PLoS ONE: Den indolamin-2,3-dioxygenase (IDO) Inhibitor 1-methyl-D-tryptophan opregulerer IDO1 i humane cancerceller

Abstrakt

1-methyl-D-tryptophan (1-D-MT) er ved at blive anvendt i kliniske forsøg med patienter med recidiverende eller refraktære solide tumorer med det formål at hæmme indolamin-2,3- dioxygenase (IDO) -medieret tumor immune flugt. IDO udtrykkes i tumorer og tumor-drænende lymfeknuder og nedbryder tryptophan (trp) for at oprette en immunsuppressive micromilieu både nedbryder trp og ved at akkumulere immunosuppressive metabolitter af kynurenin (KYN) vej. Her viser vi, at spredning af alloreaktive T-celler dyrket sammen med IDO1-positive humane cancerceller paradoksalt nok blev hæmmet med en-D-MT. Overraskende inkubering med 1-D-MT øget KYN produktion af humane cancerceller. Cellefrie assays viste, at 1-D-MT ikke ændrede IDO1 enzymatisk aktivitet. I stedet 1-D-MT induceret IDO1 mRNA og proteinekspression gennem veje, der involverer p38 MAPK og JNK signalering. Behandling af cancerpatienter med 1-D-MT har transkriptionelle virkninger, der kan fremme i stedet for at undertrykke immunsystemets anti-tumor escape ved at øge IDO1 i cancercellerne. Disse off-target effekter bør nøje analyseres i de igangværende kliniske forsøg med 1-D-MT

Henvisning:. Opitz CA, Litzenburger UM, Opitz U, Sahm F, Ochs K, Lutz C, et al. (2011) Den indolamin-2,3-dioxygenase (IDO) Inhibitor 1-methyl-D-tryptophan opregulerer IDO1 i humane cancerceller. PLoS ONE 6 (5): e19823. doi: 10,1371 /journal.pone.0019823

Redaktør: Matej Oresic, Governmental Technical Research Centre i Finland, Finland

Modtaget: November 25, 2010; Accepteret: April 18, 2011; Udgivet: May 20, 2011

Copyright: © 2011 Opitz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Helmholtz Association (VH-NG-306) til MP og Hertie Foundation til WW. CAO understøttes af en Heidelberg University Medical Faculty Postdoc Fellowship. Som Uta Opitz og Christian Lutz er medarbejdere i Heidelberg Pharma, Heidelberg Pharma havde en rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser. Uta Opitz og Christian Lutz er medarbejdere i Heidelberg Pharma. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

I de seneste år tryptophan (trp) nedbrydning har fået stigende opmærksomhed som en potent immunosuppressiv mekanisme involveret i opretholdelsen af ​​immunologisk tolerance. Trp-nedbrydende enzym indolamin-2,3-dioxygenase (IDO) er blevet impliceret i maternel tolerance over allogen concepti [1], kontrollerende autoimmune sygdomme [2], [3] og kronisk infektion [4], samt fremme tumor immun flugt [5], [6], [7]. IDO-medieret trp nedbrydning er ikke begrænset til tumorceller [7], men er også påvist i tumor-drænende lymfeknuder [8]. I begge tumor-drænende lymfeknuder og tumorer, IDO1 skaber lokal tolerance ved direkte at undertrykke T-celle responser og øge immunosuppression medieret af regulatoriske T-celler (T

reg

) [6]. IDO er kronisk aktiveret i mange kræftpatienter [9] og dets ekspression eller enzymaktivitet korrelerer med en dårlig prognose hos patienter med forskellige cancere, såsom ovariecancer [10], [11], endometrisk carcinom [12], [13], hepatocellulær carcinom [14] og colorectalt carcinom [15].

trods hovedparten af ​​beviser understøtter en rolle for IDO at fremme tumordannelse og tumor immune escape, har der været undersøgelser, der viser en anti-tumor aktiviteten af ​​IDO1. Induktionen af ​​IDO1 er blevet beskrevet som en mekanisme, hvorved interferon (IFN) -γ inhiberer proliferation af maligne celler [16], [17]. Nogle dyreforsøg vist, at IDO1 ekspression var positivt associeret med fjernelsen af ​​maligne celler [18], [19]. Disse resultater blev bekræftet i kliniske undersøgelser, der viser, at selvom det er en stærk inducer af IDO1, IFN-γ var effektiv i behandlingen af ​​ovariecancer og blærekræft [20], [21], [22]. Desuden IDO1 ekspression i levercellecancer prøver og i endotelceller af renalcellecarcinom positivt korreleret med progressionsfri overlevelse og langsigtede overlevelse henholdsvis [23], [24]. Der er således fortsat usikkerhed om den kliniske relevans af IDO1 ekspression i tumorer.

I prækliniske undersøgelser IDO-inhibitor 1-methyl-tryptophan (1-MT) reducerede tumorvolumen hos mus preimmunized med et tumorantigen [7 ] og – i kombination med kemoterapeutiske midler – forårsagede regression af etablerede murine brystcancere [5]. Hæmning af IDO i kombination med kemoterapi eller som en vaccine-adjuvans repræsenterer derfor en attraktiv tilgang til kræft immunterapi [5], [6], [7], [25], [26]. For nylig en roman IDO isoform, betegnes IDO2 blev opdaget, hvilket – ligesom IDO1 – udtrykkes i tumorer og tumor-drænende lymfeknuder [27]. Den tredje trp-nedbrydende enzym i mennesker, er tryptophan-2,3-dioxygenase (TDO) hovedsageligt udtrykkes i leveren og regulerer trp koncentrationer efter ernæringsmæssige trp-optagelse. IDO inhibitor 1-MT eksisterer som to stereoisomerer, 1-D-MT og 1-L-MT. De fleste prækliniske studier har beskæftiget den racemiske blanding 1-D /L-MT til inhibering IDO. Nylige undersøgelser har vist, at IDO1 er den præferentielle mål på 1-L-MT, mens 1-D-MT fortrinsvis inhiberer IDO2 [26], [27], [28], [29]. 1-D-MT er i øjeblikket anvendes i fase I kliniske forsøg som et supplement til konventionel kemoterapi baseret på prækliniske studier i musemodeller af kræft. Vi var interesserede i de immunmodulerende virkninger af en-D-MT i IDO1-positive humane cancerceller.

Resultater

1-D-MT fremkalder immunosuppression af humane cancerceller

SKOV-3-celler konstitutivt nedbryde trp til KYN og udtrykke høje niveauer af IDO1 mRNA mens IDO2 og TDO mRNA udtrykkes i lave niveauer (fig. 1A). Knockdown af IDO1 af siRNA i SKOV-3 celler faldt IDO1 mRNA-ekspression med 87,5% (fig. 1B), der fører til en kraftig reduktion i IDO1-proteinekspression som påvist ved Western Blot (Fig. 1C) og immuncytokemi (fig. 1D). Endelig blev KYN produktion inhiberet med 91,4% i de IDO1 knockdown celler i forhold til middelværdien KYN produktion af SKOV-3-celler transficeret uden siRNA eller med en ikke-targeting siRNA kontrol (fig. 1E), hvilket antyder, at IDO1 primært er ansvarlig for den konstitutive KYN produktion i SKOV-3-celler. For at bestemme virkningen af ​​1-MT behandling på immunmodulerende fænotype af cancerceller, blev udført SKOV-3 /MLR cokultur eksperimenter. Tilsætning af KYN (fig. 2A) eller tilstedeværelsen af ​​SKOV-3-celler (fig. 2B) hæmmede alloreaktive T-celleproliferation i MLR. Knockdown af IDO1 af siRNA ikke blot vendt SKOV-3 cellemedieret suppression af T-celleproliferation, men endog forøget T-celleproliferation (fig. 2C), sandsynligvis på grund af yderligere allogen stimulering af T-cellerne ved IDO-deficiente SKOV-3 celler. Næste testede vi virkningerne af de to stereoisomerer af 1-MT. Tilsætning af 1-methyl-L-tryptophan (1-L-MT) også vendt suppression af T-celleproliferation i SKOV-3 /MLR cokultur eksperimenter (fig. 2D). Overraskende blev T-celleproliferation ikke forbedret, men inhiberes i cokulturer behandlet med 1-methyl-D-tryptophan (1-D-MT, fig. 2E). Tilsætning af trp ændrede ikke denne inhibering, hvilket indikerer, at trp udtømning ikke er involveret i denne paradoksale effekt af 1-D-MT (fig. 2F). Næste vi analyseret effekten af ​​1-D-MT på cellecyklusprogression og proliferation af SKOV-3-celler, som en inhibitorisk virkning af 1-D-MT på SKOV-3-celler kunne forklare den reducerede

3H thymidin-optagelse i de cokultur eksperimenter (fig. 3). Men 1-D-MT ændret hverken

3H thymidin-optagelse (fig. 3A) eller cellecyklusprogression af SKOV-3-celler (fig. 3B). For at udelukke, at 1-D-MT kunne have inhiberet

3H thymidin-optagelse af SKOV-3-celler kun når disse blev dyrket i MLR, T-celleproliferation i cokulturer af SKOV-3-celler med MLR i nærvær af forskellige koncentrationer på 1-D-MT blev målt ved CFSE-farvning og flowcytometri (fig. 3C). 1-D-MT koncentrationsafhængigt inhiberede T-celleproliferation også i disse assays (fig. 3C), hvilket således bekræfter, at 1-D-MT inhiberer T-celleproliferation og ikke proliferation af SKOV-3-celler i cokultureme.

(A) Relativ mRNA-ekspression af de tre trp-nedbrydende enzymer IDO1, IDO2 og tryptophan-2,3-dioxygenase (TDO) (hvide søjler) og KYN produktion (sort bjælke) af SKOV-3-celler, målt ved kvantitativ RT-PCR og højtydende væskekromatografi (HPLC). (B) Knockdown af

IDO1

mRNA ved siRNA målt ved QRT-PCR. (C) Western blot-analyse, der viser IDO1 proteinekspression i SKOV-3-celler med siRNA-medieret knockdown af IDO1 sammenlignet med kontroller. (D) Immuncytokemi (rød, IDO1-farvning, blå, DAPI nuklear farvning) af kontrol- SKOV-3-celler og SKOV-3-celler med IDO1 knockdown. (E) Kyn frigivelse af SKOV-3 celler efter knockdown af IDO1 sammenlignet med kontroller. Eksperimenter blev udført mindst tre gange. Data er gennemsnit ± SEM. * (P 0,05)

(A) alloreaktive T-celle proliferation efter tilsætning af 25 uM KYN til blandede leukocyt reaktioner (MLR).. (B) alloreaktive T-celleproliferation i nærvær af 6000 SKOV-3-celler. (C) T-celleproliferation i MLR dyrket sammen med 2000 kontrol SKOV-3-celler (hvide bar) eller 2000 SKOV-3 celler med et knockdown af IDO1 (sort bjælke). (D) T-celleproliferation i cokulturer af MLR med 2000 SKOV-3-celler efter tilsætning af stigende koncentrationer af 1-L-MT. (E) T-celleproliferation i cokulturer af MLR med 2000 SKOV-3-celler efter tilsætning af stigende koncentrationer af 1-D-MT. (F) Repræsentant resultat af MLR /SKOV-3 cokultur eksperimenter med PBMC fra fem forskellige donorer og 2000 eller 6000 SKOV-3 celler. Celler blev behandlet med eller uden 1 mM 1-D-MT i kombination med eller uden 250 pM trp. Proliferation blev målt ved

3 [H] methylthymidine optagelse. Eksperimenter blev udført mindst tre gange. Data er gennemsnit ± SEM. * (P 0,05)

(A)

3 [H] methylthymidine inkorporering af Skov-3 celler behandlet med 1 mM 1-D-MT (sort bjælke) eller køretøj (hvid. bar) i 6 dage. (B) Cellecyklusanalyse af SKOV-3-celler behandlet med 1 mM 1-D-MT eller vehikel i 48 timer. (C) Proliferation analyse af CFSE-farvede lymfocytter fra 6 dages cokulturer af MLR med 2000 SKOV-3-celler, behandlet med angivne koncentrationer af 1-D-MT (øvre panel). Plot af celletal i hver generation af ovenstående eksperiment (nederste panel).

1- D-MT øger KYN produktion i humane cancerceller

Vi derefter afprøvet effekten af 1-MT på KYN produktion af SKOV-3-celler. Overraskende 1-D-MT koncentrationsafhængigt forøget KYN-dannelse (fig. 4A), mens dets stereoisomer 1-L-MT hæmmede KYN dannelse som forventet (fig. 4A). Den racemiske blanding af 1-MT, som er blevet anvendt i mange undersøgelser, herunder dem, der har etableret IDO1 som et immunosuppressivt enzym, inhiberet KYN dannelse, om end mindre end 1-L-MT alene (fig. 4A). Som trp koncentrationer i medierne kan have begrænset stigningen i KYN produktion, målte vi også KYN frembragt af SKOV-3-celler som respons på 1-D-MT i nærvær af stigende trp koncentrationer. Under disse betingelser blev meget højere koncentrationer KYN nået (fig. 4B), hvilket antyder, at plateauet observeret ovenfor koncentrationer på ca. 250 pM 1-D-MT (fig. 4A) skyldtes begrænset trp tilgængelighed. Trp koncentrationer i celledyrkningsmedier varierer normalt mellem 12 og 20 uM, mens koncentrationer i human serum intervallet mellem 50 og 70 uM. Kyn dannelse i celler behandlet med 1-D-MT var mere udtalt, når trp-koncentrationer til stede i humant serum (62,5 uM) snarere end trp-koncentrationer til stede i celledyrkningsmediet (15 pM) blev anvendt (fig. 4C). Men den fold stigning i KYN ved tilsætning af trp var lig i celler behandlet med eller uden 1-D-MT (fig. 4C). For yderligere at teste om en-D-MT direkte indflydelse IDO1 enzymatiske aktivitet, vi målte IDO1-medieret KYN produktion i SKOV-3 celleekstrakter. 1-D-MT ændrede ikke KYN dannelse uanset om trp var til stede ved en fast koncentration på 100 pM (Fig. 4D) eller ved koncentrationer ækvimolære til 1-D-MT (fig. 4E), hvilket antyder, at stigningen i KYN formation med 1-D-MT i SKOV-3 medieres ikke af en direkte virkning af 1-D-MT på IDO1 enzymatisk aktivitet.

(a) KYN koncentrationer frigivet af SKOV-3-celler efter behandling med 1- D-MT (hvide cirkler), 1-L-MT (sorte cirkler) og den racemiske blanding af 1-MT (sorte trekanter), målt efter 48 timer ved HPLC. (B) Kyn frigivelse af SKOV-3-celler som respons på 500 pM 1-D-MT i nærvær af stigende trp koncentrationer. (C) Kyn frigivelse af SKOV-3-celler behandlet med forskellige koncentrationer af trp alene (åbne cirkler) eller i kombination med 1 mM 1-D-MT (udfyldte cirkler), målt efter 48 timer ved HPLC. (D) Kyn produktion i IDO1 enzymatiske assays udført i nærvær af 100 uM trp i kombination med stigende 1-D-MT koncentrationer. (E) Kyn produktion af IDO1 enzym i nærværelse af stigende koncentrationer af trp alene (åbne cirkler) eller i kombination med 1-D-MT (udfyldte cirkler). Eksperimenter blev udført tre gange. Data er gennemsnit ± SEM. * (P 0,05).

IDO1 udtryk forstærkes af en-D-MT i humane kræftceller

Dernæst undersøgte vi, om en-D-MT påvirket udtryk for trp-enzymer. Til vores overraskelse, fandt vi, at 1-D-MT steg IDO1 mRNA og protein i SKOV-3-celler, mens IDO2 og TDO forblev uændret (fig. 5A). Opregulering af IDO1 mRNA var koncentrationsafhængig (fig. 5B) og blev først påvist efter 16 timer inkubation med 1-D-MT (fig. 5C). Vigtigere, blev IDO1-fremmende effekter ikke begrænset til SKOV-3-celler. Mens en-D-MT ikke inducerede

de novo

IDO1 mRNA ekspression og KYN produktion i IDO1-negative HeLa cervikal carcinomaceller, steg IDO1 mRNA og KYN produktion efter induktion af IDO1 udtryk og KYN produktion af IFN γ (fig. 6A, B). Interessant nok 1-D-MT-medieret opregulering af IDO1 mRNA i mange IDO1-negative cancerceller var differentielt afhængig af koncentrationen af ​​IFN-γ, der blev anvendt til at inducere

de novo

ekspression af IDO1 (fig. 6C). Efter stimulering med passende IFN-γ koncentrationer, 1-D-MT steg IDO1 mRNA og KYN produktion i et panel af forskellige cancerceller (fig. 6C-F), hvilket indikerer en universel mekanisme af 1-D-MT-medieret aktivering af IDO1 .

(A) Venstre panel: mRNA ekspressionen af ​​IDO1, IDO2 og TDO i SKOV-3 celler efter behandling med 1 mM 1-D-MT, analyseret efter 24 timer ved QRT-PCR. Højre panel: Western blot analyse af IDO1 ekspression i Skov-3-celler udført efter 48 timer 1 mM 1-D-MT. GAPDH tjente som lastning kontrol. (B) IDO1 mRNA-ekspression som reaktion på stigende koncentrationer af 1-D-MT målt efter 24 timer ved QRT-PCR. (C) Tidsforløb analyse af IDO1 mRNA induktion af 1 mM 1-D-MT, analyseret ved QRT-PCR. Eksperimenter blev udført tre gange. Data er gennemsnit ± SEM. * (P 0,05).

(A) Repræsentative HPLC grafer af KYN produktion af HeLa-celler, som var enten ubehandlet, behandlet med 1 mM 1-D-MT og /eller 1000 U IFN y i 72 timer. Absorption af KYN blev målt ved 365 nm. (B) i ubehandlede HeLa-celler 1 mM 1-D-MT inducerede ikke

de novo

IDO1 mRNA, men steg IDO1 mRNA efter induktion med 1000 U IFN-γ-mRNA-ekspression blev analyseret ved QRT-PCR 24 h efter behandling. (C) Et repræsentativt eksempel på virkningen af ​​forskellige IFN-γ koncentrationer på IDO1 mRNA induktion med 1-D-MT, der er vist i U251 gliom-celler. (D) IDO1 mRNA ekspression af angivne cellelinier, blev stimuleret i 24 timer med passende koncentrationer af IFN-γ alene (hvide søjler) eller i kombination med 1 mM 1-D-MT (sorte søjler). (E) Et repræsentativt eksempel på IDO1 mRNA induktion med 200 uM 1-D-MT i IFN-y-stimulerede T98G gliomceller. (F) Kyn frigivelse af angivne cellelinier, blev stimuleret i 72 timer med passende koncentrationer af IFN-γ alene (hvide søjler) eller i kombination med 1 mM 1-D-MT (sorte søjler), målt ved HPLC. Eksperimenter blev udført tre gange. Data er gennemsnit ± SEM. * (P 0,05).

1-D-MT-medieret IDO1 udtryk involverer JNK og p38 MAPK

Vi udforskede derefter signalveje involveret i opregulering af IDO1 som svar på 1-D-MT behandling. IFN-medieret STAT1 phosphorylering er involveret i induktionen af ​​IDO1 i mange forskellige celler og væv [30], men knockdown af STAT1 af siRNA ikke formindske KYN produktion af 1-D-MT-behandlede celler (fig. 7A). I overensstemmelse med dette resultat, havde 1-D-MT ikke inducerer mRNA-ekspression af IFN-β eller IFN-γ (fig. 7B). Mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) tilgange er blevet rapporteret at være moduleret af den racemiske blanding af 1-MT og derved påvirke polariseringen af ​​dendritiske celler (DC) [31]. Vi testede derfor, om inhibering af af MAPK signalering påvirkede 1-D-MT-medieret stigning i IDO1 ekspression. Inhibering af ERK-phosphorylering af PD98059 påvirket IDO1 mRNA-ekspression og KYN frigivelse hverken i ubehandlet eller i 1-D-MT behandlede celler (fig. 8A). Mens inhibering af p38-MAPK phosphorylering med SB203580 [32] let reduceret IDO1 mRNA i ubehandlede celler, er det næsten helt afbødes stigningen i IDO1 mRNA-ekspression i respons på 1-D-MT (fig. 8B). Den lille hæmning af IDO1 transcipt i ubehandlede celler ikke oversætte til væsentligt reduceret KYN frigivelse, mens reduktionen i KYN udgivelse blev signifikant i 1-D-MT behandlede celler (fig. 8B). Lignende resultater blev opnået, når inhibering JNK ved SP600125 (fig. 8C) [33]. Kollektivt antyder disse data, er, at p38 MAPK og JNK signalering involveret i mediering induktionen af ​​IDO1 som svar på 1-D-MT.

(A) Knockdown af STAT1 mRNA ved si-RNA (hvide bjælker) påvirkede ikke KYN frigivelse (sorte søjler) 1-D-MT (1 mM) blev behandlet SKOV-3-celler. (B) Analyse af IFN-γ og IFN-β-mRNA-ekspression i Skov-3-celler efter stimulering med 1 mM 1-D-MT i 24 timer.

IDO1 mRNA (venstre felt) og KYN frigivelse (højre panel) af SKOV-3-celler behandlet med (A) 50 pM af MEK1-inhibitoren PD98059, (B) 20 pM af p38 MAPK inhibitor SB203580 og (C) 20 uM JNK inhibitor SP600125 eller kontrol 1 time før tilsætning af 1 mM 1-D-MT analyseret ved QRT-PCR efter 24 timer og HPLC efter 48 t. Eksperimenter blev udført tre gange. Data er gennemsnit ± SEM. * (P 0,05)

Diskussion

Tidligere IDO hæmning blev hovedsagelig opnået ved hjælp af den racemisk blanding af 1-MT [34].. Da det blev klart, at IDO inhibering kan være et lovende mål for cancerterapi blev de individuelle stereoisomerer af 1-MT undersøges nærmere [5], [35]. Selvom 1-L-MT blev vist at mere effektivt at hæmme IDO1 i enzymassays og cancercellelinjer, 1-D-MT udviste overlegen antitumoraktivitet i musemodeller og blev derfor valgt til kliniske forsøg [35]. En efterfølgende undersøgelse antydede, at den overlegne anti-tumor aktiviteten af ​​1-D-MT kan skyldes inhibering af IDO2 isoformen [27]. Nylige undersøgelser indikerede, at 1-D-MT inhiberer IDO aktivitet hverken i dendritiske celler eller i tumorceller [26], [28] og ikke effektivt at genoprette IDO-induceret standsning af T-celleproliferation [36]. I vores undersøgelse, 1-D-MT undertrykte T-celleproliferation, når konstitutivt IDO1-udtrykkende SKOV-3-celler blev dyrket sammen med blandede lymfocyt reaktioner (Fig. 2E, F). Undersøgelse af de underliggende mekanismer overraskende afsløret, at 1-D-MT forøgede KYN produktion af cancerceller med IDO1 aktivitet (fig. 4, 6) på grund af opregulering af IDO1 mRNA og proteinekspression (fig. 5, 6). Opregulering af IDO1 ekspression og aktivitet blev kun observeret i cancerceller med enten konstitutiv eller IFN-γ-induceret IDO1 ekspression (fig. 5, 6). Opregulering af IDO1 af 1-D-MT i mange cancerceller var mest fremtrædende ved moderate koncentrationer af IFN-γ, der sandsynligvis vil ligne fysiologiske koncentrationer (Fig. 6C). Lave koncentrationer af IFN-γ måske ikke har fremkaldt tilstrækkelig IDO1 ekspression (fig. 6C), eventuelt forklare, hvorfor 1-D-MT ikke øgede IDO1 ved disse koncentrationer, mens stimulering med meget høje koncentrationer af IFN-γ kan have medført maksimal IDO1 induktion (fig. 6C), hvilket forklarer, hvorfor yderligere stigning med 1-D-MT ikke blev observeret. I alle de undersøgte IDO1-udtrykkende celler en stigning i IDO1 ekspression og KYN frigivelse blev observeret som respons på behandling med 1-D-MT, hvilket indikerer en generel mekanisme involveret i 1-D-MT-medieret IDO1 induktion (fig. 4, 5, 6).

i en tidligere undersøgelse, den racemiske blanding af 1-MT er blevet rapporteret at modificere polarisationen af ​​dendritiske celler (DC) ved modulering MAPK [31]. Inhibering af p38 MAPK phosphorylering forhindrede stigning i IDO1 mRNA og KYN-produktion af 1-D-MT (fig. 8B), hvilket antyder, at p38-MAPK deltager i 1-D-MT medieret signalering. I overensstemmelse med dette resultat, har p38 MAPK tidligere vist sig at bidrage til induktionen af ​​IDO1 i en leukæmicellelinje og i DC [37], [38]. Også inhibition af JNK signalering afbødet induktionen af ​​IDO1 mRNA og KYN-frigivelse i tilstedeværelse af 1-D-MT (fig. 8C). Inhibering af JNK-phosphorylering er for nylig blevet beskrevet at nedsætte IDO1 ekspression induceret af LPS i mus mikroglia [39]. 1-D-MT medieret modulering af p38-MAPK og JNK antyder, at 1-D-MT kan have flere virkninger end blot opregulering af IDO1.

Så vidt vi ved dette er den første rapport af 1-D- MT-medierede virkninger på genekspression i humane celler. Stereoisomeren af ​​1-D-MT blev 1-L-MT nylig rapporteret at undertrykke IFN-γ-induceret ekspression af IDO1 i muse rektale carcinomceller [40]. Desuden er det tidligere blevet beskrevet, at 1-MT påvirker modning af DC uafhængigt af IDO [31]. Men den racemiske blanding af 1-MT blev anvendt i dette studie, og det er derfor ikke kendt som stereoisomer var ansvarlig for de observerede virkninger [31]. Det er endnu ikke klarlagt, om en-D-MT udøver flere virkninger på genekspression end reguleringen af ​​IDO1. I modsætning til IDO1 blev trp nedbrydende enzym IDO2 ikke fremkaldt af en-D-MT. Dette fund understreger forestillingen om, at IDO1 og IDO2 forskelligt reguleres på transskriptionsniveau [27]. Mulige andre virkninger af 1-D-MT på genekspression, kan bidrage til den høje anti-tumor effekt af 1-D-MT observeret i musetumormodeller [35]. Væsentlige forskelle i IDO udtryk og regulering eksisterer mellem mennesker og mus [29], [41], som kunne forklare de observerede uoverensstemmelser til 1-D-MT handling i musemodeller og humane celler. I et studie med 1-D-MT i SIV-inficerede makakaber, en model mere ligner mennesker end musemodeller, Boasso og kolleger observeret, at KYN plasmaniveauer ikke blev reduceret, men snarere induceret under behandling med 1-D-MT [42 ]. Øget IDO1 mRNA-ekspression i lymfeknuder af makakaber efter en-D-MT behandlingen blev fortolket som en kompenserende counterregulatory mekanisme aktiveret af en-D-MT, som kan have tegnet sig for den manglende effekt på plasma KYN [42]. Vores data viser, at opregulering af IDO1 og KYN foregår også i isolerede humane celler, hvor en counterregulatory mekanisme, der medierer immunosuppression er usandsynligt.

Da der er tegn på, at IDO1 kan begrænse tumorvækst som mediator af tumordræbende IFN -γ i forsøgsmodeller og patienter [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22] og som IDO1 udtryk i tumorer positivt korreleret med progressionsfri overlevelse og lang overlevelse i nogle undersøgelser [23], [24] det er fristende at spekulere, at induktion af IDO1 med 1-D-MT faktisk kan forklare nogle af de anti-tumor effekter af en-D-MT.

som konklusion har vi identificeret opregulering af IDO1 udtryk i humane cancerceller som en dybtgående indvirkning af 1-D-MT, en forbindelse, i øjeblikket anvendes i kliniske forsøg med patienter med recidiverende eller refraktære solide tumorer med henblik på at hæmme (IDO ) -medieret tumor immune flugt. IDO1 ekspression vides at være immunosuppressive og kan forøge tumor immune escape, men det har også været impliceret i direkte antitumorvirkninger. Flere undersøgelser er nødvendige for bedre at forstå betydningen af ​​IDO i kræft biologi og den potentielle anvendelse af 1-D-MT som en anti-cancer middel.

Materialer og metoder

Cell kultur og reagenser

SKOV-3 og NIH: OVCAR-3 ovarie- carcinomceller blev dyrket i McCoys 5A-medium (BioConcept, Allschwil, Schweiz) suppleret med L-Trp som angivet (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland), 300 mg /L glutamin (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland), 10% FBS (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PAA Laboratories, Pasching, Østrig). HeLa cervikal carcinomaceller, A375 maligne melanomceller blev LN18, LNT229, T98G og U251 malignt gliom celler holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, PAA) indeholdende 10% FBS (Thermo Fisher Scientific Inc.) og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PAA Laboratories). Perifere mononukleære blodceller (PBMC) blev isoleret fra fem raske, ikke-beslægtede blod-donorer ved densitetsgradient centrifugering under anvendelse af lymfocyt separationsmedium LSA 1077 (PAA Laboratories) og dyrket i RPMI 1640 (PAA Laboratories) indeholdende 10% FBS (Thermo Fisher Scientific Inc.) og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PAA Laboratories). Alle celler blev rutinemæssigt testet for kontamination af Multiplex celle kontamineringstest [43]. Kulturer blev inkuberet ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære

20 mM stamopløsninger af 1-methyl-D-tryptophan (1-D-MT, partinumre: 09315BH, 08007EJ). og 1-methyl-L-tryptophan (1-L-MT, partinumre: 08023HE, 15399MJ) (Sigma-Aldrich) blev fremstillet ved at opløse inhibitorerne i 0,1 N NaOH. PH blev indstillet til 7,5 under anvendelse af saltsyre. For at undgå forurening af cellekulturer blev stamopløsninger filfotered gennem 0,2 um filtre. IFN-γ blev indkøbt fra Immunotools (Friesoythe, Tyskland). ERK phosphorylering blev inhiberet under anvendelse af MEK1-inhibitoren PD98059 (Cell Signaling Technology, Beverly MA, USA). C-Jun-N-terminal kinase (JNK) inhibitor SP600125 og inhibitoren af ​​p38-kinase-phosphorylering SB203580 blev indkøbt fra Enzo Life Sciences (Lorrach, Tyskland).

Højtryksvæskekromatografi (HPLC)

Højtryksvæskekromatografi (HPLC) -analyse blev udført ifølge [44] under anvendelse af en Beckman HPLC med fotodiodearray (PDA) sporing og Lichrosorb RP-18-søjle (250 mm x 4 mm ID, 5 um, Merck, Darmstadt, Tyskland ). Kyn frigivelse og trp nedbrydning blev målt i mediet med 3 * 10

5-celler i 2 ml McCoys 5A Medium (BioConcept) indeholdende 10% FBS (Perbio), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PAA Laboratories ) suppleret med 0-125 uM L-trp (Sigma-Aldrich). Mediet blev høstet fra plader med 6 brønde i de angivne tidspunkter, centrifugeret og frosset indtil yderligere analyse. Efter optøning blev prøverne suppleret med trichloreddikesyre for protein præcipitation, centrifugeret og 100 ul af supernatanten blev analyseret ved HPLC. Standardkurver blev dannet med L-KYN og L-trp (Sigma-Aldrich) i det samme medium. Da FBS indeholder KYN, lave koncentrationer KYN (~ 1 uM) blev påvist i alle prøver og medium uden celler altid blev målt til sammenligning.

Kvantitative (q) RT-PCR

Total RNA var isoleret med Qiagen RNAeasy RNA-isolering kit (Hilden, Tyskland), og DNA blev syntetiseret med Applied Biosystems revers-transkription-kit (Foster City, CA, USA) ifølge producentens instruktioner. QRT-PCR blev præformet i en ABI 7000 termisk cykliseringsapparat med SYBR Green PCR MasterMix (Applied Biosystems) i overensstemmelse med standardprotokoller. PCR-reaktioner blev kontrolleret ved at indbefatte no-RT-kontrol, ved udeladelse af skabeloner og ved både smeltekurveanalyse og gelanalyse. Standardkurver blev genereret for hvert gen. Relativ kvantificering af genekspression blev bestemt ved sammenligning af tærskelværdier. Alle resultater blev normaliseret til GAPDH, som varierede hverken med IFN-γ eller en-D-MT behandling

Primer sekvenser var (5′-3 ‘frem, bak):.

CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC, TGAGCGATGTGGCTCGGCT (GAPDH),

TTCAGTGCTTTGACGTCCTG, TGGAGGAACTGAGCAGCAT (IDO1),

TGCTTCATGCCTTTGATGAG, GAAGGCCTTATGGGAAGGAG (IDO2),

ACTGCCTCAAGGACAGGATG; AGCCAGGAGGTTCTCAACAA (IFN-β),

TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA; TCCTTTTTCGCTTCCCTGTTTT (IFN-γ),

AGGAAAAGCAAGCGTAATCTTCA; TATTCCCCGACTGAGCCTGAT (STAT1),

GGTTCCTCAGGCTATCACTACC; CAGTGTCGGGGAATCAGGT (TDO)

siRNA eksperimenter

For at knockdown IDO1 (INDO) og STAT1 ON-TARGETplus SMART-pool siRNA af Dharmacon RNA Technologies (Lafayette, CO, USA) blev anvendt.

sekvenserne var som følger:

Menneskelig INDO, NM_002164

, fornuft, 5′-UCACCAAAUCCACGAUCAUUU-3 ‘, antisense, 5′-PUAUGCGAAGAACACUGAAAUU-3′; sense, 5’-UUUCAGUGUUCUUCGCAUAUU-3 ‘, antisense, 5′-PUAUGCGAAGAACACUGAAAUU-3′; sense, 5’-GUAUGAAGGGUUCU GGGAAUU 3 ‘, antisense, 5′-PUUCCCAGAACCCUUCAUACUU-3′; forstand, 5’-GAA CGGGACACUUUGCUAAUU-3 ‘, antisense, 5′-PUUAGCAAAGUGUCCCGUUCUU-3’

Menneskelig STAT1, NM_139266

, fornuft, 5′-GCACGAUGGGCUCAGCUUUUU-3 ‘, antisense, 5 ‘-PAAAGCUGAGCCCAUCGUGCUU-3′; sense, 5’-CUACGAACAUGACCCUAUCUU-3 ‘, antisense, 5′-PGAUAGGGUCAUGUUCGUAGUU-3′; sense, 5’-GAACCUGACUUCCAUG CGGUU-3 ‘, antisense, 5′-PCCGCAUGGAAGUCAGGUUCUU-3′; forstand, 5’-AGAAAGAG CUUGACAGUAAUU-3 ‘, antisense, 5′-PUUACUGUCAAGCUCUUUCUUU-3’.

ON-TARGETplus siCONTROL Ikke-targeting Pool (D-001810-10-05, Dharmacon) og en transfektion uden siRNA blev anvendt som negative kontroller.

til transfektion af siRNA blev Amaxa Nucleofector Kit V (Amaxa Biosystems, Koeln, Tyskland) anvendes. Kort fortalt, 3 * 10

5-celler blev resuspenderet i 100 pi af nucleofector opløsning V og blandet med 1,5 ug siRNA, derefter elektroporeret anvendelse af program V005. Mediet blev skiftet efter 24 timer, analyse af KYN indhold af mediet ved HPLC, høst af cellerne til RNA-ekstraktion eller frembringelsen af ​​lysater og immuncytokemisk analyse blev udført efter 48 timer.

Western blot-analyse

Helcellelysater blev fremstillet i iskold tris (hydroxymethyl) aminomethan-hydrochlorid (TRIS-HCI, 50 mM, pH 8,0; Carl Roth) indeholdende 150 mM NaCl (JT Baker, Deventer, Holland), 1% Triton X-100 (AppliChem, Darmstadt, Tyskland), 10 mM EDTA (Gerbu Biotechnik, Gaiberg, Tyskland), 200 mM dithiothreitol (Carl Roth), 3% 2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich), 100 uM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF),