PLoS ONE: In vivo Målretning af ADAM9 Gene Expression Brug lentivirus-Delivered shRNA Undertrykker Prostata Cancer Vækst ved Regulering REG4 Afhængig cellecyklus Progression

Abstrakt

Kræftceller reagerer på stress ved at aktivere en række overlevelse signalveje. En disintegrin og metalloproteinase (ADAM) 9 opreguleres under kræft progression og hormonbehandling, fungerer dels gennem en stigning i reaktive ilt arter. Her præsenterer vi

in vitro

in vivo

beviser for, at terapeutisk målretning af ADAM9 genekspression ved lentivirus leveret lille hårnål RNA (shRNA) signifikant hæmmede spredning af menneskelige prostata cancer cellelinjer og blokeret tumorvækst i en murin model for prostatacancer knoglemetastaser. Cellecyklus undersøgelser bekræftede en forøgelse i G1-fasen og fald i S-fasen population af cancerceller under sult stress betingelser, som korrelerede med forhøjede intracellulære superoxid-niveauer. Microarray data viste signifikant nedsatte niveauer af regenererende ø-afledte familiemedlem 4 (REG4) udtryk i prostata kræftceller med knockdown af ADAM9 genekspression. Denne REG4 nedregulering resulterede også i induktion af ekspressionen af ​​p21

Cip1 /WAF1, som negativt regulerer cyclin D1 og blokerer G1 /S overgang. Vores data viser en ny molekylær mekanisme ADAM9 i reguleringen af ​​prostatakræft celledeling, og foreslår en kombineret modalitet af ADAM9 shRNA genterapi og cytostatika for hormon refraktær og knogle metastatisk prostatacancer

Henvisning:. Liu CM , Hsieh CL, han YC, Lo SJ, Liang JA, Hsieh TF, et al. (2013) In vivo Målretning af ADAM9 Gene Expression Brug lentivirus-Delivered shRNA Undertrykker Prostata Cancer Vækst ved Regulering REG4 Afhængig cellecyklusprogression. PLoS ONE 8 (1): e53795. doi: 10,1371 /journal.pone.0053795

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: September 6, 2012; Accepteret: December 3, 2012; Udgivet: januar 16, 2013 |

Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af NSC99-2320-B-039-029-MY3 for National Science Council, Taiwan (https://web1.nsc.gov.tw); NHRI-EX99-9902BI, NHRI-EX100-9902BI og NHRI-EX101-9902BI for National Health Research Institute, Taiwan (https://www.nhri.org.tw). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

forekommer i mere end 80% af avanceret stadie sager prostatacancer, knoglemetastaser korrelerer med en høj grad af sygelighed; en 5 års overlevelse på 25% og median overlevelse på ca. 40 måneder [1]. Skeletale metastaser, på grund af udviklingen af ​​knoglesmerter, cancerassocierede knoglefrakturer og spinal kompression, samt kraniel neuropati, anæmi og infektion, kan væsentligt forringe livskvaliteten af ​​patienter med prostatacancer [2], [3]. Øjeblikket, androgen deprivation er den første linje i behandling for metastatisk prostatacancer; dog vil prostatakræft ofte videre til en androgen-uafhængig knogle-metastatisk stadie. Når denne progression forekommer, kemoterapi og strålebehandling er de vigtigste terapeutiske muligheder, som begge forårsager ubehagelige bivirkninger, og kun leverer et begrænset fordel til mængden og livskvalitet [4]. Derfor er det vigtigt at forfølge nye terapeutiske faktorer, der kan have potentiale til at forbedre overlevelsen af ​​patienter med hormon refraktær og knogle metastatisk prostatacancer.

På trods af de seneste fremskridt inden for terapeutiske strategier, mange maligne kræft stadig udvikle resistens over for stråling og målrettede behandlinger [5], [6]. Resistens forekommer som et resultat af stress respons, så maligne celler til at overvinde den cytotoksiske virkning af mange terapier [7]. En disintegrin og metalloproteinase (ADAM) 9 er et vigtigt medlem af et disintegrin og metalloproteinase-genfamilien. Proteinerne kodet af denne familie medierer cellulære reaktioner på miljømæssige stress ved at interagere med en række celleoverfladeproteiner og regulering diverse cellulære processer, herunder proliferation, ekstracellulære matrix binding, og ektodomæne kaste [8] – [12]. Tidligere arbejde udført af vores gruppe [13] og andre [14] har vist i kliniske studier, at højere ADAM9 niveauer korrelerer med en kortere periode med prostatakræft remission. Vi demonstrerede også en signifikant sammenhæng mellem tumor ADAM9 farvning og risikoen for prostatacancer tilbagefald og død hos patienter, som gennemgik hormonbehandling, hvilket antyder, at en gradvis stigning i ADAM9 ekspression kan anvendes som en biomarkør for dårlig prognose hos patienter med prostatacancer efter hormonbehandling [15]. Desuden knockdown af ADAM9 ekspression resulterer i øget radiosensitivitet og kemosensitivitet terapeutiske midler [16], hvilket indikerer, at ADAM9 overekspression af kræftceller kan være potentielle flugt mekanisme til at overvinde stress-induceret kræft celledød; dog lidt om de nedstrøms regulatoriske mekanismer, som ADAM9 fremmer kræft celle overlevelse som reaktion på stress. Da der observeres forhøjet ADAM9 udtryk i mange avancerede tumorer, hæver det muligheden for, at ADAM9 kunne være en potentiel biomarkør for kræft målrettet genterapi, selv om mere forskning er nødvendig.

I den foreliggende undersøgelse, vi vurdere mulighederne for lentiviral vektor-leveret lille hårnåle-RNA (shRNA) mod ADAM9 til behandling af androgen-uafhængig og knogle metastatisk human prostatacancer i en eksperimentel dyremodel. Den molekylære mekanisme bag den terapeutiske virkning af ADAM9 målrettet genterapi blev også belyst.

Materialer og metoder

Materialer

Retrovirale vektorer indeholdende shRNA som målretter ADAM9 og kontrol shRNA blev opnået fra Open Biosystems (Lafayette, CO). Lentiviral vektor ADAM9 shRNA og kontroller blev opnået fra National RNAi Core Facility på Institut for Molekylær Biologi /Genomisk Research Center, Academia Sinica, Taiwan. De anti-ADAM9 antistoffer blev opnået fra R Hospital) i henhold til producentens anvisninger. BT474 cellelysat (celler blev behandlet med 500 nM doxorubicin natten over) blev opnået fra Dr. Wei-Chien Huang ved China Medical University Hospital. Til lastning kontrol blev blots probet med et anti-EF1-α monoklonalt antistof (1:10,000; Millipore). Efter inkubation med et HRP-konjugeret sekundært antistof (1:5000; GE Healthcare Life Science), blev påvist kemiluminescerende signaler ved hjælp af en ECL Plus kit og blots blev udsat for Hyperfilm ECL (GE Healthcare Life Science). Protein band kvantificering blev udført ved hjælp af ImageJ software (https://rsbweb.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, USA).

Måling af Reactive Oxygen Species

Celler blev udsået på retter på 70-80% sammenløb og sultet natten over. Til kvantificering analyse blev celler trypsinbehandlet, centrifugeret og resuspenderet i HBSS med eller uden 5% FBS (alt efter om de blev udsat for stråling eller sult). Hydrogenperoxid blev påvist under anvendelse dichlorofluorescindiacetate (DCF, 2 uM) (Invitrogen). Superoxid blev påvist under anvendelse dihydroethidium (DHE, 10 uM) (Invitrogen). Superoxid billeddannelse blev påvist under anvendelse MitoSox Red mitokondrie superoxid indikator (Invitrogen). Prøver blev inkuberet i 40 minutter ved stuetemperatur i mørke på en rotator. Analyse af DCF og DHE fluorescens blev udført ved anvendelse af en FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) ifølge producentens instruktioner. Til billeddannelse af mitokondrie superoxid generation blev cellerne udsultet i 24 timer efterfulgt af lastning med MitoSOX Rød, Alexa-488 WGA og DAPI (Invitrogen) i 30 minutter og visning under et fluorescensmikroskop.

celleproliferationsassay

effekten af ​​ADAM9 shRNA på celleproliferation blev målt ved direkte tælling af antallet af celler. Kort beskrevet blev celler udpladet ved en densitet på 1 x 10

5 på 60 mm skål. På angivne tidspunkter blev cellerne fjernet ved trypsinisering, og antallet af levedygtige celler blev talt i et hæmocytometer under anvendelse af trypanblåt (0,4%) farvning.

klongenicitetsassayet

I den klonogenisk celleproliferationsassay blev cellesuspensioner fremstilles ved behandling med 0,25% trypsin og 0,05% EDTA. Efter beregning cellekoncentrationen anvendelse af et hæmocytometer, blev 100 celler udsået i 6-brønds plader med T-medium og 5% FBS i 2 uger. Antallet af kolonier i hver brønd blev bestemt ved at tælle antallet af celler i hver koloni. Kun kolonier med ≥ 50 celler blev defineret som en succes. For at identificere kolonier blev mediet udtaget og 3,7% formaldehyd blev tilsat i 15 minutter, efterfulgt af inkubation i 1 ml krystalviolet i 15 minutter ved stuetemperatur. Koloni billeder blev taget og celletal beregnet ved hjælp ImgaeJ.

Transwell Invasion Assay

invasionsevne af kræftceller blev vurderet ved hjælp af 24-såvel Transwell (Corning, Lowell, MA) plader. Kort fortalt, 2 × 10

5-celler i medium indeholdende 0,5% FBS blev tilsat til det øvre kammer indeholdende 8 um pore polycarbonat overtrukket med 1 mg /ml matrigel; det nedre kammer blev fyldt med medium indeholdende 5% FBS. Efter 16 h inkubation blev den øvre overflade af membranen skrubbes med en vatpind. De invaderende celler på den nedre overflade af membranen blev fikseret og farvet med 0,5% krystalviolet. Tilfældige felter (5 pr membran) blev fotograferet ved 40x forstørrelse til beregning celleantal. Desuden blev celler kvantificeret ved at måle absorbansen af ​​farvestof ekstrakter ved 570 nm i 100 pi Sorensons opløsning (9 mg tirsodium citrat, 305 ml destilleret vand, 195 ml 0,1 N HCI, 500 ml 90% ethanol).

sårheling Assay

cellerne resuspenderet i dyrkningsmedium blev podet i plader med 24 brønde. En enkelt sår blev skabt i midten af ​​cellemonolaget ved forsigtig fjernelse af de vedhæftede celler med en steril plastik pipette tip efter cellekulturer nåede ≥90% konfluens. Den debris blev fjernet ved vask med serumfrie medier. Celler, som vandrede ind i det sårede område eller dem rager ud fra kanten af ​​såret blev visualiseret og fotograferet under et Zeiss Axioplan mikroskop (Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY) med en 10 x objektiv på fem forudvalgte tidspunkter (0, 2, 4 , 6 og 8 timer). Hvert forsøg blev uafhængigt udført mindst tre gange.

immunhistokemisk farvning

Fem-micron tykke paraffin vævssnit blev deparaffineret og rehydreret. Vævssnittene blev inkuberet i 2 timer med monoklonalt muse-anti-humant ADAM9 antistof (1:50 fortynding, R snit blev derefter modfarvet med hematoxylin automatisering (DAKO) i 15 minutter. Specificiteten af ​​mærkning ved denne procedure blev verificeret ved negative kontrolreaktioner under anvendelse buffer til at erstatte det primære antistof og isotype-specifikt IgG. Massons trichromfarvning blev udført under anvendelse af en Massons trichrom pletten kit (Sigma-Aldrich) ved at følge standard protokollen tilvejebragt af producenten.

tartrat-resistent syrephosphatase (TRAcP) Farvning af Bone

Immunfarvning med TRAcP blev udført ifølge producentens protokol (Takara Bio Inc., Shiga, Japan). Kort fortalt blev paraffinindlejrede muse tibiaknoglen sektioner deparaffineret og rehydreret for trac Posteolytic reaktionen. Knoglen snit blev inkuberet med substratopløsningen (0,1 volumen natriumtartrat i Naphthol-AS-BI-phosphat /Fast Red Violet LB-substrat-opløsning, pH 5,2) ved 37 ° C i 45 minutter. Efter vask af objektglasset med destilleret vand og tilsætte glycerol at undgå dehydrering blev prøverne undersøgt under mikroskopet.

Bestemmelse af det cellulære DNA indhold ved FACS-analyse

Cancerceller blev udpladet med 1 × 10

6 celler pr 100 mm skål og udsultet i enten 24 eller 48 timer. Celler blev tryspinized og underkastet cellecyklus-analyse under anvendelse propidiumiodid som tidligere [18] rapporterede. Den relative DNA-indhold af kernerne blev målt ved FACSCalibur (BD Bioscience).

In vivo

xenograftmodeller

Fem uger gammel mand athymiske nøgne (nu /nu ) mus opnået fra National Laboratory Animal center på Taiwan blev brugt til subkutan (sc), intrakardial, og intratibial tumor implantation. Celler blev dyrket til 100% sammenløb, trypsineret og optalt. Mus blev sederet med 1,7% isofluran blandet med luft for s.c. tumorimplantation. Xenotransplantattumorer blev oprettet ved subkutan injektion af 10

6 PC3 celler, der udtrykker pSM2c eller shADAM9 celler i 100 pi PBS i begge sider af hver mus. Dyr blev aflivet efter 8 uger. Der var ingen signifikante forskelle i vægt mellem dyrene med og uden s.c. tumorer på tidspunktet for aflivning. For intratibial tumor injektion blev en 27-gauge nål anvendes til at bore et hul i marvkavitetsareal gennem tibiale plateau i både venstre og højre skinneben. En 28-gauge Hamilton-sprøjte blev anvendt til at injicere 5 x 10

5 celler i et volumen 50 pi ind i marven hulrum. Tumorvækst blev overvåget ved både bioluminescens og røntgenstråler gang om ugen. Dyr blev aflivet efter 8 uger. Skinneben blev fjernet, vasket i PBS og fikseret i 10% formaldehyd ved stuetemperatur i 24 timer. Bone prøver blev vasket med PBS efterfulgt af afkalkning med 0,25 M EDTA i PBS (pH 7,4) ved stuetemperatur i 6 uger. EDTA i afkalkning løsninger blev ændret ugentligt. Tumorvækst blev monitoreret ugentligt ved anvendelse af et bioluminescens imaging system (Xenogen IVIS 200-serien, Caliper, Hopkinton, MA).

RNA-ekstraktion og DNA microarray analyse

Totalt RNA blev isoleret fra dyrkede celler (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) ved at følge fabrikantens protokol. Rensede RNA-prøver blev forelagt falanks Biotech for microarray analyse ved hjælp af menneskelige Whole Genome OneArray® Microarray v5 (falanks Biotech Group, Inc., Hsinchu, Taiwan). Hver microarray indeholder 29,187 humane genom prober og 1088 eksperimentelle kontrol prober. Detaljeret beskrivelse af microarray procedurer og hele genomet gen amp; probe lister er tilgængelige fra https://www.phalanxbiotech.com/tech_support/general.php.

Overekspression af REG4

Den fulde længde REG4 kodende region blev amplificeret ved PCR under anvendelse af primerne listet i Materialer og metoder S1, og subklonet ind p3XFLAG-CMV-7,1 (Stratagene, Santa Clara, CA) eller pcDNA3.1 (Invitrogen) vektorer. De REG4 konstruktioner blev transient transficeret ind i PC3

shADAM9 anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ved at følge standard protokol. Overudtrykt REG4 blev bekræftet ved immunoblotting (R Nederste billede: mus med en destruktiv knogle læsion i det venstre ben og ingen læsion i højre ben. (D) Histologisk imaging viser, at både trabekulære og kortikale knogle blev erstattet af PC3

shGFP tumor. I modsætning hertil trabekulære og kortikal knogle var stadig intakt i PC3

shADAM9 tumor (H 0,01). (. figur 2e), hvilket indikerer, at tavshed ekspression af ADAM9 reducerede evne prostata kræftceller til at fremkalde osteoklastogenese i knoglen

Målretning ADAM9 Expression af intratumoral Levering af shRNA Undertrykker prostata cancer vækst i mus

for at undersøge om shRNA-medieret hæmning af ADAM9 udtryk repræsenterer en lovende strategi for prostatakræft genterapi, PC3 celler blev subkutant indpodet i begge flanker af nøgne mus. Tumorerne fik lov til at vokse til en størrelse på cirka 200 mm

3. Ti af femten mus, der havde PC3 svulster på begge flanker blev udvalgt til at modtage den intratumoral injektion af 1 x 10

5 cfu lentivirusvektorer (LV) bærer shGFP (venstre side flanke) eller shADAM9 (højre side flanke) ugentlig for i alt 6 uger (fig. 3a), og de resterende 5 mus tjente som kontroller ved at modtage PBS injektioner. Nedsat prostata tumorvækst blev observeret i tumorer behandlet med LV-shADAM9 forhold til gruppen behandlet med LV-shGFP eller PBS (fig. 3b). Den gennemsnitlige tumorstørrelse efter 6 ugers behandling med PBS eller LV-shGFP var 782.7 ± 174,6 mm

3 og 1027 ± 272.2 mm

3, hhv. Derimod størrelsen af ​​tumorer behandlet med LV-shADAM9 behandling var 135,9 ± 72,4 mm

3. Niveauet af ADAM9 ekspression blev nedsat i tumorer behandlet med LV-shADAM9 terapi, som bekræftet af både væv farvning (Fig S4d-f.), Og immunoblotting (figur 3c;.

s

≤0.05).

(a) Skematisk af ADAM9 knockdown terapi eksperiment. Mus blev injiceret subkutant med PC3-celler i begge flanker, og tumorstørrelse blev målt to gange om ugen indtil størrelsen nåede ca. 200 mm

3. Mus modtog derefter injektioner af enten PBS i begge tumorsteder (n = 5) eller shGFP lentivirus ind i venstre side tumor og shADAM9 ind i den højre side (n = 10). Vira blev injiceret og tumorer målt ugentligt i 6 på hinanden følgende uger. (B) Efter shADAM9 terapi, tumor volumen ikke stige i forhold til shGFP terapi eller PBS-kontroller (**

s

≤0.01, Students

t

test). (C) Immunoblotting assay af ADAM9 udtryk bekræfter faldt ADAM9 udtryk efter shADAM9 terapi. EF-1α blev anvendt som en belastning kontrol (*

s

≤0.05; **

s

≤0.01, Students

t

test). (D) Statistisk analyse af Ki67-farvning. shADAM9 terapi faldt betydeligt celleproliferation aktiviteter i PC3 tumorer. PBS og shGFP terapi viste ingen forskel i spredning indekset (**

s

≤0.001, One Way ANOVA). (E) Statistisk analyse af TUNEL farvning viste ingen signifikant (NS) forskel mellem behandlinger (

s

≥0.05, One Way ANOVA).

For at bestemme de cellulære reaktioner forbundet med LV -shADAM9 terapi, tumor proliferation (Ki-67 indeks, fig. S4g-i) og apoptose markør-farvning (TUNEL indeks, fig. S4j-l) af tumor snit blev udført. Vi fandt ikke en signifikant forskel mellem antallet af apoptotiske celler i kontrollen og LV-shADAM9 (fig. 3e og fig. S4j-l). I modsætning hertil behandling med LV-shADAM9 resulterede i et dramatisk fald i antallet af Ki-67-positive celler i sammenligning med både PBS og LV-shGFP behandlinger (fig. 3d og fig. S4g-i). Disse data viste, at

in vivo

levering af LV-shADAM9 effektivt regredere tumorvækst ved hæmning af celledeling snarere end induktion af apoptotisk celledød.

Knockdown ADAM9 inducerer cellecyklusstop ved G1 /S Overgang under stress betingelser

for yderligere at afgrænse den mekanisme af LV-shADAM9 terapi-induceret tumor væksthæmning, cellecyklus fordelingen mellem ADAM9-dygtige PC3

shGFP og ADAM9-mangelfuld PC3

shADAM9 celler dyrkes under serum-udsultning eller serum-suppleret (5% FBS) betingelser blev analyseret. Mens PC3

shGFP og PC3

shADAM9, under normale forhold, viste ikke en ændring i cellecyklus-profiler, blev S-fasen befolkning faldt betydeligt med tiden (24-48 timer) i serum-udsultet PC3

shADAM9 celler sammenlignet med det i PC3

shGFP. Denne reduktion blev ledsaget af øget procentdel af celler i G1-fasen (fig. 4a). Et lignende resultat blev opnået ved anvendelse LNCaP-celler (fig. 4B). Desuden immunoblotting studier af G1 /S overgang-relaterede proteiner viste en signifikant højere niveau af p21

Cip1 /WAF1. Endvidere blev et lavere cyclin D1 induceret i PC3

shADAM9 end i PC3

shGFP under serumudsultning betingelser (fig. 4C). Selvom serum sult ikke forvoldte nogen yderligere ændringer i ekspressionsniveauet af p27

Kip1 i enten PC3

shADAM9 eller PC3

shGFP, det basale niveau af p27

Kip1 var højere i PC3

shADAM9 . Taget sammen indikerer disse resultater, at bestrålingen af ​​PC3

shADAM9 til serum sult fremkalder en G1 cellecyklusstandsnings. Øget udtryk for p21

Cip1 /WAF1and p27

Kip1 blev også påvist i LNCaP

shADAM9 under normale dyrkningsbetingelser (fig. 4d).

Sult reducerede S-fasen cellepopulation i ADAM9 knockdown kræftceller sammenlignet med kontroller i PC3 (a), LNCaP (b). (C) Expression niveauer af p21

Cip1 /WAF1, p27

Kip1, og cyklin D1 steg i shADAM9 celler under sult stress betingelser i PC3 celler. (D) Expression niveauer af p21

Cip1 /WAF1 og p27

Kip1 steg i LNCaP

shADAM9 under både normale og sult betingelser.

På grund af vores tidligere fund, at ADAM9 er en stress-responsive protein, der kan understøtte prostatakræft celleoverlevelse og progression under intense oxidative stress betingelser [13], [19], søgte vi at bestemme, om serum sult, en

in vitro

tilstand, der efterligner den fjendtlige tumor mikromiljø [16], [19], kan inducere den intracellulære oxidative stress i hvilken ADAM9-deficiente celler mislykkedes at overvinde. Vi har registreret en stigning i endogene superoxid niveauer i både PC3

shGFP og PC3

shADAM9 celler efter 24 timers serum udsultning sammenlignet med celler dyrket under serum suppleret betingelser som målt ved levende celler med en MitoSox rød fluorescerende probe ( fig. 5a) samt flowcytometri med det fluorescerende farvestof, dihydroethidium (DHE) (fig. 5b). Især PC3

shADAM9 udstillet signifikant højere superoxid indhold end PC3

shGFP, enten på det basale niveau eller fremkaldt af serum sult. I modsætning hertil blev der ikke ændringer i niveauet af intracellulær hydrogenperoxid findes i enten PC3

shGFP eller PC3

shADAM9 celler, som analyseret ved flowcytometri med DCFH-DA prober (fig. 5c). Disse data viser, at serum-udsultning-induceret oxidativt stress i prostatacancerceller medieres, i det mindste delvis gennem superoxid, men ikke hydrogenperoxid, et resultat, der ligner vores tidligere observation involverer ioniserende stråling-induceret reaktive oxygenarter (ROS) generation [16 ].

(a) PC3

shGFP og PC3

shADAM9 celler blev dyrket i enten 5% FBS eller under serumudsultning i 24 timer, efterfulgt af behandling med 0,5 pM MitoSOX fluorescens. Samme intensitet af fluorescens blev anvendt i hver billedoptagelse til kvantificering af superoxid niveauer.