP) var fra Perkin Elmer (Maanstraat, Holland).

Cell Cultures

HCT116, SW-620 og HT-29 blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS, 2 mmol /l glutamat, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellerne blev holdt ved 37 ° C i befugtet 5% CO2-95% luft. Alle cellelinier blev udpladet i celle dyrkningsskåle og dyrket i DMEM 10% FBS til konfluens. Celler blev inkuberet i DMEM suppleret med 0,3% FBS i insulin og DCA behandling. Celler blev behandlet 48 h med DCA og 24 timer med insulin. Celler blev inkuberet med 10% FBS under lactat behandling efter 24 timer synkronisering i DMEM 0,3% FBS.

RNA-fremstilling og ekspressionsniveauet

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse RNeasy Mini Kit (Qiagen AG, Basel , Schweiz) ifølge fabrikantens protokol. Totalt RNA (1 ug) blev anvendt til syntese af første streng cDNA under anvendelse af Improm-II revers transkriptase (RT) i RT puffer (Promega Catalys AG, Wallisellen, Schweiz) ifølge fabrikantens protokol. Ekspression af specifikke mRNA blev bestemt ved kvantitativ realtids-RT-PCR (QRT-PCR) på en ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Multiplex PCR blev udført i overensstemmelse med producentens protokol (Applied Biosystems, Foster City, CA). Assays-on-Demand (Gene Expression Assay Mix) blev eukaryote 18S rRNA endogene kontrol (4310893E), HSD11B2 (Hs00388669_m1), CCAAT /enhancer binding protein (C /EBP) alpha (Hs00269972_s1), C /EBP beta (Hs00270923_s1) og C /EBP delta (Hs00270931_s1). Relativ genekspression blev bestemt ved hjælp af den komparative CT (tærskel cyklus) metode, som består af en normalisering af antallet af mål gen kopier til et endogent henvisning gen (18S rRNA), der er udpeget som kalibrator. Niveauet af HSD11B2, C /EBP alpha, C /EBP beta og C /EBP delta-mRNA-ekspression af hver af de behandlede celler blev normaliseret til den opnået fra ubehandlede celler resultat. Mængden af ​​mål normaliseret til 18S rRNA endogene henvisning er givet ved formlen: 2

-ΔΔCT. For at bekræfte reproducerbarheden af ​​mRNA bestemmelse, blev mindst 3 uafhængige total RNA-ekstraktioner udføres. Hver revers-transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR) assay blev analyseret i tre eksemplarer og udtrykt som gennemsnit +/- SD.

Måling af 11beta-HSD2 aktivitet

Celler blev dyrket i 6- brøndsplader med en tæthed på 0,5 x 10

6 celler /brønd. Efter behandling blev dyrkningsmediet fjernet, og cellerne blev inkuberet i 45 min i 1 ml medium indeholdende 2 uCi af [1,2,6,7-

3H] Cortisol (60-80Ci /mmol, Amersham, Buckinghamshire, UK) i 6-brønds plader. Efter inkubation blev reaktionen standset og steroiderne blev ekstraheret ved tilsætning af tre volumener ethylacetat. Efter centrifugering blev den organiske fase fjernet og inddampet ved stuetemperatur. Resten blev rekonstitueret i 30 pi stopopløsning (2 mM cortisol og 2 mM cortison i methanol). Ti mikroliter blev anvendt på silica-coatede TLC-plader (G-25, UV254, Macherey-Nagel, Oensingen, Schweiz) og løses ved hjælp af chloroform: ethanol (09:01). Steroider blev visualiseret under ultraviolet lys og blev skrabet over i scintillationsfluid. Radioaktiviteten blev målt ved anvendelse af en Packard 2000CA Tri-Carb Liquid Scintillation Analyzer (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL). Eksperimenter blev udført under ikke-substrat-begrænsende betingelser, hvor metabolisme var altid mindre end 40%. Specifik aktivitet blev udtrykt som picomol (pmol) pr mikrogram protein per time. De eksperimentelle resultater blev beregnet ved at udtrykke omregningskurserne for cortisol til cortison i tilstedeværelse af insulin, som en procentdel af det i den tilsvarende kontrol i fravær af insulin [15].

Western blot-analyse

proteinekstraktion og Western blot-analyser blev udført som rapporteret tidligere [16]. Kort fortalt blev kerneekstrakter isoleret med CelLytic Nuclear Extraction protokol (Sigma Chemicals, Buchs, Schweiz). Til Western blot-analyse blev samlet protein (100 ug) og nukleare ekstrakter (60 ug) fyldt på en denaturerende 10% polyacrylamidgel. Membranen blev blokeret natten og inkuberet med kanin polyklonalt antistof til 11beta-HSD2 (H-145,1:500), C /EBP alpha (sc-61X, 1:5000), C /EBP beta (sc-150X, 1: 5000), β-actin (SC-1616R, 1:500) eller HDAC1 (SC-7872, 1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Vaskede nitrocellulosemembraner blev inkuberet med et gede anti-kanin IgG peberrodsperoxidasekonjugat (sc-2004 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) og udviklet ved hjælp af forøget kemiluminescens (ECL) reagens (Amersham, Buckinghamshire, UK). Densitometri af eksponerede film blev udført, og niveauet af protein udtrykt i arbitrære enheder.

Til påvisning af IGF1 og insulinreceptorer celler blev enten ubehandlet eller behandlet med 100 nM insulin i 24 timer og lyseret i RIPA-buffer indeholdende 1 mM natriumorthovanadat, 2 ug /ml aprotinin, 1 ug /ml leupeptin, 1 mM phenylmethansulfonylfluorid. Lysaterne blev inkuberet med enten IGFR eller insulinreceptor-antistoffer (3027, 3025, Cell Signaling) ved 4 ° C natten over. Om morgenen blev prøverne inkuberet med Protein A /G Plus Agarose (Santa Cruz Biotechnology) i 1 time ved 40 ° C. Perlerne blev vasket, kogt i SDS loadingpuffer og proteiner blev separeret ved SDS-PAGE.

De novo

proteinsyntese

HT-29-celler blev dyrket som beskrevet ovenfor og forbehandlet med proteinsyntese (eller translationel forlængelse) inhibitor, CHX (10 uM) i 1 time før tilsætning af insulin (10

-7 M). Ved slutningen af ​​den 24 timer behandling blev cellerne høstet til RNA-isolering og QRT-PCR-analyse.

HSD11B2 mRNA-stabilitet

HT-29-celler blev dyrket som beskrevet ovenfor og behandlet med insulin ( 10

-7 M) i 12 timer. Transskription blev stoppet med DRB (25 uM) og celler blev høstet ved diskrete tidspunkter (0-12 h) til RNA isolering og QRT-PCR-analyse.

Små interfererende RNA (siRNA) eksperimenter

HT-29-celler blev transient transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anbefalinger. Transfektionsblandingen blev fjernet efter 24 timers inkubation. Cellerne blev yderligere inkuberet under normale vækstbetingelser for yderligere 24 timer før mRNA ekstraktion. SiRNA-duplexerne for C /EBP alpha eller C /EBP beta (Qiagen AG, Basel, Schweiz) og en negativ kontrol siRNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) blev anvendt til transfektion i en slutkoncentration på 50 nM.

Elektroforetisk mobilitet (EMSA) og forberedelse kerneekstrakt

Omkring fem millioner af adhærente celler blev løsnet med 3 ml PBS på is og blev pelleteret i 5 minutter ved 900 g. Pellets blev opbevaret ved -80 ° C indtil proteinekstraktion. Nuklear forberedelse ekstrakt og EMSA blev udført som tidligere beskrevet [17], [18]. Proteinudbyttet bestemtes ved Bradford-metoden. EMSA prober blev genereret ved annealing af komplementære enkeltstrengede oligonukleotider og mærket med [gamma

32P] ATP og T4 polynucleotidkinase. Specifik binding konkurrerede med umærkede oligonukleotider som sekvens er anerkendt af de C /EBP faktorer på et 100X-moloverskud (5′-tgcagattgcgcaatctgca-3 ‘, de nukleotid motiver af interesse er fed). De bindende reaktioner blev udført i 10 pi puffer [20 mM HEPES, pH 7,5; 35 mM NaCl; 60 mM KCI; 0,01% NP 40; 2 mM DTT; 0,1 mg /ml BSA; 4% ficoll] indeholdende 1,75 pmol mærket probe, 4 ug kerneproteiner og 1 ug poly (dI-dC). Blandingerne blev inkuberet ved 4 ° C i 20 min i nærvær eller fravær af umærket konkurrent. DNA-proteinkomplekser blev separeret på en 5% polyacrylamidgel i 0,5 × Tris-borat-EDTA-buffer i 90 minutter ved 140 V. Gelerne blev tørret 2 timer ved 80 ° C og analyseret på en Phosphoimager Cyclone (Packard).

chromatin immunoprecipitation

chip assays blev udført ifølge instruktion af Upstate Biotechnology Inc som tidligere rapporteret [18]. Oprensede DNA-fragmenter blev amplificeret med PCR-primere til påvisning af et 210 bp fragment indeholdende -177C /EBP, -198C /EBP sites inden for HSD11B2 promotoren (fremad: 5′-GCAACTTTGGGACTTTGTTCCGGC-3 ‘; revers: 5′-AGAGGGACACTCGCTTTCTCTGCT-3’ ).

QRT-PCR-analyse ved hjælp af menneskelige diabetes RT

2 Profiler PCR Arrays

RT

2 Profiler PCR Arrays PAH’er-30C (SA Biosciences, MD, USA) var designet til at analysere 84 gener relateret til human insulin signalvej. RT-PCR blev udført ved anvendelse af en ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). HT-29-celler blev behandlet i 24 timer med insulin (10

-7 M). Totalt RNA (1 ug) blev anvendt som template til at syntetisere cDNA med RT

2 First Strand kit (SABiosciences). Den PCR-cyklus tilstand var som følger: 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 60 s. I slutningen af ​​PCR-cykling trin blev data for hver prøve vises som en smeltekurve. ABI SDS software (Applied Biosystems) blev anvendt til at bestemme en kritisk tærskel (Ct), som var den cyklus nummer, hvor den lineære fase for hver prøve passeret tærskelværdien. Beta-2-mikroglobulin blev anvendt som housekeeping-gen. Udtrykket af HSD11B2 for de 3 pågældende eksperimenter blev overvåget parallelt af real time PCR, som bekræfter betydelig nedregulering af insulin. Records blev afsat i GEO database med tiltrædelsen nummer GSE51677.

Transient transfektion og reportergenassay

Transfektioner blev udført med FuGENE HD transfektionsreagens (Roche, Rotkreuz, Schweiz) ved hjælp af 3 ml opløsning til 1 mg plasmid. Vektoren pCMV-HRL (

Renilla reniformis luciferase

) (Promega Catalys AG, Wallisellen, Schweiz) blev anvendt til normalisering af transfektionseffektiviteten. Konstruktionen p4.5 kb-HSD11B2 var en generøs gave fra de. K. Yang [19]. Den p0.2 kb-HSD11B2 plasmidkonstruktion blev beskrevet tidligere [18]. Til ekspression af transkriptionsfaktorer, forskellige mængder af vektorerne pCMV-lip og pCMV-LAP, en generøs gave fra U. Schibler [20], blev tilsat til DNA-blandingen. Efter 6 timer blev transfektion mediet erstattet med normalt vækstmedium i 18 timer. Derefter celler blev lyseret og luciferaseaktiviteter blev påvist med Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega Catalys AG, Wallisellen, Schweiz) og MediatorsPhL Luminometer (Mæglere Diagnostic Systems, Wien, Østrig). Ildflue-luciferase-aktivitet blev udtrykt i forhold til Renilla-luciferase for at tage højde for forskelle i transfektionseffektivitet. Når en CMV-LacZ kontrol vektor blev transficeret, Dual-Light-system (Applied Biosystems, Foster City, CA) blev anvendt til bestemmelse af luciferaseaktivitet. Transfektioner blev bekræftet af flere uafhængige forsøg.

site-directed mutagenese

HSD11B2 promoter mutanter blev genereret i p4.5 kb-HSD11B2 og p0.2 kb-HSD11B2 konstruktioner ved hjælp QuikChange II XL websted -dirigerede mutagenese kit (Stratagene, Basel, Schweiz). Følgende primere blev anvendt: 5′-GTGGAACTTGAGAGCTCGAGCAGTTCCCTTCACCTCTGG-3 ‘og 5′-CCAGAGGTGAAGGGAACTGCTCGAGCTCTCAAGTTCCAC-3′ for -4362 C /EBP og 5’-CTCGAGCGCAGCCGCTCCAGGACTTTGTTCCGGCTTTTTC-3 ‘og 5′- GAAAAAGCCGGAACAAAGTCCTGGAGCGGCTGCGCTCGAG- 3’ til -198 C /EBP. Understreget og fed skrift bogstaver repræsenterer muterede baser.

Bioinformatik og statistik

Data er udtrykt som middelværdi +/- SD for tredobbelte prøver af et repræsentativt eksperiment gentages mindst tre gange. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Students

t

test eller ANOVA analyser og blev efterfulgt af en kontrast test med Tukey fejl beskyttelse. Forskelle blev betragtet som signifikante ved

s

0,05, *

s

0,05, **

s

0,01, ***

p

0,001. Transkriptionsfaktorbindingssites blev analyseret med Match-programmet.

Resultater

Vedvarende insulinbehandling mindsker 11beta-HSD2 aktivitet og HSD11B2 genekspression i colon cancer cellelinjer

Regulering af enzym aktivitet ved insulin blev undersøgt i HSD11B2 udtrykkende [16] – [18], [21] humane colon cellelinier (HCT116, SW620 og HT-29) (fig 1A.). Celler blev inkuberet i 24 timer med insulin (10

-11 M-10

-7 M) i cellekulturmedium indeholdende 0,3% FBS. Insulin forårsagede en dosis respons fald i 11beta-HSD2 aktivitet i alle testede colon cellelinjer med en signifikant reduktion på 10

-9 M i HCT116 cellelinie (

s

0,05). Denne virkning blev ikke begrænset til colon cellelinier, idet lignende resultater blev opnået med HSD11B2 udtrykkende [19] JEG-3-celler (fig. S1). På grund af den robuste respons (≈30% reduktion), vi yderligere karakteriseret de molekylære mekanismer i HT-29 celler.

(

A

) 11beta-HSD2 aktivitet blev målt ved

3H cortisol /cortison konvertering assay i colon cellelinjer 24 timer efter inkubation med insulin (10

-11-10

-7 M). Aktiviteten målt for HCT116 i fravær af insulin blev sat til 100%. (

B

) Dosis-respons effekt af insulin (10

-9-10

-5 M) på HSD11B2 mRNA (grå søjler) og aktivitet (kurve) i HT-29 celler behandlet for 24 timer. (

C

) Time-afhængig effekt af insulin (10

-7 M) på HSD11B2 mRNA (grå søjler) og aktivitet (kurve) i HT-29 celler. (

D

) Time-afhængig effekt af insulin (10

-7 M) på 11beta-HSD2 proteinniveauet.

Vedvarende insulinbehandling nedsætter HSD11B2 genekspression, aktivitet og protein i HT-29-celler på en dosis- og tidsafhængig måde

Vi næste bekræftet om insulin-reduceret 11beta-HSD2 aktivitet falder sammen med dets gen og protein-ekspression (fig. 1A). Stigende koncentrationer af insulin i området fra 10

-9 til 10

-5 M forårsagede en koncentrationsafhængig formindskelse i HSD11B2 mRNA-niveauer 24 timer efter behandling (fig. 1B). En maksimal virkning blev observeret ved en koncentration på 10

-7 M, hvor HSD11B2 mRNA blev sænket med 50% (

s Restaurant 0,05) (fig 1B.); og aktiviteten med 35% (

s

0,05) (fig 1B.). Derefter undersøgte vi tidsafhængige regulerende virkning af insulin på HSD11B2 genekspression, aktivitet og proteinniveau. Som vist i figur 1C, blev en tidsafhængig formindskelse i 11beta-HSD2 aktivitet observeret med en signifikant reduktion 12 timer efter behandling (

s Restaurant 0,05). Interessant HSD11B2 mRNA steg i de første 10 timer og faldt derefter. Efter 16 timer nåede mRNA minimale niveauer og forblev lave op til 48 h (

s

0,05) (. Figur 1C). Efter aftale blev HSD11B2 protein reduceret med 18 timer og 24 timer af insulinbehandling (fig. 1D).

nedregulering af HSD11B2 var reversibel ved at fjerne insulin fra mediet 24 timer efter inkubation. Faktisk 48 timer efter fjernelse, HSD11B2 mRNA-niveauer i kontrol og insulin behandlet, var lig (fig. 2A). Derefter blev HT-29-celler behandlet 24 timer med insulin i fravær og nærvær af proteinsynteseinhibitor cycloheximid (CHX). Insulins virkning til at reducere HSD11B2 mRNA blev afskaffet i nærvær af CHX, hvilket indikerer, at

de novo

proteinsyntese var nødvendig (fig. 2B). For at bestemme om insulin reducerer HSD11B2 mRNA-stabilitet, vi vurderede halveringstid HSD11B2 mRNA ved en standard mRNA henfald assay ved anvendelse af 25 pM DRB, en inhibitor af mRNA-syntese. Som vist i figur 2C, har insulin ikke ændre halveringstiden af ​​HSD11B2 mRNA.

(

A

) 11beta-HSD2 aktivitet blev målt i HT-29-celler i nærværelse (sorte søjler) og fravær (hvide søjler) på 10

-7 M insulin i 24 timer. Insulin effekt var reversibel på udvaskning med PBS 24 timer eller 48 timers opfølgning (skraverede søjler). (

B

) HSD11B2 ekspression blev vurderet ved QRT-PCR i HT-29 forbehandlet med proteinsynteseinhibitoren CHX (10 uM) i 1 time og behandlet med insulin (10

-7 M) i 24 h. Hvert datapunkt er udtrykt som en procentdel af kontrolværdien. (

C

) HT-29-celler blev forbehandlet med (udfyldte cirkler) eller uden (udfyldte rhombe) insulin (10

-7 M) i 12 timer. Cellerne blev derefter behandlet med 25 pM af mRNA-syntese inhibitor DRB, uden eller med insulin (10

-7 M) (defineret som tid nul). På de angivne tidspunkter derefter blev totalt RNA isoleret, og steady state niveau af HSD11B2 mRNA vurderes. Hvert datapunkt er udtrykt som en procentdel af den maksimale bestemmes ved tiden nul.

Insulin pathway analyse

For at forstå den molekylære mekanisme, ved hvilken insulin nedregulerer HSD11B2 vi lige at karakterisere insulin pathway i HT-29. Western blot eksperimenter viste ekspression og aktivering af IGF-1 (IGFI-R) og insulin receptorer (IR) i et tidsrum og dosisafhængig måde (fig. 3 A, B). Begge receptorer phosphoryleres inden den første 10 min ved insulinbehandling, mens IR var mere følsom end IGFI-R til lave doser af insulin (fig. 3 A, B). Den rolle, som downstream kinaser på insulinkrævende HSD11B2 repression blev vurderet ved hjælp af PD098059 og AKT VIII-inhibitorer. Figur 3C viser, at begge veje, det MAPK /ERK og PI3K pathway, medieret insulin effekt.

(

A

) Expression og fosforylering af insulin-receptoren med insulin i en tid (0 til 60 min) og dosis (0 til 1000 nm) afhængig måde. (

B

) Ekspression og phosphorylering af IGF-1-receptoren ved insulin i en tid og dosisafhængig måde. (

C

) HSD11B2 mRNA-ekspression overvåges af QRT-PCR i tilstedeværelse af insulin, AKT-hæmmer (AKTVIII, 0,1 pM og 10 uM) eller MEK inhibitor (PD098059, 1 uM).

Total mRNA insulinbehandlede HT-29-celler blev ekstraheret og underkastet RT

2 profilering at kvantificere ekspressionen af ​​insulin pathway komponenter. The Human Insulin-signalvejen RT

2 Profiler PCR Array profiler ekspressionen af ​​84 gener relateret til insulin-responsive gener. Tyve to gener differentielt reguleret i HT-29-celler efter insulinbehandling er rapporteret i tabel S1 og de involverede veje er afbildet i ordningen i figur 4. RT

2 profiler afslørede et karakteristisk mønster af insulin ufølsomhed, med reduceret ekspression af insulin pathway komponenter: IR, IGFI-R, insulinreceptor substrat (IRS2) og insulin reguleret glucose transporter (GLUT-4). Vedvarende insulinbehandling også fremmet glykolyse i HT-29 celler. Mens insulin reguleret glukose transporter GLUT-4-ekspression nedreguleret, blev GLUT-1 kodning messenger steget, lette import af glukose ind i cellerne, uafhængigt af vækstfaktor stimulation. Hexokinase 2, enzymet som phosphorylerer glucose til glucose-6-P, et hastighedsbegrænsende trin med glycolyse, var opreguleret, sammen med pyruvatkinase 2 (PKM2), som omdanner PEP til pyruvat. I modsætning hertil enzym, der dephosphoryleret fructose 1, 6 bisphosphat til fructose-6-phosphat og bidrog til antagonisering glycolyse blev nedreguleret. Salg

mRNA’er blev kvantificeret 24 timer efter insulin (10

-7 M) behandling ved anvendelse RT

2 Profiler PCR Arrays PAH’er-30C. Opreguleret udskrifter vises i rødt og ned-regulerede udskrifter er vist med grønt.

Effekt af insulin på C /EBP alpha, C /EBP beta, og C /EBP delta mRNA-niveauer

Vi præsenterer bevismateriale i figur 5B, at behandling af HT-29 celler med forskellige koncentrationer af insulin (10

-9-10

-5 M) i 24 timer forårsagede en koncentrationsafhængig stigning i C /EBP beta-mRNA-ekspression. I modsætning hertil insulin undertrykt ekspressionen af ​​C /EBP alpha-mRNA-ekspression på en dosis-afhængig måde. Ved en koncentration på 10

-7 M, insulin nedsatte C /EBP alpha-mRNA med 51% (

s Restaurant 0,01), hvorimod C /EBP delta-mRNA-ekspression var uændret. Disse resultater viser, at insulin-afhængig reduktion af HSD11B2 mRNA, korrelerer med ekspressionsmønsteret for 2 ud af 3 undersøgte medlemmer af C /EBP-familien af ​​transkriptionsfaktorer i HT-29-celler.

(

A

) koncentrationsafhængig virkninger af insulin på 11beta-HSD2, C /EBP alpha, og C /EBP beta proteinniveauer. HT-29 celler blev dyrket i 24 timer uden og med stigende koncentrationer af insulin (10

-9-10

-5 m), derefter høstet til Western blotting for at evaluere ekspressionen af ​​11beta-HSD2, C /EBP alpha , C /EBP beta. (

B

) koncentrationsafhængig effekter af insulin på C /EBP alpha, C /EBP beta, og C /EBP delta mRNA-ekspression. HT-29-celler blev behandlet som i (A). Niveauet af C /EBP alpha (åbne cirkler), C /EBP beta (åbne firkanter), og C /EBP delta (udfyldte trekanter) mRNA blev målt ved anvendelse QRT-PCR med S18 som intern kontrol. Ekspressionsniveauer i behandlede celler blev normaliseret med ubehandlede kontroller (100%). Repræsentative data for mindst tre uafhængige forsøg. Den relative intensitet blev bestemt ved densitometrisk scanning. Forholdet mellem massefylde 11beta-HSD2 til beta-actin i celler dyrket i abscence af hormon blev betragtet som 100% (kontrol). Forholdet mellem massefylde kerneekstrakt proteiner til HDAC i celler dyrket uden hormon blev betragtet som 100% (kontrol). * LIP var målbart i kontrolprøverne, så LAP /LIP-forholdet var ikke beregnet. (

C, D

) Silencing af C /EBP alpha (

C

) og C /EBP beta (

D)

blev udført ved hjælp af siRNA. Ekspressionen af ​​C /EBP alpha, C /EBP beta (venstre felt) og HSD11B2 (højre panel) mRNA blev målt ved anvendelse QRT-PCR.

Insulin-regulering af C /EBP alpha og C /EBP beta proteiner

for at undersøge om C /EBP alpha eller C /EBP beta spille en rolle i insulinafhængig undertrykkelse af HSD11B2 genekspression, ekspressionen af ​​C /EBP alpha og C /EBP beta i HT 29-celler blev analyseret ved Western blots (fig. 5A). C /EBP alpha-mRNA kan føre til to polypeptider med en størrelse på 42 kDa og 30 kDa [22], [23], mens C /EBP beta kan udvikles til en aktiverende eller inhiberende isoform (LAP, 38 kD eller LIP, 21 kDa henholdsvis) [20], [24]. Behandling af HT-29 celler med insulin i 24 timer øgede nukleare niveauer af C /EBP alpha (isoform 42 kDa), af både C /EBP beta isoformer LAP og LIP, og faldt de nukleare niveauer af C /EBP alpha (isoform 30 kDa) på en dosis-afhængig måde. Parallelt faldt ekspressionen af ​​HSD11B2 samtidig med en maksimal virkning opnås ved 10

-6 M insulin (fig. 5A). Men som svar på den samme dosis af insulin, stigningen i LIP (≈130 fold ved 10

-6 M insulin) var større end i LAP (≈3 fold ved 10

-6 M insulin), hvilket resulterer i en faldende LAP /LIP-forhold (fig. 5A). Ekspression af C /EBP alpha (isoform 42 kDa) blev let øget mens ekspressionen af ​​C /EBP alpha (isoform 30 kDa) blev reduceret med 50% (fig. 5A).

HSD11B2 genekspression er op- reguleret af C /EBP alpha /beta lyddæmpning

effekten af ​​C /EBP alpha /beta knockdown på HSD11B2 blev vurderet i HT-29 celler. Der er beviser fra denne siRNA transfektion eksperiment, C /EBP alpha og C /EBP beta mRNA blev nedreguleret signifikant (fig. 5C, D, venstre panel). Vigtigt er det, at mRNA niveauerne af HSD11B2 øget efter transfektion med siRNA mod både isoformer (fig. 5C, D, højre panel).

Insulin regulering af C /EBP-DNA-komplekser

in silico

analyse af det humane HSD11B2 genpromotor-sekvens afslørede 4 formodede bindingssteder for C /EBPs anbragt i position -4361, -1985, -198 og -177 bp fra transskriptionsstartstedet (tabel 1). Sitet -4361 har højere match med konsensussekvensen (tabel 1). Forskellige prober blev mærket og inkuberet i nærvær af kerneekstrakter isoleret fra insulin behandlet HT-29-celler. EMSA med proben indeholdende konsensus C /EBP-bindingssted afslørede tre specifikke komplekser (fig. 6A, bane 1, bemærkede C1-3). Signalerne blev vendt ved konkurrence med umærkede sonde huser konsensus C /EBP websted (fig. 6A, bane 6), mens upåvirket når sonden nærede de muterede C /EBP sites (fig. 6A, bane 7). Derfor kan C1-3 signaler svarer til C /EBP /DNA-komplekser. C /EBP binding til konsensus probe blev forhøjet med øget varighed insulinbehandling (fig. 6A, bane 1-5), der afspejler øget niveau af C /EBP beta fundet ved Western blot (fig. 5A). Interessant, intensiteten af ​​C2 steget mere end C1, C2 er mere rigelig relativt til C1 24 timer efter insulinbehandling end i kontrollerne (bane 1, 5).

(A) Nuclear proteiner isoleret fra HT -29 celler binder til identificerede C /EBP alpha /beta sites.

4 ug kerneekstrakter isoleret fra insulin behandlede (i den angivne tidsperiode, 10

-7 M) eller ubehandlede HT-29-celler blev inkuberet med radioaktivt mærkede probe der omfatter konsensus C /EBP alpha /beta-sted i nærvær eller fravær af ikke-radioaktivt mærket (100 ×) konkurrent probe (cons C /EBP alpha /beta eller mut C /EBP alpha /beta) (lanes1-7) . Pile viser C /EBP alpha /beta /DNA forskydninger (C1, C2, C3) separeret fra frit probe ved gelelektroforese.