PLoS ONE: hæmmende effekt af tumorsuppressor p53 på proinflammatorisk chemokinekspression i æggestokkene Cancer Cells ved Reduktion proteasomalaktivitet Nedbrydning af IκB

Abstrakt

Kræft i æggestokkene, en af ​​inflammationsassocierede kræftformer, er den femte hyppigste årsag til kræft dødsfald blandt kvinder. Betændelse i tumor mikromiljø er forbundet med tumor formidlings- og massive peritoneal ascites, som bidrager til høj dødelighed i kræft i æggestokkene. Tumor suppressor p53 ofte deleteret eller muteret i aggressive og high-grade ovariecancer, sandsynligvis skærpende cancer progression og øget dødelighed. Vi undersøgte derfor indflydelse af p53 på proinflammatoriske chemokiner i ovariecancerceller. Et PCR array af kemokinet nettet afslørede, at ovariecancerceller med lav eller muteret p53-ekspression udtrykte høje niveauer af proinflammatoriske chemokiner såsom CXCL1, 2, 3 og 8. Forbigående transfektion af p53 i p53-nul-ovariecancerceller nedreguleret proinflammatoriske chemokiner induceret af tumornekrosefaktor-α (TNF), et proinflammatorisk cytokin rigeligt udtrykt i ovariecancer. Endvidere p53 genopretning eller stabilisering blokeret TNF-induceret NF-KB promotoraktivitet og reduceret TNF-aktiverede IKB. Genoprettelse af p53 øget ubiquitinering af IKB som følge af samtidigt reduceret proteasomaktivitet efterfulgt af stabiliteten af ​​IKB. En ubiquitinering PCR array på restaurering af p53 afslørede ikke nogen signifikant ændring i udtryk bortset Mdm2, hvilket indikerer, at balancen mellem p53 og Mdm2 er vigtigere i regulering af NF-KB signalering i stedet for den direkte virkning af p53 på ubiquitin-relaterede gener eller IKB-kinaser. Desuden nutlin-3, en specifik inducer af p53 stabilisering, inhiberede proinflammatoriske chemokiner ved at reducere TNF-aktiverede IKB gennem p53 stabilisering. Taget sammen antyder disse resultater, at p53 inhiberer proinflammatoriske chemokiner i ovariecancerceller ved at reducere proteasomalaktivitet nedbrydning af IKB. Således hyppige tab eller mutation af p53 kan fremme tumorprogression ved at øge betændelse i tumor mikromiljø

Henvisning:. Son DS, Kabir SM, Dong YL, Lee E, Adunyah SE (2012) hæmmende effekt af tumorsuppressor p53 på proinflammatoriske chemokinekspression i ovariecancerceller ved Reduktion proteasomalaktivitet Nedbrydning af IKB. PLoS ONE 7 (12): e51116. doi: 10,1371 /journal.pone.0051116

Redaktør: Ashok Kumar, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: Juni 28, 2012; Accepteret: 29 Okt 2012; Udgivet: December 31, 2012

Copyright: © 2012 Son et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health NIAID SC1AI089073 (DS), NIGMS SC1 089.630 (EL), NCI U54CA163069-02 og NIMHD U54MD007593-04 (SA) fra National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den femte hyppigste årsag til kræftdødsfald blandt kvinder, fordi det typisk er asymptomatisk og ofte diagnosticeret sent indtil tumorer har spredt langt ud over æggestokkene [1]. Selvom den præcise ætiologi er ukendt, stigende evidens for, at ovariecancer er associeret med kronisk inflammation [2] – [3]. Kræft i æggestokkene væv udtrykker høje niveauer af CXCL1; på samme måde, serum niveauer af CXCL1 er højere i æggestokkene kræftpatienter end kontroller [4] – [5]. Avanceret (mindre differentieret) ovariecancer overudtrykke også CXCL8 i cyster væsker [6] og tumorceller [7]. Ovariecarcinom ascitesvæske har også vist sig at indeholde høje niveauer af CXCL8 [8]. Desuden udtrykke paclitaxel-resistente æggestokkene cellelinier forøget CXCL8 sammenlignet med paclitaxel-sensitive celler [9]. Inflammatorisk reaktion inducerer hovedsageligt proinflammatoriske chemokiner såsom CXCL1, 2 og 8 via NF-KB signalering i ovarieepitelceller cancerceller [10]. Også proinflammatoriske tumormikromiljøet er kendt for at fremme udviklingen af ​​kræft. Derfor tilsammen disse faktorer sandsynligvis medvirke til de kliniske funktioner i kræft i æggestokkene, der forårsager høj dødelighed, såsom peritoneal tumor formidling og massive ascites

Mens den mekanisme, hvormed opregulering af proinflammatoriske kemokiner i kræft i æggestokkene er stadig ukendt.; en sandsynlige årsag er aktiveringen af ​​NF-KB følge af tab af tumor suppressor p53. Genetiske ændringer i p53 såsom mutation og sletning ofte observeret i høj kvalitet ondartet ovariecancer [11]. Akkumuleret data viser, at p53 undertrykker NF-KB signalering via nedregulering af IKB kinase (IKK) [12] – [14] eller konkurrence om transskriptionelle coaktivatorer p300 /CREB-bindende protein (CBP) [15] – [17]. Interessant nok har andre fundet, at p53 fremmer NF-KB-aktivering [18] – [19]. Trods kontroversielle virkninger af p53 på NF-KB-signalering mutationer eller deletioner af p53 kan forværre ovariecancer progression baseret på det faktum, at mus er deficiente for p53 er tilbøjelige til at udvikle kræft [20]. Vi har derfor hypotesen, at funktionelt tab af p53 i kræft i æggestokkene kan øge ekspressionen af ​​proinflammatoriske kemokiner ved de-begrænsning NF-KB-signalering.

I denne undersøgelse har vi restaureret p53 i æggestokkene kræftceller til at bestemme dets virkninger på proinflammatorisk chemokinekspression som respons på inflammatoriske stimuli. Endvidere undersøgte vi den mekanisme, hvormed dette kan ske ved at måle nedbrydningen af ​​IKB, proteasomaktivitet, og ekspression af Mdm2, en negativ regulator af p53 og en E3 ubiquitin ligase.

Materialer og metoder

Reagenser

Rekombinant human TNF og human p53 DuoSet® IC ELISA-kit blev opnået fra R 25 cyklus til 35 cykler. Resultaterne viste høj ekspression af chemokiner i følgende ovariecancer cellelinier: CCL20 og 28, CXCL1, 2, 3 og 8 i OVCAR-3 celler; CCL28 og CXCL1 i Skov-3-celler; CXCL1, 2 og 8 i CaOV-3 celler; og CXCL2 i TOV-21G-celler (figur 1A). Interessant A2780 celler var ikke udtrykke eller udtrykte lave niveauer af næsten alle kemokiner sammenlignet med andre æggestokkene cancerceller. Endvidere CCR1 og CXCR4 blev højt udtrykt i A2780 og CaOV-3-celler, henholdsvis (figur 1b). Selv p53 vildtype IGROV-1 celler udtrykte meget CXCL3, CXCL14, CCR10 og CXCR4 (figur S1A).

(a) undertegnelse af chemokinligander og (B) kemokinreceptorer i humane ovarie cancer cellelinjer. Efter isolering totalt RNA fra hver cellelinje, blev PCR-array udført under anvendelse af en tilpasset PCR-array plade indeholdende komplementære sekvenser for humane kemokin gener. Forskellige farver angiver gennemsnitlig tærskel cyklus med udtryk spænder fra 35 til 25. (C) Protein ekspression af p53 og Mdm2 i æggestokkene cancercellelinier. Helcellelysater blev fremstillet og Western blot blev udført ved anvendelse af antistoffer specifikke for p53, Mdm2 og β-actin som ladningskontrol. Eksperimenter blev udført in duplo, og en repræsentativ resultat er vist. OV, OVCAR-3 celler; SK, SKOV-3 celler; A, A2780 celler; Ca, CaOV-3-celler; TOV, TOV-21G celler.

Derudover har vi analyseret protein niveauer af p53 og Mdm2 i de samme cellelinjer. OVCAR-3 celler overudtrykt p53-protein, mens ID8 og A2780 celler udtrykte relativt lavere niveauer af p53. Det er klart, SKOV-3, CaOV-3, og TOV-21G-celler ikke udtrykker p53. Vi undersøgte også udtryk for Mdm2, en negativ regulator af p53. MDM2 blev højt udtrykt i A2780 og OVCAR-3 celler i modsætning til ingen ekspression i ID8 og CaOV-3-celler (figur 1C). SKOV-3 og TOV-21G celler udtrykte Mdm2 på trods af tabet af p53 (figur 1C). Disse resultater tyder på, at p53 er enten fraværende eller udtrykt på meget lave niveauer i de fleste cellelinjer undersøgt.

Effekt af p53 på TNF-induceret kemokiner

TNF er et proinflammatorisk cytokin rigeligt udtrykt i kræft i æggestokkene [24]. Vi valgte SKOV-3-celler som en p53-nul-model ovariecancercelle at identificere responsive chemokiner til TNF. TNF specifikt induceret proinflammatoriske chemokiner såsom CCL20, CXCL1, 2, 3 og 8 (figur 2A). Endvidere har vi forbigående transficeret p53 ind SKOV-3-celler til måling af indflydelsen af ​​p53 på TNF-induceret chemokiner (figur 2B). Restaurering af p53 i SKOV-3 celler førte til nedregulering af proinflammatoriske kemokiner på både basal og TNF-inducerede niveauer (Figur 2C). Disse resultater antyder, at funktionelt tab af p53 i ovariecancer kan øge ekspressionen af ​​proinflammatoriske chemokiner, hvilket resulterer i betændelse i tumormikromiljøet.

(A) TNF-induceret chemokiner i SKOV-3-celler. Efter isolering total RNA, blev PCR-array udført under anvendelse af et humant kemokin PCR-array plade. Stiplet linje angiver 2-fold stigning; kemokiner med en mere end 2 gange stigning indregnes som TNF-induceret chemokiner. (B) Bekræftelse af p53-proteinekspression efter transient transfektion i SKOV-3-celler. Efter transfektion af tom vektor (EM) og p53-ekspressionsvektoren (p53), blev hele cellelysater fremstillet og p53-ekspression blev bekræftet ved Western blot. β-actin anvendes som lastning kontrol. (C) Effekt af p53 på TNF-induceret kemokiner. Efter natten over transfektion af vektorer blev celler behandlet med TNF (10 ng /ml) i 1 time og QRT-PCR blev udført ved anvendelse af primere til CCL2, CXCL1, 2, 3 og 8. β-actin tjener som normalisering kontrol. Forskellige bogstaver angiver signifikante forskelle (p ≤ 0,05) inden for hver chemokin gruppe (ANOVA og Tukey s parvise sammenligninger). Eksperimenter blev udført tre gange, og alle data er vist som gennemsnit ± SE.

Virkning af p53 på NF-KB promotoraktivitet og TNF-aktiverede IKB

TNF-inducerede chemokiner såsom CCL20, CXCL1, 2, 3 og 8 indeholder proksimale KB sites på deres initiativtagere (figur 3A). Vi anvendte derfor en NF-KB-driven luciferase reporter vektor for at bekræfte inddragelse af NF-KB i den inhibitoriske virkning af p53 på TNF og p65 (en underenhed af NF-KB) induktion af chemokinekspression. Vi valgte tre cellelinier, der varierer med hensyn til p53-ekspression: SKOV-3 (p53 null), A2780 (p53 vildtype) og OVCAR-3 (p53 mutant) celler [25] – [26]. Uanset status for p53, p53 restaurering signifikant reduceret TNF- og p65-induceret NF-KB-promotoraktivitet (figur 3B). Disse resultater antyder, at tab af p53 i ovariecancer kan øge proinflammatoriske chemokiner ved at øge NF-KB-promotoren aktivitet som respons på inflammatorisk reaktion.

(A) Nukleotidsekvenser af promotorer til TNF-induceret chemokiner såsom CCL20, CXCL1 , 2, 3 og 8. Disse chemokin promotorer indeholde en NF-KB-sted ved proximale område, bortset CCL20, som har to NF-KB-sites i distale og proksimale område. (B) Virkning af p53 på NF-KB luciferaseaktivitet. Efter transfektion af vektorer eller cotransfektion med p65, blev celler behandlet med TNF (10 ng /ml) i 4 timer. (C) Effekt af p53 på TNF-aktiverede IKB. Efter transfektion af tom vektor eller p53 i SKOV-3 (p53 null), OVCAR-3 (p53 mutant) og A2780 (p53 vildtype), celler behandlet med TNF (10 ng /ml) i angivne tidspunkter. β-actin tjener som ladningskontrol. Eksperimenter blev udført in duplo, og en repræsentativ resultat er vist; tal nedenfor er relative densitetsværdier.

Vi nærmere, om p53 påvirker TNF-induceret aktivering af IKB i disse forbigående transfekterede celler. Selvom p53 restaurering havde nogen mærkbar virkning på TNF-aktiveret IKB på 5 til 30 minutter, det reducerede aktivering af IKB ved 1 til 2 timer. På trods af varierende ekspression af p53, dette reduceret effekt på sene tidspunkter var ens i alle testede cellelinier (figur 3C). Reduceret aktivering af IKB på sene tidspunkter tyder på, at p53 kan forventes at påvirke begivenheder relateret med NF-KB-kompleks (IKB-p65 /p52) snarere end en opstrøms af NF-KB i æggestokkene cancerceller.

Inddragelse af p53 i IKB nedbrydning

En mekanisme, hvormed IKB reguleres, er ved proteasomalaktivitet nedbrydning efter ubiquitinering. Vi undersøgte, om denne mekanisme var involveret i p53 evne til at reducere IKB aktivering. Efter transient transfektion af p53, bekræftede vi funktionen af ​​p53 ved at undersøge, om den forøgede ekspression af p21, en potent cyclin-afhængig kinase inhibitor stramt kontrolleret af p53. A2780 celler konstitutivt udtrykte p21 hvorimod OVCAR-3 og SKOV-3 celler ikke udtrykte p21. Overekspression af p53 forøget p21-protein niveau i alle cellelinjer (figur 4A). Desuden p53 signifikant forøget akkumulering af ubiquitinerede proteiner i de hele cellelysater (figur 4A), sandsynligvis ved at forstyrre nedbrydningen systemet. ELISA-assay viste, at restaurering af p53 forøget p53-aktivitet i alle cellelinjer (figur 4B). De p53 vildtype A2780 celler udtrykte basal p53 aktivitet henviser p53 mutant OVCAR-3 og p53 null SKOV-3-celler viste ingen p53-aktivitet (figur 4B). For at bestemme årsagen til denne akkumulering målte vi proteasomaktivitet og fundet det blev reduceret ved overekspression af p53 i alle testede cellelinier (figur 4C). Desuden, efter immunfældning af IKB, bekræftede vi, at p53 øget ubiquitinering af IKB (figur 4D). Akkumulerende ubiquitineret IKB med p53 tyder på, at p53 blokerer nedbrydning af IKB ved at reducere proteasom aktivitet i æggestokkene cancerceller.

(A) Akkumuleret virkning af p53 på ubiquitylated proteiner. Efter transient transfektion af p53 i A2780, OVCAR-3 og SKOV-3-celler, helcellelysater blev fremstillet og Western blot blev udført ved anvendelse af antistoffer specifikke for ubiquitin, p21, IKB, p53 og β-actin (som ladningskontrol). Eksperimenter blev udført in duplo, og en repræsentativ resultat er vist. (B) Bekræftelse af p53-aktivitet efter transient transfektion af p53. ELISA blev udført tre gange og data er vist som gennemsnit ± SE. Mørke grå søjler indikerer signifikans (p 0,05, parret Students

t

-test) inden for hver cellelinje. (C) Virkningen af ​​p53 på proteasomaktivitet. Assays blev udført in triplo og data er vist som gennemsnit ± SE. Mørke grå søjler indikerer signifikans (p 0,05, parret Students

t

-test) inden for hver cellelinje. (D) Virkning af p53 på ubiquitinering af IKB. Immunpræcipiteret IKB blev immunblottet under anvendelse af ubiquitin antistof. Eksperimenter blev udført in duplo, og en repræsentativ resultat er vist.

Virkning af p53 på ubiquitin-gener

Virkningen af ​​p53 på ubiquitin-gener er vist i tabel 1. selvom faldt proteasomaktivitet ville forklare stigningen i ubiquitinerede proteiner, forøget ekspression af ubiquitin-gener kan også bidrage. Derfor anvendelse af en PCR-array undersøgte vi, om p53 direkte påvirker ubiquitin-relaterede gener, såsom ubiquitin-aktiverende enzymer (E1), ubiquitin-konjugerende enzymer (E2) og ubiquitin-protein-ligaser (E3). En PCR-array til ubiquitinering gener viste, at overekspression af p53 havde ingen direkte virkninger på E1 eller E2 undtagen en ca. 2 gange formindskelse af UBE2E2 i SKOV-3-celler. Selv i A2780 og OVCAR-3 celler, p53-overekspression forårsagede en 2-3 gange forøgelse i ubiquitin ligase CUL9 og RNF148 ekspression, viste PCR-array at disse gener blev udtrykt på et lavt niveau. Interessant p53 specifikt forøget ekspression af Mdm2, en negativ regulator af p53 tumor suppressor og en E3 ubiquitin ligase, i alle testede cellelinier. Herunder den stigende virkning af p53 på Mdm2 var 1,53 gange i A2780 celler, 5,41 gange i OVCAR-3 og 3,13 gange i SKOV-3-celler. MDM2 som en p53-inducerbart gen i ubiquitin-relaterede gener vil sandsynligvis blive involveret i at undertrykke p53 aktivitet, som dæmper NF-KB-signalering gennem en autoregulatorisk negativ feedback loop.

Effekt af p53 på MDM2 udtryk, binding med NF-KB komponenter og IKK isoformer

Baseret på p53-induceret Mdm2 mRNA indikeret ved PCR array (tabel 1), vi næste bekræftede den forøgede ekspression af Mdm2 protein ved p53 i A2780, OVCAR-3 og SKOV -3-celler ved Western blot (figur 5A). Fordi kBa vides at binde til p53

in vitro

[27] og undertrykke p53-afhængige virkninger [28], overekspression af p53 kunne falde NF-KB-signalering ved at binde til p65 og IKB. Immunopræcipitation af p53 afslørede, at restaurering af p53 havde ingen signifikant virkning på p53-binding til enten p65 eller IKB (Figur 5B). Fordi tab af p53 er kendt for at øge aktiviteten af ​​IKKα eller IKKβ [12] – [13], vi afklaret, om p53 var involveret i reguleringen af ​​ekspressionen af ​​IKK. Selvom hver cellelinie udtrykte en særskilt kombination af IKK-isoformer (IKKβ blev udtrykt i alle testede cellelinier, SKOV3 celler udtrykte IKKγ stedet for IKKα, og IKKε blev ikke udtrykt i nogen cellelinie), overekspression af p53 havde ingen virkning på IKK-ekspression og phosphorylering i enhver cellelinie (figur 5C). Disse resultater antyder, at måske dominerende virkning af p53 i løbet Mdm2 er mere vigtigt for dæmpning af NF-KB signalering snarere end direkte virkninger på opstrøms eller komponenter i NF-KB.

(A) Effekt af p53 på Mdm2 ekspression. Efter transient transfektion af p53 i A2780, OVCAR-3 og SKOV-3 celler, helcellelysater blev fremstillet og Western blot blev udført ved anvendelse af antistoffer specifikke for Mdm2; og β-actin tjente som ladningskontrol. (B) Virkninger af p53-ekspression på p53-binding til p65 og IKB. Efter transient transfektion af p53, blev immunpræcipiteret (IP) p53 immunblottet (IB) under anvendelse af p65 eller IKB antistof. (C) Effekt af p53 på ekspression af forskellige IKK isoformer. Efter transient transfektion af p53, blev hele cellelysater fremstillet og Western blot blev udført ved anvendelse af antistoffer specifikke for IKKα, IKKβ, IKKγ, IKKε; β-actin tjente som ladningskontrol. Eksperimenter blev udført i to eksemplarer og et repræsentativt resultat er vist.

Effekt af nutlin-3, en specifik inducer af p53 stabilisering på TNF-induceret kemokiner

Vi ansat nutlin-3 som en p53 stabilisator for at bekræfte den inhiberende virkning af p53 på TNF-induceret chemokinekspression. Nutlin-3 havde ingen virkning på TNF-induceret NF-KB promotoraktivitet i p53 null SKOV-3-celler, men reduceret sin aktivitet i p53-overudtrykt SKOV-3-celler (figur 6A). Løbende vi undersøgt, om nutlin-3 påvirker TNF-aktiverede IKB i p53-overudtrykt SKOV-3-celler. Nutlin-3 reducerede TNF-aktiveret IKB ved at stabilisere p53 som indikeret med forøgelse af MDM2 (figur 6B). Stabilisering af p53 ved nutlin-3 i p53-overudtrykt SKOV-3 celler førte til nedregulering af TNF-induceret proinflammatoriske chemokiner (Figur 6C). Disse resultater bekræfter, at funktionelt tab af p53-aktivitet i ovariecancer kan øge ekspressionen af ​​proinflammatoriske chemokiner, stigende betændelse byrde i tumormikromiljøet. Derudover anvendte vi p53 vildtype IGROV-1-celler for at bekræfte i den inhibitoriske virkning af nutlin-3 på TNF-aktiverede IKB. Nutlin-3 faldt TNF-aktiveret IKB ved at stabilisere p53 som indikeret med forøgelse af p21 og MDM2 trods lav basal ekspression af p53 (figur S1B). Selvom IGROV-1 celler udtrykte meget IKKα og IKKβ (IKKγ var ydmyge udtrykt og IKKε blev ikke udtrykkes), nutlin-3 havde ingen virkning på IKK fosforylering (Figur S1c). Endvidere undersøgte vi differentiel effekt af nutine-3 på TNF-aktiverede IKB mellem p53 vildtype-A2789 og p53 mutant OVCAR-3 celler. Nutlin-3 reducerede TNF-aktiverede IKB i p53 vildtype A2780 celler ved at stabilisere p53 efterfulgt af p21 og MDM2 augmentation (fig S2A). På den anden side, nutlin-3 havde ingen virkning i p53 mutant OVCAR-3-celler som angivet uden ændring af p53 og MDM2 (fig S2B). Andre forfattere viste også, at nutlin-3 stabiliseret p53 med forøgelse af p21 og MDM2 i andre p53 vild type celler, men ikke i p53 mutantceller [29] – [30]. Nutlin-3 påvirkede ikke TNF-aktiverede IKK i begge celler (Figur S2). Disse resultater bekræfter, at funktionel gevinst af p53 er mere vigtigt for dæmpning af NF-KB signalering snarere end direkte virkninger på opstrøms af NF-KB.

(A) Effekt af nutlin-3 på NF-KB luciferaseaktivitet. Efter transfektion af vektorer eller cotransfektion med p53 blev celler forbehandlet med nutlin-3 (10 pM) i 24 timer efterfulgt af TNF (10 ng /ml) i 4 timer. Forskellige bogstaver angiver signifikante forskelle (p ≤ 0,05) inden for hver gruppe (ANOVA og Tukey s parvise sammenligninger). Eksperimenter blev udført tre gange, og alle data er vist som gennemsnit ± SE. (B) Effekt af nutlin-3 på TNF-aktiverede IKB. Efter transfektion af tom vektor eller p53 i SKOV-3-celler blev celler forbehandlet med nutlin-3 (10 pM) i 24 timer efterfulgt af TNF (10 ng /ml) i angivne tidsrum. β-actin tjener som ladningskontrol. Eksperimenter blev udført in duplo, og en repræsentativ resultat er vist. (C) Effekt af nutlin-3 på TNF-induceret kemokiner. Efter natten over transfektion af vektorer blev celler forbehandlet med nutlin-3 (10 pM) i 24 timer efterfulgt af TNF (10 ng /ml) i 1 time og QRT-PCR blev udført ved anvendelse af primere til CCL2, CXCL1, 2, 3 og 8. β-actin tjener som normalisering kontrol. Asterisk angiver signifikante forskelle (p ≤ 0,05, parret Students

t

-test) sammenlignet med tilstedeværelsen af ​​nutlin-3. Eksperimenter blev udført tre gange, og alle data er vist som gennemsnit ± SE.

Discussion

Denne undersøgelse viser, at p53 inhiberer proinflammatoriske chemokiner i ovariecancerceller. Denne effekt af p53 er sandsynligvis skyldes svækket NF-KB-signalering ved nedsat proteasomalaktivitet nedbrydning af IKB og dominerende effekter af p53 i Mdm2.

Denne undersøgelse blev motiveret af det faktum, at aggressive og high-grade kræft i æggestokkene, en inflammation-associeret cancer, involverer ofte mutationer eller deletioner af p53 [11]. Vores første Correlational eksperiment afslørede, at p53-nul eller muteret ovariecancerceller stærkt udtrykt proinflammatoriske kemokiner såsom CCL20, CCL28, CXCL1, 2, 3 og 8, som er enig med vores tidligere observationer [10]. Desuden blev CCR1, CCR10 og CXCR4 højt udtrykt i A2780 celler, CaOV-3-celler (figur 1B) og IGROV-1-celler (figur S1a). Fordi CCR1, CCR10 og CXCR4 ikke er specifikke receptorer for de proinflammatoriske chemokiner frigivet af ovariecancerceller, disse receptorer kan forventes at interagere med chemokiner frigivet af andre celletyper, såsom immunceller og endotelceller til mikromiljø.

TNF-induceret ekspression af CCL20, CXCL1, 2, 3 og 8, men ikke CCL28 som var stærkt udtrykt i SKOV-3 og OVCAR-3 celler (figur 1A og 2A). Den manglende induktion af CCL28 af TNF i disse ovariecancerceller er i modsætning til tidligere rapport [31] – [32], at TNF og IL-1 stigning ekspression af CCL28 i humane keratinocytceller og colon epitel. Faktisk CCL28 niveau forblev uforanderlig i alle humane ovariecancer celler testet (data ikke vist). Denne forskel indikerer, at chemokin netværk sandsynligvis vil blive forskelligt reguleret i forskellige celletyper.

Genoprettelse af p53 i p53-nul-SKOV-3-celler svækkede ekspression af proinflammatoriske chemokiner i både basal og TNF-inducerede betingelser (figur 2C ). Dette resultat viser, at tabet eller mutation af p53 observeret hyppigt i ovariecancer bidrager til augmented proinflammatoriske chemokiner i tumormikromiljøet, som er kendt for at lette udviklingen af ​​kræft.

Fordi promotorerne for CCL20, CXCL1, 2, 3 og 8 indeholder KB steder (fig. 3A) og proinflammatoriske kemokiner er reguleret af NF-KB-signalering [10], p53 virkninger på chemokinekspression sandsynligvis involverer ændringer i NF-KB-signalering. I denne undersøgelse restaurering af p53 i ovariecancerceller og nutlin-3, et p53 stabilisator, ophæver TNF-induceret NF-KB-promotoraktivitet (figur 3B og 6A). Disse resultater bekræfter og kontrast med tidligere resultater, som modstridende virkninger af p53 på NF-KB-signalering er blevet fundet. Nogle tyder, at p53 aktiverer p65-underenheden af ​​NF-KB via ribosomal S6 kinase 1 [18] og TNF udløser en transskriptionelt aktivt kompleks af p65 og p53 på KB responselementer, hvilket indikerer, at muterede p53 snarere end tab af p53 bidrager til tumor progression [19]. På den anden side, akkumulere beviser indikerer en negativ effekt af p53 på NF-KB-signalering, efter aftale med vores resultater. P53 kan undertrykke NF-KB-signalering ved at afbryde IKK ekspression som en opstrøms af NF-KB-signalering.