PLoS ONE: Hæmning af Stearoyl-CoA desaturase 1 Expression Fremkalde CHOP-Dependent Cell Død i Human Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Kræftceller præsentere en vedvarende de novo fedtsyre syntese med en forøgelse af mættede og monoumættede fedtsyre (MUFA) produktion. Denne ændring i fedtsyrestofskiftet er associeret med overekspression af stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1), som katalyserer omdannelsen af ​​mættede fedtsyrer til monoumættede fedtsyrer (fx oliesyre). Adskillige rapporter demonstrerede, at inhibering af SCD1 førte til blokering af proliferation og induktion af apoptose i cancerceller. Ikke desto mindre, mekanismer for celledød aktivering mangler at blive bedre forstået.

vigtigste resultater

I denne undersøgelse har vi påvist, at SCD1 udslettelse af siRNA udløst afskaffelse af de novo MUFA syntese i kræft og ikke- cancerceller. SCD1 hæmning-aktiveret celledød blev kun observeret i cancerceller med induktion af caspase 3-aktivitet og PARP-spaltning. Eksogene tilskud med oliesyre ikke vende SCD1 ablation-medieret celledød. Desuden SCD1 udtømning fremkaldt udfoldet protein Response (UPR) kendetegnende såsom Xbp1 mRNA splejsning, phosphorylering af eIF2α og forøgelse af CHOP-ekspression. Imidlertid blev chaperone GRP78 ekspression, et andet UPR kendetegnende, ikke påvirket af SCD1 knockdown i disse cancerceller indikerer en ejendommelig UPR aktivering. Endelig viste vi, at CHOP induktion deltog til celledød aktivering af SCD1 udryddelse. Faktisk overekspression af dominant negative CHOP konstruktion og udslettelse af CHOP delvist restaureret levedygtighed i SCD1-udtømte kræftceller.

Konklusion

Disse resultater antyder, at hæmning af de novo MUFA syntese af SCD1 udryddelse kunne være en lovende anti-cancer-target ved at inducere celledød via UPR og CHOP aktivering

Henvisning:. Minville-Walz M, Pierre AS, Pichon L, Bellenger S, Fèvre C, Bellenger J, et al. (2010) Hæmning af Stearoyl-CoA desaturase 1 Expression Fremkalde CHOP-Dependent celledød i humane cancerceller. PLoS ONE 5 (12): e14363. doi: 10,1371 /journal.pone.0014363

Redaktør: Michael Polymenis, Texas A M University, USA

Modtaget: 23, 2010; Accepteret: November 26, 2010; Udgivet: 16. december 2010

Copyright: © 2010 Minville-Walz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra INSERM, Region Bourgogne og Center national interprofessionnel de l’économie Laitiare. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræftceller udviser stofskifte ændringer karakteriseret ved øget glykolyse og lipogenese [1], [2]. Aktive prolifererende kræftceller til stede ikke kun kvantitative ændringer i

de novo

lipid biosyntese, men også ændringer af lipid membran sammensætning påvirker membran fluiditet, signaltransduktion og genekspression [3], [4]. Ændringer i lipidmembran sammensætning observeres i en lang række forskellige cancere, hovedsageligt karakteriseret ved mættet (SFA) og monoumættede fedtsyrer (MUFA) akkumulering som synes mindre på grund af øget optagelse af SFA og MUFA end at forværret endogene fedtsyrer syntese, uanset tilstrækkelige lipid ernæringsmæssige udbud [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Disse modifikationer af SFA og MUFA-indhold er forbundet med modulering af ekspressionen og aktiviteten af ​​lipogene enzymer. Således overekspression af acetyl Co-A carboxylaseinhibitorer α og fedtsyre syntase, der er involveret i de første trin i fedtsyrebiosyntese, blev beskrevet i forskellige kræftformer [12], [13], [14], [15], [16], [17].

Øget indhold MUFA kunne også skyldes en opregulering af stearoyl Co-A desaturase (SCD, delta-9 desaturase) udtryk, det hastighedsbegrænsende enzym af MUFA syntese. Faktisk SCD katalyserer introduktionen af ​​en dobbeltbinding mellem carbonatom 9 og 10 i flere mættede fedtsyrer, såsom palmitinsyre (16:00) og stearinsyre (18:00) syrer til opnåelse palmitolein (16:01) og oliesyre (18:01 ) syrer hhv. Denne endoplasmatisk reticulum bosiddende enzym eksisterer under to isoformer i mennesker, SCD1 og Scd5 [18]. SCD1 findes i næsten alle væv med en større ekspression i leveren, mens Scd5 ekspression er begrænset til bugspytkirtlen og hjernen. SCD1 udtryk, korreleret med MUFA-indhold, er forøget i hepatocellulære adenom, colon og øsofageal carcinom, samt i genetically- og kemisk inducerede tumorer [19], [20], [21]. For prostatakræft, to undersøgelser præsentere modstridende resultater på SCD1 udtryk niveau [22], [23]. Således kan SCD1 ekspression relateres til carcinogenese, der involverer ændring af proliferation /apoptosis balance. Faktisk SCD1 over-udtrykkende celler udgør en vækst fordel mens SCD1 knock-down fører til langsommere satser for celledeling og celledød

in vivo

in vitro

[24], [25] , [26], [27]. Mekanismen for celledød observeret i SCD1-deficiente lungecancerceller synes at involvere ændring af en SFA /MUFA-forhold, der udløser hæmning af Akt pathway og aktivering af AMPK pathway [24], [28]. Ja, i mangel af SCD1, de SFA indhold stiger som afhjælper Akt aktivering normalt opnås ved MUFA (fx oliesyre) for at opretholde celledeling og overlevelse [29]. Desuden forskellige cancerceller mangler SCD1 aktivitet reducerer

de novo

lipogenese gennem aktivering af AMPK pathway [22], [24]. Ændringen af ​​lipid produktion i SCD1-deficiente celler vedrører primært en reduktion af phospholipid biosyntese, hvilket udløser cellulær stress og ekspression af apoptose-relaterede protein C /EBP homologt protein (CHOP /GADD153) [26], [27], [30 ], [31]. CHOP tilhører en særegen stress vej opkaldt endoplasmatiske reticulum (ER) stress, der kan inducere apoptose.

ER stress er udløst af forskellige stresstilstande såsom ændringer i posttranslationel protein status og lipid syntese, hypoxi, afbrydelse af calcium homeostase og næringsstoffer afsavn, og fører til aktivering af en adaptiv program, kendt som den udfoldede Protein Response (UPR), at genetablere ligevægten [32]. Aktivering af den kanoniske UPR indgriber tre forskellige samordnede signaling filialer medieret af ER-membranen forankret sensorer: RNA-afhængig proteinkinase (PKR) -lignende ER kinase (PERK), aktiverende transskriptionsfaktor 6 (ATF6) og inositol trænger enzym 1α (IRE1α) [ ,,,0],33]. I stressede celler, chaperone protein GRP78 dissocieres fra UPR sensorer kvikke, ATF6 og IRE1α fører til deres aktivering til først afhjælpe ER stress. PERK phosphorylerer den eukaryote translationsinitiering faktor (elF) 2α, for derved at inhibere globale proteinsyntese. Aktiv ATF6 translokerer til Golgi og spaltes fra membranen ved site-1 og -2 proteaser. Derefter spaltes ATF6 lokaliserer til nucleus og inducerer transkription af Xbp1 og ER chaperoner såsom GRP78. IRE1α råder over en endoribonuclease aktivitet, der alternativt splejser den Xbp1 mRNA (sXbp1), der er oversat til en aktiv transkriptionsfaktor. Men i en alvorlig eller langvarig stress, kan UPR udløse pro-apoptotiske signaler gennem aktivering af transkriptionsfaktoren CHOP, som virker til at undertrykke bcl-2-genekspression, således nedregulere anti-apoptotiske Bcl-2-protein og rendering celler følsomme over for pro-apoptotiske virkninger af BH3 kun for proteiner [34], [35], [36].

Mens disse data klart støtter inddragelsen af ​​SCD1 som en central regulator af lipogenese i kræftceller, den forbindelse mellem SCD1 og induktionen af ​​eR stress og celledød i cancerceller mangler at blive bedre forstået. I denne undersøgelse, var vi derfor interesseret i at søge efter UPR induktion i kræftceller mangler SCD1 udtryk og i at undersøge den rolle, denne stress vej på kræftcellen levedygtighed under SCD1 udryddelse. Vi viste, at SCD1 udtømning i cancerceller aktiverede UPR markører og induceret celledød uden effekt på non cancer cellelevedygtighed. Desuden har vi bevist, at CHOP deltog til SCD1-medieret celledød.

Resultater

Effektiv hæmning af SCD1 udtryk og undertrykkelse af

de novo

MUFA syntese

i dette studie undersøgte vi effekten af ​​SCD1 lyddæmpning ved hjælp siRNA i forskellige humane cancercellelinier (U2OS, SW480 og HCT116). Cancerceller blev transficeret med 75 nM siRNA targeting ubeslægtet human mRNA (siRNA scr) og SCD1 mRNA (siRNA Scd1.A og Scd1.B). Både siRNA rettet mod SCD1 sammenlignet med kontrol siRNA (scr) drastisk undertrykt ekspression af SCD1 mRNA og protein, så snart 24 timer efter transfektion (figur 1A og 1B).

A) U2OS celler blev transficeret med siRNA kontrol ( scr) eller med siRNA mod SCD1 (Scd1.A og Scd1.B) og opsamlet 24 og 48 timer efter transfektion for SCD1 mRNA-ekspression ved realtid RT-PCR. SCD1 mRNA-ekspression blev normaliseret for p-actin-ekspression. Værdier repræsenterer middel ± SEM forhold til SCD1 mRNA-ekspression i SCR-behandlede U2OS celler ved 24 timer. *, P 0,05 vs. siRNA scr-behandlede celler ved Anova-analyse efterfulgt af Tuckey test. B) U2OS og SW480-celler blev behandlet med oligofectamine (-), siRNA kontrol (SCR) eller med siRNA mod SCD1 (Scd1.A og Scd1.B). Celler blev opsamlet 24 timer efter transfektion for SCD1 ekspressionsanalyse ved Western-blotting. C) U2OS og SW480 celler behandlet 72 timer med siRNA blev inkuberet i yderligere 6 timer med [

14C] stearinsyre og total lipid ekstraktion blev udført. SCD-aktivitet blev evalueret ved HPLC som hastigheden for [

14C] stearinsyre omdannelse til [

14C] oleinsyre i celler behandlet med siRNA i 72 timer. SCD-aktivitet blev udtrykt som forholdet% af [

14C] oliesyre til [

14C] olein- og stearinsyre. Værdier repræsenterer middel ± SEM fra mindst to separate forsøg. *, P 0,05 vs. siRNA scr-behandlede celler ved Anova-analyse efterfulgt af Tuckey test. Et repræsentativt ekspression af SCD1 protein blev vist i 72 timer af siRNA behandling. D) U2OS celler blev udsat for DMSO som vehikel, SCD1 hæmmere (CVT-11127 eller MF-438) ved 10 uM i 24 timer og fremstillet som ovenfor C) til måling SCD aktivitet. Værdier repræsenterer middel ± SEM fra tre forsøg. *, P 0,05 vs. vehikelbehandlede celler ved Anova-analyse efterfulgt af Tuckey test

Som SCD1 katalyserer omdannelsen af ​​stearinsyre i oliesyre et fald i oliesyre produktionen ville være et bevis afskaffelse. af SCD1 aktivitet ved siRNA targeting dette enzym. For at løse SCD aktivitet efter 72 timers SCD1 lyddæmpning, vi yderligere behandlet U2OS og SW480-celler i 6 timer med radioaktivt mærket [

14C] stearinsyre fører til at måle produktionen af ​​[

14C] oleinsyre i Scd1- deficiente celler sammenlignet med kontrol scr-behandlede celler. Inkorporeringen af ​​[

14C] stearinsyre var ens i siRNA scr og SCD1-behandlede celler (data ikke vist). Kræftceller transficeret af den ikke-targeting human mRNA siRNA (SCR) præsenteret en desaturering på 31,49% for U2OS og 25,66% for SW480. I de to cellelinjer, SCD1 udslettelse førte til et fald-off i oliesyre biosyntese med en resterende desaturering på 5,135% og 5,28% i U2OS behandlet af siRNA Scd1.A og Scd1.B henholdsvis og 5,89% og 7,55% henholdsvis i SW480 (figur 1C). Endvidere har vi udsat U2OS celler i 24 timer til SCD1 inhibitorer CVT-11127 og MF-438 (10 uM). Vi opnåede tilsvarende kapacitet med SCD1 inhibitorer end siRNA rettet mod SCD1 at inhibere produktionen af ​​oliesyre fra stearinsyre i U2OS celler (figur 1D).

Tilsammen viste disse resultater en drastisk inhibering af SCD-aktivitet i siRNA SCD1 -behandlede celler. Desuden er der i disse cancercellelinier, vises SCD1 som det vigtigste enzym involveret i den endogene produktion af oliesyre.

SCD1 udslettelse fremmer apoptose-celledød

For at vurdere effekten af ​​SCD1 knockdown på celleviabilitet, vi først bestemmes celleantal efter 24 timer, 48 timer og 72 timer efter transfektion under anvendelse CyQuant® reagens, som kvantificerer mængden af ​​nukleinsyrer. Så snart 48 timer efter transfektion celleantal var signifikant mindre i SCD1-depleterede U2OS celler sammenlignet med kontrolceller. Mens relative fluorescens (RF) steg for siRNA scr-behandlede celler langs hele 72 timer efter transfektion havde RF ikke signifikant for siRNA SCD1-lyddæmpede celler under tidsforløbet. Vi observerede, at RF to gange blev gange højere hos siRNA SCR celler sammenlignet med siRNA SCD1-depleteret U2OS 72 h efter transfektion angiver proliferation hæmning eller celledød induktion i SCD1-ablerede celler (figur 2A). Derefter, vi demonstreret ved trypan blå-udelukkelse celletælling 72 timer efter transfektion af siRNA at SCD1 knockdown førte til en formindskelse af cellelevedygtighed såvel U2OS og SW480 celler, men meget mere drastisk i U2OS celler (figur 2B). Mere end 30% af SCD1 siRNA-behandlede U2OS og ca. 20% af SCD1 siRNA-behandlede SW480 var positive for PI er en stigning på tre og to folder i forhold til siRNA scr-behandlede U2OS og SW480 celler, henholdsvis (figur 2C). Inhibering af SCD1 aktivitet af begge forbindelser (CVT-11127 og MF-438) førte også til øge celledød efter 48 timer i en dosis-respons måde (figur 2D). Vi fandt imidlertid, at disse forbindelser forskelligt påvirket cellelevedygtighed med CVT 11127 mere potent for celledød induktion end MF-438 i U2OS. Desuden viste vi, at SCD1 udtømning induceret aktivering af apoptose som vist ved højt niveau induktion af caspase 3-aktivitet og PARP-spaltning (fig 2E og 2F).

A) U2OS celler blev behandlet med siRNA scr (kontrol) og målretning SCD1 (Scd1.A og Scd1.B), og samlet 24 timer, 48 timer eller 72 timer efter transfektion. Proliferation status blev bestemt ved CyQuant® proliferation assay. Hver værdi er gennemsnittet af de relative fluorescensenheder ± SEM af tre eksemplarer og repræsenterer tre uafhængige forsøg. B) U2OS og SW480-celler blev dyrket i 72 timer post-siRNA transfektion og høstes til trypanblåt udelukkelse assay. Værdier er middelværdien ± SEM af tre eksemplarer og repræsenterer to andre uafhængige eksperimenter. C) U2OS ad SW480 celler behandlet 72 timer med siRNA blev opsamlet og samlet celledød blev analyseret ved flowcytometri efter farvning med propidiumiodid (PI). Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM af tre uafhængige forsøg. D) U2OS celler blev behandlet i 48 timer med SCD1 inhibitorer ved angivne koncentrationer og blev høstet for propidiumiodidfarvning. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM fra tre forsøg. E) U2OS celler blev opsamlet 72 timer efter transfektion og forberedt til caspase 3-aktivitet måling ved flowcytometri som beskrevet i materialer og metoder. Data er vist som fold stigning i forhold til kontrollen (siRNA scr) og repræsenterer middelværdien ± SEM af to uafhængige forsøg. F) helcellelysater blev fremstillet 72 timer efter transfektion med siRNA og PARP-spaltning (c-PARP) niveau blev bestemt ved Western-blot. G) U2OS celler blev behandlet i 72 timer med siRNA kontrol (SCR) og målretning SCD1 i fravær (vehikel) eller nærvær af 100 uM oleinsyre bundet til BSA. Celleantal blev kvantificeret ved CyQuant® proliferation assay som tidligere beskrevet. Data er vist som gange ændring over køretøjet siRNA SCR-behandlede celler og repræsenterer middelværdien af ​​relative fluorescensenheder ± SEM af tredobbelt. *, ** P 0,05 vs. siRNA scr-behandlet køretøj og oliesyre celler, henholdsvis ved Anova-analyse efterfulgt af Tuckey test

Vi postulerede derefter at celledød blev udløst ved reduktion af oliesyre. syre celle indhold. Således har vi forpligtede til at supplere siRNA SCD1-depleterede celler med 100 pM oliesyre for at vurdere evnen af ​​eksogent tilskud at vende celledød. Figur 2G fremgår, at eksponering af SCD1-mangelfulde U2OS celler til eksogen oliesyre ikke ændrede hastigheden af ​​cytotoksicitet.

Hæmning af SCD1 udtryk aktiverer delvist udfoldet protein respons

forstyrrelser af ER homeostase fører til ER stress ved UPR aktivering, der kan udløse celledød. For at overvåge aktivering af UPR pathway, undersøgte vi ekspressionsniveauet for GRP78, phospho-eIF2α og ukonventionelle splejsning af Xbp1 mRNA. U2OS og SW480 celler har den funktionelle maskiner til at reagere på thapsigargin-inducerede ER stress, som vi observerede splejsning af Xbp1, opregulering af GRP78 og phospho-eIF2α ekspression (figur 3A og B). Derefter analyserede vi disse ER stress markører i SCD1-manglende celler. Afskaffelse af SCD1 i U2OS og SW480 celler førte til en delvis forarbejdning af Xbp1 mRNA: spliced- og hybrid-Xbp1 (s- og h-Xbp1) mRNA arter blev forøget i SCD1-mangelfulde celler indikerer aktivering af IRE1α arm i begge cellelinier, i en mere udtalt måde i SW480-celler (figur 3A). Oversættelse af s-Xbp1 producerer den funktionelle Xbp1 transcription faktor, som bidrager til en transskription program med henblik på første genoprette ER funktion og celleoverlevelse. Den chaperone GRP78 regulerer også pro-overlevelse vej under ER stress gennem sin opregulering. Men vi var ikke i stand til at observere en sådan regulering i U2OS og SW480 celler til tavshed for SCD1 48 timer efter transfektion (figur 3C). Vi observerede ikke nogen ændring i mRNA og proteinniveauet til GRP78 ekspression på forskellige post-transfektion tid (24, 48 og 72 timer, data ikke vist). PERK også tilhører UPR og dens aktivering inducerer fosforylering af eIF2α udløser undertrykkelse af generel oversættelse. Vi observerede ved 48 timer efter transfektion, at celler med formindsket SCD1 udtrykte højere mængde phospho-eIF2α sammenlignet med kontrolceller tyder aktivering af PERK arm (figur 3D). For at tildele phosphorylering af eiF2αto SCD1 udryddelse og ikke til en artefakt på grund af PKR aktivering med siRNA transfektion, analyserede vi phospho-eIF2α niveau i U2OS behandlet med 5 og 10 uM af SCD1 inhibitor (CVT-11127 og MF-438) i 10 og 24 timer. Vi observerede stigning af p-eIF2α ekspression, så snart 10 timer for begge inhibitorer som viser, at phosphorylering af eIF2α blev induceret ved udslettelse af SCD1 aktivitet (figur 3E).

U2OS og SW480-celler blev behandlet med siRNA kontrol (scr ) og siRNA mod SCD1 i 72 timer. A) Prøver blev fremstillet til mRNA-analyser af Xbp1 forarbejdning ved semi-kvantitativ RT-PCR. PCR-produkterne blev kørt på en 3% agarosegel og den splejsede Xbp1 (sXbp1), ikke-splejset Xbp1 (uXbp1) og hybride Xbp1 (hXbp1) mRNA-arter blev observeret i siRNA-behandlede celler (CTR) og thapsigargine-behandlede celler (Tg) som positiv kontrol af UPR aktivering. B) I alt proteinlysater blev fremstillet ud fra ubehandlet og thapsigargin-behandlede celler (Tg, 0,2 uM, 16 timer), og analyseres for eiF2α phosphorylering og GRP78 opregulering af western-blotting. C og D) SCD1-depleteret U2OS og SW480-celler blev fremstillet som i 3B) og analyseret ved western-blotting for SCD1, GRP78 og phospho-eiF2α ekspression. E) U2OS celler blev behandlet med 5 og 10 uM af SCD1 inhibitorer (MF-438 og CVT-11127) og blev opsamlet efter 10 timer og 24 timer for behandling for phospho-eiF2α ekspression analyse ved western-blotting. Blots er repræsentative for mindst to uafhængige forsøg.

CHOP deltager til SCD1 udtømning celledød

I ER stress-medieret apoptose, CHOP ekspression øges og fremstår som en væsentlig effektor af denne celledød program. Vi først rettet evaluering af CHOP udtryk i cancerceller behandlet med siRNA scr eller mod SCD1. Vi observerede en stigning på CHOP mRNA og proteinekspression i celler, som har mistet SCD1 ekspression sammenlignet med kontrolceller (figur 4A og 4B). For at konstatere rolle CHOP i celledød induktion, vi forbigående transficeret tom vektor (CTR) eller dominant-negativ form af CHOP (DN-CHOP) i U2OS celler. DN-CHOP konstruere havne mutationer i leucin-zipper-domænet (L134A /L141A), som forhindrer dens transkriptionsaktivitet [37]. Vi viste ved PI farvning, at DN-CHOP overekspression reduceret cytotoksicitet induceret af SCD1 hæmning sammenlignet med kontrol-transficerede celler (CTR) (Figur 4C). Desuden har vi estimeret effekten af ​​tvungen udtryk for DN-CHOP på aktiv caspase 3 induktion i SCD1-lyddæmpede U2OS. Vi viste et fald på caspase 3 aktivering i SCD1 knockdown-U2OS celler, der udtrykker DN-CHOP og dokumenteret en beskyttende effekt af DN-CHOP mod apoptose induceret af SCD1 udtømning (figur 4D).

A) U2OS og SW480 celler blev behandlet med siRNA kontrol (SCR) og siRNA mod SCD1 i 72 timer. Total RNA blev isoleret og CHOP-mRNA-ekspression normaliseret til p-actin-mRNA-ekspression blev kvantificeret ved realtid RT-PCR. Resultater blev repræsenteret som middelværdi gange induktion ± SEM forhold til siRNA scr-behandlede celler fra mindst tre uafhængige forsøg. *, P 0,05 vs. siRNA scr-behandlede celler ved Anova-analyse efterfulgt af Tuckey test. B) Nuclear ekstrakter fra U2OS blev fremstillet 72 timer efter siRNA tilsætning. CHOP udtryk blev analyseret ved western-blotting og lamin A /C blev lastning kontrol af prøver nukleare ekstrakt. C) U2OS celler blev transient transficeret med tom (CTR) eller dominant-negativ CHOP (DN-CHOP) ekspressionsvektor og udvalgt i tre dage i G418. Resistente celler transficeret med ctr eller DN-CHOP-konstruktionen blev behandlet af siRNA kontrol scr eller mod SCD1 (Scd1.A og Scd1.B) i 72 timer og høstet til propidiumiodidfarvning analyse ved flowcytometri. Værdier blev vist som fold stigning i forhold til kontrollerne (siRNA scr) og repræsenterer middelværdien ± SEM af to uafhængige forsøg. *, **, P 0,05 vs. siRNA scr-behandlede CTR og DN-CHOP celler henholdsvis ved Anova-analyse efterfulgt af Tuckey test. #, P 0,05 af Anova-analyse efterfulgt af Tuckey test. D) U2OS celler blev fremstillet som C) og høstet til aktiv caspase 3 analyse ved flowcytometri. Værdier blev vist som fold stigning i forhold til kontrollerne (siRNA scr) og repræsenterer middelværdien ± SEM for tre uafhængige forsøg. *, **, P 0,05 vs. siRNA scr-behandlede CTR og DN-CHOP celler henholdsvis ved Anova-analyse efterfulgt af Tuckey test. #, S. 0,05 af Anova-analyse efterfulgt af Tuckey test

CHOP udslettelse delvis opvejer SCD1 udtømning-induceret apoptose

Den beskyttelse, observeret af CHOP hæmning mod SCD1 udtømning-medieret U2OS celle døden er også blevet vurderet i HCT116 colon tumorcellelinie. I dette mål, vi brugte forbigående CHOP knockdown-HCT116 og BA1 celler, der er HCT116 celler stabilt transficeret med antisense human CHOP cDNA konstruere [38]. Udtømning af SCD1 med siRNA i HCT116 induceret mere end 30% af celledød afsluttet med PI-farvning (figur 5A). Vi viste også ved 72 h, at udryddelsen af ​​SCD1 aktivitet ved siRNA og inhibitorer (data ikke vist) inducerede apoptose i HCT116 fremgår af aktiv caspase 3 eller PARP-spaltning detektion (figurerne 5B og 5C). I de celler, vi fandt også, at afskaffelsen af ​​SCD1 udtryk førte til opregulering af CHOP mRNA ekspression som allerede observeret for U2OS og SW480-celler (Figur 5D). Desuden bekræftede vi, som i U2OS at reduktion af CHOP udtryk delvist afhjælpes cytotoksicitet induceret af SCD1 lyddæmpning. Faktisk observerede vi en formindskelse af PI farvning i BA1 celler i forhold til deres forældres HCT116 (p-HCT116) modstykker da SCD1 udtryk blev afskaffet (figur 5E). Endvidere beskyttelse mod SCD1 inaktivering-medieret celledød induceret af CHOP udslettelse syntes at være specifik og ikke en beskyttelse mod alle pro-apoptotiske faktorer. Faktisk havde udslettelse af CHOP ikke ændre apoptose induktion ved etoposid i DN-CHOP U2OS eller BA1 forhold til deres respektive kontrolceller (data ikke vist). Vi har også forpligtet sig til at evaluere effekten af ​​CHOP udslettelse af siRNA behandling på apoptose induceret af SCD1 afskaffelse. Til dette formål har vi udført co-behandling af HCT116 celler med siRNA kontrol (SCR) eller rettet mod SCD1 (Scd1.A og Scd1.B), og med siRNA CHOP eller kontrol (-). Vi valideret CHOP siRNA i HCT116-celler og viste, at CHOP siRNA ikke ændrede SCD1 mRNA udslettelse niveau induceret af SCD1 siRNA’er (data ikke vist). For at estimere CHOP funktion i SCD1-induceret apoptose, derefter udført vi siRNA co-transfektion. Vi observerede 72 timer efter transfektion, der CHOP tavshed beskyttet HCT116 mod apoptose-celledød induceret af SCD1 udslettelse (figur 5F og 5G).

A) HCT116 celler behandlet 72 timer med siRNA-kontrol (SCR) eller målrette SCD1 ( Scd1.A og Scd1.B) blev opsamlet og samlet celledød blev analyseret ved flowcytometri efter farvning med propidiumiodid. Resultaterne var middelværdien ± SEM af tre eksperimenter udført i triplikat. B) HCT116-celler behandlet med siRNA blev opsamlet 72 timer efter transfektion og forberedt til caspase 3-aktivitet måling ved flowcytometri som beskrevet i materialer og metoder. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM af tre uafhængige forsøg. C) HCT116 blev behandlet som i A) og høstet til analyse af SCD1 og PARP-kløvning udtryk ved Western-blotting. D) HCT116 blev behandlet som i A) og høstet til total RNA oprensning. CHOP og SCD1 mRNA-ekspression blev analyseret ved realtids RT-PCR efter normalisering til p-actin. Alle eksperimenter repræsenterer mindst to gentagelser i tre eksemplarer. E) HCT116-celler blev stabilt transficeret med antisense human CHOP cDNA konstrukt og dets tom vektor kontrol. BA1 og p-HCT116 er HCT116 kloner med antisense CHOP-konstruktion og styrevektor hhv. Celler blev bragt til tavshed af siRNA Scd1.A og Scd1.B i 72 timer og høstes for total celledød analyse ved flowcytometri efter farvning med propidiumiodid. Resultaterne var gennemsnittet af gange ændring for PI-positive celler i forhold til de tilsvarende siRNA SCR HCT116 celler ± SEM af et repræsentativt eksperiment fra tre eksperimenter udført i triplikat. *, **, P 0,05 over siRNA scr-behandlede p-HCT116 og BA1 celler henholdsvis ved ANOVA-analyse efterfulgt af Tuckey test. #, P 0,05 af Anova-analyse efterfulgt af Tuckey test. F) og G) HCT116 celler blev transficeret med siRNA scr, Scd1.A eller Scd1.B på 75 nM, og enten med 25 nM siRNA scr (-) eller siRNA CHOP. Celler blev opsamlet ved 72 timer efter transfektion for PI-farvning og aktiv caspase 3 analyser ved flowcytometri. Resultaterne var middelværdien ± SEM af et repræsentativt eksperiment fra to uafhængige forsøg udført tredobbelt. *, **, P 0,05 vs. tilsvarende siRNA scr-behandlede HCT116 celler ved Anova-analyse efterfulgt af Tuckey test. #, S. 0,05 af Anova-analyse efterfulgt af Tuckey test

SCD1 udtømning ikke påvirker levedygtigheden af ​​ikke kræftceller

Kræftceller var følsomme over for SCD1 udtømning-medieret celledød .Vi var så interesseret i at analysere den potentielle effekt af et fravær af

de novo

MUFA syntese i ikke kræftceller. I dette mål, vi evaluerede virkningen af ​​SCD1 inhibering ved hjælp siRNA på normale humane dermale fibroblaster (NHDF). Disse celler har en basal desaturering sats omkring 15% lavere end U2OS og SW480-celler som tidligere vist i figur 1C. Deres behandling med siRNA Scd1.A eller Scd1.B førte til en reduktion af SCD aktivitet for at nå frem til en resterende aktivitet på 8,3% og 6,3%, henholdsvis (figur 6B). Den tilbageværende SCD aktivitet svarede til den, der opnås for cancerceller behandlet med siRNA SCD1. Som vist ovenfor ablation af SCD-aktivitet i cancerceller førte til cytotoksicitet henviser udtømning af SCD1 ekspression ikke inducerede celledød i NHDF men reduceret meget lidt deres celleantal (fig 6C og 6D). Derefter, i ikke cancerceller, kan SCD1 ophævelsen blokere proliferation uden at påvirke cellernes levedygtighed.

Normale humane dermale fibroblaster (NHDF) blev transficeret med siRNA kontrol (SCR) og siRNA targeting SCD1 (Scd1.A og Scd1.B ). NHDF celler blev høstet efter 72 timer siRNA behandling og høstes til yderligere analyser. A) I alt proteiner blev forberedt SCD1 udtryk analyse ved western-blotting. B) NHDF behandlet 72 timer med siRNA blev inkuberet i yderligere 6 timer med [

14C] stearinsyre og total lipid ekstraktion blev udført. Omdannelse af [

14C] stearinsyre i oliesyre blev udført ved HPLC. SCD-aktivitet blev udtrykt som forholdet% af [

14C] oliesyre til [

14C] olein- og stearinsyre. Værdier repræsenterer middel ± SEM i mindst to separate forsøg. C) Proliferation status siRNA-behandlede NHDF blev bestemt ved angivne tid ved CyQuant® proliferation assay. Hver værdi er gennemsnittet af de relative fluorescensenheder ± SEM for tre uafhængige forsøg. D) NHDF blev opsamlet 72 timer efter transfektion og total celledød analyse blev udført ved flowcytometri efter farvning med propidiumiodid. Resultaterne var middelværdien ± SEM af PI-positive celler (%) af en repræsentant fra to eksperimenter udført i triplikat. *, P 0,05 vs. siRNA SCR-behandlede celler ved Anova-analyse efterfulgt af Tuckey test

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi viste, at SCD1 udtryk lyddæmpning ført til induktion. af UPR markører (Xbp1 splejsning, p-eIF2α og CHOP) og CHOP-afhængig celledød i kræftceller. Vi viste ligeledes, at ophævelsen af ​​de novo MUFA synteserute af udryddelse af dets hastighedsbegrænsende enzym SCD1 ændret levedygtighed cancerceller uden at ændre overlevelsen af ​​ikke cancerceller. Disse data tyder på forskellige behov i de novo MUFA syntese for normale og tumorceller. Ikke desto mindre er exogen tilsætning af oliesyre, de store MUFA produkt af SCD1 aktivitet, forhindrede ikke celledød af kræftceller i hvilke endogene MUFA biosyntese blev undertrykt.

I denne rapport, vi er enige med tidligere rapporter, der beskriver, at SCD1 udslettelse førte til celledød ved apoptose i forskellige typer af kræftceller [22], [25], [27], [39]. Faktisk observerede vi induktion af caspase 3-aktivitet og PARP-spaltning (figur 2D et 2E) i SCD1-udtømte celler.

Vi har også dokumenteret i dette arbejde, som normale og kræftceller ikke reagerede på samme måde til forebyggelse af MUFA syntese af SCD1 udryddelse. Faktisk mens kræftceller blev dræbt af SCD1 udtømning, non kræftceller stadig var i live. Men vi observeret et mindre fald i celle nummer i SCD1 behandlet NHDF at en blok eller en langsommere spredning kunne forklare. Vi kan så hypotese, at levedygtigheden af ​​ikke cancerceller forblev upåvirket på grund af det faktum, at de ikke kræver en sådan hurtig og høj MUFA syntese. Ja, de prolifererer ved lavere hastighed (figur 6C), og fortrinsvis vedvarende nye membran syntese ud fra eksogene fedtsyrer up-take henviser cancerceller prolifererer ved højere hastighed og brug de novo-fedtsyresyntese [10].

Vi og