PLoS ONE: Activin signalering i mikrosatellit Stabil tyktarmskræft afbrydes af en kombination af genetiske og Epigenetisk Mekanismer

Abstrakt

Baggrund

Activin receptor 2 (

ACVR2

) er almindeligt muteret i mikrosatellit ustabile (MSI) tyktarmskræft, hvilket fører til protein tab, signalering forstyrrelser, og større tumorer. Her undersøgte vi activin signalering forstyrrelser i mikrosatellit stabil (MSS) tyktarmskræft.

Metoder

Fifty-én populationsbaserede MSS tyktarmskræft blev vurderet for ACVR1, ACVR2 og pSMAD2 protein. Konsensus mutation-tilbøjelige dele af

ACVR2

blev sekventeret i primære kræft og alle exons i tyktarmskræft cellelinjer. Tab af heterozygositet (LOH) blev evalueret for

ACVR2

ACVR1

, og

ACVR2

promotor methylering ved methylering-specifikke PCR og bisulfit sekventering og kromosomal ustabilitet (CIN) fænotype via fluorescerende LOH analyse af 3 dobbelte markører.

ACVR2

promotor methylering og ACVR2 udtryk blev vurderet i colon cancer cellelinjer via qPCR og IP-Western blotting. Re-ekspressionen af ​​ACVR2 efter demethylering med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-Aza) blev bestemt. Yderligere 26 MSS tyktarmskræft blev vurderet for ACVR2 tab og dens mekanisme, og ACVR2 tab i alle testede kræftformer korreleret med klinisk-patologiske kriterier.

Resultater

Af 51 MSS kolon tumorer, 7 (14% ) mistede ACVR2, 2 (4%) ACVR1, og 5 (10%) pSMAD2 udtryk. Ingen somatiske

blev opdaget ACVR2

mutationer. Tab af ACVR2 udtryk var forbundet med LOH på

ACVR2

(p 0,001) og

ACVR2

promotor hypermethylering (p 0,05).

ACVR2

LOH, men ikke promotor hypermethylering, korreleret med CIN status. I kolon kræft cellelinjer med fuldt methylerede

ACVR2

promotor, tab af

ACVR2

mRNA og protein-ekspression blev restaureret med 5-Aza behandling. Tab af ACVR2 blev forbundet med en stigning i den primære volumen tyktarmskræft (p 0,05).

Konklusioner

Kun en lille procentdel af MSS tyktarmskræft mister udtryk for activin signalering medlemmer. ACVR2 tabet opstår gennem LOH og

ACVR2

promotor hypermethylering, afslører tydelige mekanismer til ACVR2 inaktivering i både MSI og MSS undertyper af tyktarmskræft

Henvisning:. Jung B, Gomez J, Chau E, Cabral J, Lee JK, Anselm A, et al. (2009) Activin signalering i mikrosatellit Stabil tyktarmskræft afbrydes af en kombination af genetiske og Epigenetisk mekanismer. PLoS ONE 4 (12): e8308. doi: 10,1371 /journal.pone.0008308

Redaktør: Irene Oi-Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 18 juni 2009; Accepteret: 20. november 2009; Udgivet: December 14, 2009

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. Støttet af UCSD Academic senat til BJ, US Public Health service DK074019 til BJ; DK067287, VA Research Service, og American Cancer Society Institutional Research Grant # 70-002 til J.M.C., og UCSD Digestive Diseases Research Development Center (DK080506). DNA-sekventering blev udført af DNA-sekventering Shared Resource, UCSD Cancer Center, som finansieres delvist af NCI Cancer Center Support Grant # 2 P30 CA023100-23. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tyktarmskræft med høj frekvens mikrosatellit instabilitet (MSI-H) er forbundet med mutationer i flere gener med kodning repetitive sekvenser, såsom

transformerende vækstfaktor β receptor 2 (TGFBR2)

og

activin type 2 receptor (ACVR2)

[1] – [3]. Mikrosatelitter stabil (MSS) tyktarmskræft har intakt DNA mismatch repair, men kan harbor

TGFBR2

kinasedomæmemutationer [4]. Andre dele af TGF kanoniske signalering kaskade, såsom SMAD2 og Smad4 specifikt har inaktiveret i et mindretal af tyktarmskræft [5] – [7]. Systematisk inaktivering af TGFp søster vej, activin, er ikke fuldt ud belyst i MSS tyktarmskræft.

Activin er medlem af TGF superfamilien, der regulerer celledifferentiering i mange væv [8]. Svarende til TGFp, activin anvender to celleoverfladereceptorer, activinreceptoren 1 (ACVR1) og activin receptor 2 (ACVR2) efterfulgt af SMAD aktivering. En anden type 2-receptoren, ACVR2B, kan ikke erstatte de funktioner og signalering af ACVR2 [9].

ACVR2

blev fundet muteret i størstedelen af ​​MSI-H tarmkræft [10], [ ,,,0],11], primært som følge af en læserammeforskydning i a

8 tarmkanalen af ​​exon 10. Restaurering af activin signalering og vækst undertrykkelse forekommer som reaktion på

ACVR2

komplementering i

ACVR2

-mutant kolon cancerceller [12], [13]. Vi har tidligere demonstreret en høj frekvens af

ACVR2

mutationer i MSI-H tyktarmskræft i forbindelse med tab af ACVR2 proteinekspression [2] og association med større kolon tumorer og fattigere histologiske kvalitet [14]. Vi fandt også, en delmængde af MSS tyktarmskræft, der mistede ACVR2 udtryk [2], beslægtet med

TGFBR2

tab findes i MSS tyktarmskræft [4].

I denne undersøgelse vi udforskede activin signalvejen forstyrrelser og mulige mekanismer i ubearbejdet MSS tyktarmskræft prøver og tyktarmskræft celler. Vi fandt, at tabet af ACVR2 ekspression forekommer i en undergruppe af MSS tumorer, som ofte er forbundet med bevaret pSMAD2, den næste nedstrøms effektor af både TGFp og activin signalering. I modsætning til det af TGFBR2, ACVR2 tab i MSS tumorer sker gennem en kombination af LOH på

ACVR2

og tydelig

ACVR2

promotor methylering, men ikke genetisk mutation. I Tyktarmskræft cellelinjer, mekanismer for ACVR2 tab også adskille efter mikrosatellit status, med MSI-H cellelinjer viser

ACVR2

polyadenine tarmkanalen mutation og MSS tyktarmskræft celler viser promotor hypermethylering. viser således vi, at afbrydelse af activin signalering forekommer i MSI og MSS tyktarmskræft ved distinkte mekanismer, afslører activin signalering som et vigtigt mål i de to mest almindelige genomiske undertyper af tyktarmskræft.

Resultater

Activin signalvej medlemmer er målrettet til inaktivering i delmængder af Primary MSS tyktarmskræft

Vores tidligere data foreslået mindst delvist tab af ACVR2 proteinekspression i en delmængde af primære MSS tyktarmskræft prøver trods vildtype

ACVR2

polyadenine skrifter [2]. Vi undersøgte dette yderligere og søgte at bestemme ekspressionsmønstre både ACVR2, ACVR1 samt dens downstream effektor, pSMAD2, i 51 forskellige primære tyktarmskræft prøver med mikrosatellitmarkørerne stabile genomiske baggrunde fremkommet ved den samme kohorte af North Carolina Colon Cancer Study (NCCCS ) [15], [16]. Mens ACVR1 receptorekspression blev tabt i kun 4% (2/51) af patienten tumorprøver (fig 1ab, øverste række), tab af den primære receptor, ACVR2, forekom hos 14% (7/51) (Figur 1CD, middle række). Derudover tab af pSMAD2 udtryk nedstrøms ACVR2 og ACVR1 aktivering ved activin forekom i 10% (5/51) af de testede tilfælde (figur 1EF, nederste række), og blev almindeligt observeret i tumorer afslører fuldt udtrykte receptorer (tabel 1).

Immunohistokemisk analyse af paraffinindlejrede primære coloncancerformer vurderede ekspression af målproteinet (brun) i sammenligning med tilstødende normalt væv. A og B (Øverste række): ACVR1 ekspression er tabt i en delmængde af MSS tumorer. Eksempel på tumoren med ekspression i både normale og colontumorvæv (venstre felt) og selektivt tab i en undergruppe af tumorer, men ikke tilstødende normale colon-væv (højre panel). Samlet set blev ACVR1 tab observeret i 2/51 eller 4% af alle MSS tyktarmskræft analyseret. C og D (Midterste række): ACVR2 ekspression er tabt i en delmængde af MSS tumorer. To eksempler på selektivt tab af ACVR2 i colon tumor, men ikke normal colonvæv (venstre og højre panel) er vist. Samlet set blev ACVR2 tab observeret i 7/51 eller 14% af alle MSS tyktarmskræft analyseret. E og F (Nederste række): pSMAD2 ekspression er tabt i en delmængde af MSS tumorer. Eksempel på ekspression i både normale og colontumorvæv (venstre felt) og selektivt tab i en undergruppe af tumorer, men ikke normal colonvæv (højre panel). Samlet set blev pSMAD2 tab observeret i 5/51 eller 10% af alle kolon kræft analyserede.

Alle prøver med tab af mindst én activin receptor pathway komponent afslørede udtryk for både total SMAD2 og TGFBR2 (tabel 1, figur 2). Disse data antyder, at ACVR2 proteintab har den største forekomst blandt MSS tumorer efterfulgt af pSMAD2 tab, og derefter ved ACVR1 tab. ACVR2 tab og pSMAD2 tab synes at forekomme i komplementære undergrupper, hvilket tyder på mere end et mål til inaktivering activin signalering i MSS tyktarmskræft. Omvendt alle MSS tyktarmskræft prøver med tab activin signalering komponent udtrykt TGFBR2.

Af de 51 MSS tyktarmskræft fra testet for ACVR2 og ACVR1 tab NCCCS kohorte, 8 afsløret tab af enten receptor (7 tabt ACVR2 og 2 tabt ACVR1 med én tumor miste både, se tabel 1). Af disse 8, 1 tabt pSMAD2. Af de 7 tumorer med ACVR2 tab, 3 afslørede LOH og 3 havde selektiv ACVR2 promotor hypermethylering, mens ingen mutationer blev fundet i nogen af ​​de tre kinase domæne hotspots eller den kodende polyadenine tarmkanalen i exon 10, almindeligvis muteret i MSI colontumorer. Ingen af ​​de 2 tumorer med ACVR1 tab afslørede LOH på

ACVR1

locus. Omvendt af de 43 tumorer, der udtrykker både ACVR2 og ACVR1, 4 eller 9% mistede pSMAD2 udtryk, samtidig med at den samlede SMAD2 og TGFBR2 udtryk, hvilket understreger tab af SMAD2 fosforylering kapacitet som en ekstra primær hændelse at forstyrre activin signalering.

LOH, men ikke Mutation, er forbundet med tab af ACVR2 Expression i Primary MSS Colon Cancer Prøver

for at vurdere, om tab af receptor udtryk skyldtes tab af heterozygositet (LOH), en fælles genomisk mekanisme tumor suppressor inaktivering i MSS tyktarmskræft, vi analyseret for LOH på

ACVR2

ACVR1

gen loci. Af de 51 MSS tumorerne analyseret, 4 afslørede allele tab. LOH ved

ACVR2

var stærkt forbundet med tab af ACVR2 proteinekspression (p = 0,006, Fishers eksakte test), og 3/7 (43%) af MSS tumorer med tab af ACVR2 proteinekspression viste også LOH (figur 2), sammenlignet med 1/44 ACVR2 udtrykkende tumorer. Ingen LOH blev fundet på

ACVR1

locus i enten ACVR1 udtrykker eller ikke-udtrykkende tumorer. For yderligere ACVR2 udtryk korrelation med LOH, vi udvidet antallet af patientens tumorer fra 51 til 77 prøver, som viste 5 yderligere tumorer med ACVR2 protein tab, hvilket bringer det samlede antal til 12/77 eller 16% (tabel 2). I denne udvidede gruppe, 6/12 (50%) af MSS tumorer med ACVR2 tab viste LOH (tabel 2).

Vi sekventeret derefter kodning mikrosatellit samt 3 separate hot spots i kinase domæne af

ACVR2

(beslægtet med tilsvarende mutationer i

TGFBR2

i MSS tumorer) [4]. Det skal bemærkes, at exon 10 A

8 tarmkanalen i

ACVR2

ligger i kinasedomænet af denne receptor, og læserammeforskydningsmutationer samt andre mutationer i kinasedomænet afskaffe phosphorylerende kapacitet ACVR2. Vi fandt imidlertid ingen tumorspecifikke mutationer svarende med tab af ACVR2 proteinekspression. Disse data tyder på, at andre inaktiverende mekanismer spiller en rolle i tab af ACVR2 udtryk.

ACVR2

Promoter Hypermethylering er forbundet med tab af ACVR2 Expression i Primary MSS Colon Cancer Prøver

for at undersøge om epigenetiske ændringer er forbundet med ACVR2 udtryk tab, vi vurderet, om det

ACVR2

promotor blev hypermethyleret i tyktarmskræft væv i forhold til normalt, og i så fald, om en bestemt methylering mønster af

ACVR2

korreleret med ACVR2 protein tab i primære MSS tyktarmskræft prøver. Vi oprindeligt delte den

ACVR2

promotor i tre regioner, region 1 (142 til -603), region 2 (-607 til -958) og region 3 (-958 til -1484). Vores bisulfit sekventering Resultaterne viste, at der ikke var nogen methylering i område 1 og minimal methylering i region 2, men de 46 CpG-dinukleotider mellem til -958 til -1484 nukleotider i forhold til transkriptionsstartsitet (region 3) (figur 3A) blev methyleret i begge cellelinier og kliniske prøver (figur 3B), men som ikke svarer tilstødende normale væv (data ikke vist). På grund af vanskeligheden ved amplifikation af større amplikoner fra paraffinindlejret væv DNA, udførte vi methylering specifik bisulfit sekventering af en lidt mindre region (-603 til -1297 stilling)

ACVR2

promotor i kliniske prøver.

a) ACVR2 promotor med kort over placering af MSP primere B) ved hjælp af en CpG øer søgeprogram, vi identificeret de CpG øer i

ACVR2

promoter baseret på følgende strenge kriterier: ~CG procentpoint 55%; observerede CpG /forventet CpG 0,65; længde 500 bp. Alle CpG dinucleotidsekvenser er repræsenteret af lodrette streger på den vandrette linie skildrer promotorsekvensen. Hver cirkel i nederste panel viser en individuel CpG sted svarende til de vertikale stænger afbildet i det øverste panel. Baseret på bisulfit sekventering blev hver CpG websted scoret kvantitativt som 100% denatureret (mørke cirkler), 50% methylerede (mørkegrå cirkler), 50% methylerede (lysegrå cirkler) eller umethylerede (hvide cirkler). Som angivet, 3 af 7 ACVR2-negative CRCs demonstrerede fuldstændig methylering af det kritiske ACVR2 promotor, mens ingen af ​​de ACVR2-udtrykkende tumorer viste nogen tegn på høj grad /komplet methylering af ACVR2 promotoren. En methyleringsmønster svarende til den, set i ACVR2 negativ coloncancerformer blev observeret i MSS coloncancercellelinie HT29 med genomisk DNA fra HT-29 giver mulighed for sekventering af et lidt større område af

ACVR2

promotor. C) Seks coloncancer cellelinier med forskellig mikrosatellit ustabilitet baggrund (se tabel 3) blev analyseret for ACVR2 proteinekspression under anvendelse immunpræcipitation teknikker. To cellelinjer, HCT116 (en MSI coloncancercellelinie med biallele læserammeforskydningsmutationer i

ACVR2 Salg) og MSS coloncancercellelinie HT29 (med

ACVR2

promotor hypermethylering), afslørede tab af ACVR2 proteinekspression. D) Tab af ACVR2 proteinekspression korreleret med fald i ACVR2 mRNA-transkription via kvantitativ PCR i HT29-celler sammenlignet med ACVR2 udtrykkende cellelinie FET hjælp GAPDH for standardisering. Dette eksperiment blev udført tre gange i tre eksemplarer, og linjen grafen repræsenterer et eksperiment med * angiver en statistisk signifikant forskel med en P 0,001. E) ACVR2 proteinekspression blev genetableret efter demethylering behandling med 5’Aza.

I ACVR2 ikke-udtrykkende primære tyktarmskræft fra den oprindelige stikprøve af 51 MSS tumorer, demonstreret 3/7 kræftformer komplet methylering (100% methylerede alleler) indenfor område 3 i

ACVR2

promotor, mens ingen af ​​de 13 ACVR2 udtrykker primære tyktarmskræft væv analyseret viste fuldstændig

ACVR2

methylering, understøtter en forårsagende rolle for methylering og mangel på ACVR2 ekspression (p = 0,03, Fishers eksakte test) (tabel 2, figur 3B). Bisulfit sekventeringsresultaterne stemte overens med MSP observationer (data ikke vist), hvor 3/7 ACVR2-negative CRCs viste tilstedeværelsen af ​​specifikt methylerede alleler. Selv lave niveauer af methylering ( 50% methylerede alleler) blev også fundet i 7/13 af ACVR2-udtrykkende CRCs, ingen af ​​CRCs demonstrerede fuldstændig methylering af nogen som helst CpG-dinukleotider, og som svarer til muliggøre ACVR2 ekspression i disse tumorer ( Figur 3B).

ACVR2

Promoter hypermethylering korrelerer med ACVR2 Transskription og Protein Expression i Colon Cancer Cell Lines

For at underbygge vores resultater fra kliniske prøver

in vitro

, vurderede vi mekanismer

ACVR2

tab i tyktarmscancerceller linjer baseret på mikrosatellit ustabilitet. Vi testede tre MSI-H og 3 MSS tyktarmskræft cellelinjer til: 1) mutation i kodningen polyadenine tarmkanalen af ​​exon 10 af

ACVR2

, 2)

ACVR2

promotor hypermethylering, 3) kvantitativ RT-PCR af

ACVR2

mRNA, og 4) ACVR2 proteinekspression ved immunfældning. Som tidligere rapporteret [2], [12], biallele mutation i polyadenine tarmkanalen af ​​

ACVR2 Hotel (A

8 til A

7) i MSI-H tyktarmskræft HCT116 medfører tab af ACVR2 protein (figur 3C og tabel 3).

i MSI-H cellelinier SW48 og RKO, ACVR2 protein er til stede, da det er i MSS colon cancercellelinier CaCo2 og FET ( figur 3C). Både RKO og SW48 indeholde en heterozygot mutation på

ACVR2

, afslørende vildtype A

8 samt mutant alleler (tabel 3). A

8

ACVR2

allel giver udtryk for ACVR2 protein. Den MSS coloncancercellelinie HT29 udtrykker nedsat niveau af ACVR2 mRNA og protein (figur 3C, D og E), i modsætning til sin MSS kolleger Caco2 og FET, hverken som huser eventuelle exoniske

ACVR2

mutation (data ikke vist ). HT29-celler viste en distinkt

ACVR2

promotor hypermethylering mønster (figur 3B) i forbindelse med mRNA og protein tab, hvilket antyder, at denne specifikke methyleringsmønster forårsager tab af

ACVR2

ekspression. Demethylering af

ACVR2

promotor med 5-aza førte til genetableret ekspression af ACVR2 mRNA og protein (figur 3D og E). Vi udførte en ekstra skærm på 11 tyktarmskræft cellelinjer med enten MSI (DLD1, HCA7, HCT15, LoVo, LS174, SNU175, SNU407) eller MSS (SNU81, SNU503, SW480, og T84) baggrunde afslører tilsvarende niveauer af ACVR2 mRNA og oprettelse HT29 som den eneste observerede MSS tyktarmskræft model med tydelig ACVR2 tab.

for at korrelere ACVR2 udtryk med tumorstørrelse, grad og scene, vi analyserede den udvidede gruppe af 77 tumorer, som indeholdt 12 tumorer med ACVR2 tab ( tabel 2). Af dem, 69 havde data om køn og race, 46 om tumor volumen, 59 om tumor scenen, og 65 om bedømmelse (se tabel 4) tillader delanalyser. Akin til MSI-H coloncancerformer [14], tab af ACVR2 ekspression korrelerede med større tumorer (p = 0,024), mens trin var upåvirket sammenlignet med ACVR2-udtrykkende tumorer (tabel 4). Dette paralleller vores tidligere fund i MSI-H tyktarmskræft, hvor tab af ACVR2 protein blev forbundet med større, mere dårligt differentierede tumorer i et fase-uafhængig måde [14].

Vi udførte derefter genomisk undertype analyse af alle ACVR2 ikke-udtrykkende cancere og fandt, at manglen på det kromosomale ustabilitet (CIN) fænotype korreleret med

ACVR2

promotor hypermethylering (tabel 2), hvilket antyder adskilte veje for MSI- /LOH + og MSI- /LOH -. tyktarmskræft

samlet set tyder disse data, at de klinisk-patologiske virkninger af ACVR2 protein tab kan være ens i begge MSI og MSS tarmkræft trods forskellige underliggende mekanismer af tab, implicerer ACVR2 tab som et vigtigt skridt i colon carcinogenese.

diskussion

Afbrydelse af activin signalering er almindelig i MSI-H tyktarmskræft cellelinjer gennem mutation af

ACVR2

i en af ​​sine polyadenine skrifter [10] , så du mister ACVR2 protein [2]. Tab af ACVR2 proteinekspression blev også bemærket i en lille delmængde af MSS coloncancerformer [2]. Her vurderede vi forekomsten og mekanisme forstyrret activin signalering i MSS coloncancerformer og viser, at activin signalering er målrettet til forstyrrelser på flere niveauer i MSS kolon tumorer. Mest almindeligt,

ACVR2

udtryk går tabt via en kombination af LOH og epigenetisk inaktivering af

ACVR2

promotor. Disse resultater understreger betydningen af ​​ophævet activin signalering i tyktarmen tumorigenese, som dens forstyrrelser forekommer i både MSI og MSS undertyper af tyktarmskræft med forskellige distinkte mekanismer.

I MSI-H tyktarmskræft, både TGFp og activin er ophævet på grund af rammeskift mutationer i type II-receptoren [2], [17]. Tabet af begge disse signalveje kan være gavnligt for tumorvækst [12], [18]. Både TGFp og activin bruge de samme intracellulære SMAD proteiner (SMAD 2 og 3) at overføre deres signal. Vi har tidligere observeret mere end 50% overlap mellem

ACVR2

TGFBR2

mutationer i ubearbejdet MSI kolon tumorer [2], muligvis på grund af additive effekter i mediere væksten reaktion, som i øjeblikket under undersøgelse .

Det fremgår, at i MSI tyktarmskræft

ACVR2

mutationer kan forekomme tidligt i tumorigenese og er forbundet med øget lokal vækst [14]. I MSS coloncancere, tab af ACVR2 korreleret med større tumorer, i overensstemmelse med forstyrrelser af activin-induceret væksthæmning. Timingen af ​​

ACVR2

mutationer i MSI tyktarmskræft kan være den samme som på

TGFBR2

hvor opstår læserammeforskydningsmutationer i høj kvalitet dysplasi på grænsefladen til malignitet [17].

Vi viser, at i MSS tyktarmskræft mindst tre medlemmer af activin signaleringskaskade, ACVR2, ACVR1, og pSMAD2 er afbrudt. En væsentlig undergruppe af colontumorer vises et fald i phosphoryleret SMAD med intakt ACVR2 og TGFBR2, hvilket indikerer en separat primær begivenhed nedstrøms for de primære receptorer. Et tilfælde af tab af ACVR1, ACVR2 og pSMAD2 blev identificeret, som var TGFBR2 farvning positive (tabel 2). Dette kan skyldes primær inaktivering af pSMAD2 og separat målretning af begge activin-receptorer, eller en IHC positiv trunkeret TGFBR2, førende pSMAD2 tab. Effekten af ​​tab af flere mål i den samme signalering kaskade skal stadig nøje udforsket og foreslår forskellige funktioner for hvert medlem.

Vi har detekteret LOH på

ACVR2

locus i 6% af MSS tyktarmstumorer, stigende til 50% i tumorer med tab af ACVR2 proteinekspression. Denne samlede sats er lidt lavere end hyppigheden af ​​

ACVR2

LOH tidligere rapporteret i en kohorte med ukendt

ACVR2

status [19], selv om vi tidligere har observeret kohorte-afhængige frekvenser for ACVR2 udtryk, kan være stadie eller race-afhængige [14].

Vores mutationsanalyse fokuseret på hotspots beslægtet med dem, der er impliceret i inaktivering af

TGFBR2

kinasedomæne inaktivering [4], men vi fandt ikke eventuelle tumorassocierede mutationer når sekventering alle exoner i ACVR2 udtrykkende og ikke-udtrykkende coloncancer-cellelinjer. Det er muligt, at mutationer uden for hotspots kan bidrage til tab af ACVR2 i primære tyktarmskræft prøver, selv i lyset af de beviser for LOH samt epigenetisk inaktivering, vil dette sandsynligvis være en mindre vigtig tumorigen mekanisme. Det kan dog spille en rolle i de tre tumorer med tab af ACVR2 hvor vi fandt ingen genetisk eller epigenetisk mekanisme direkte forklarer, at tab.

Dette er den første rapport, der beskriver ACVR2 tab i MSS tyktarmskræft og

ACVR2

promotor hypermethylering som en mekanisme, og i kontrast til mekanismerne i

ACVR2

tab i MSI tyktarmskræft celler [12]. I både primære MSS colontumorer og i HT29 colon cancerceller, region promotor-hypermethylering, der er forbundet med tab af

ACVR2

udtryk er mellem nukleotiderne -1297 til -958. Blandt gener, som er mål for epigenetisk inaktivering,

hMLH1

er bedst undersøgt for methylering, og det er blevet foreslået, at promotorregionen grænser op til transkriptionsstartsitet (TSS) er kritisk for transkriptionel inaktivering af dette gen [ ,,,0],20]. Der er mangel på lignende data for de fleste andre gener, men

hMLH1

promotorregion data bruges ofte som et paradigme, og det menes, at for de fleste gener, analyse af en lignende promotorregion er kritisk at korrelere DNA-methylering resultater med tab af genekspression. I denne undersøgelse har vi analyseret 1500 bp proksimalt for TSS, og fundet god korrelation mellem

ACVR2

promotor methylering (i regioner -958 til -1297) og tab af protein-ekspression ved IHC. Vores data tyder på, at i stedet for blot at nærhed til TSS, forskellig adgang til methylering co-aktivatorer eller repressorer i en promotor bestemmer gendæmpning, og for

ACVR2

kan forekomme en sådan region op mod 900 bp fra TSS.

Vi er opmærksomme på, at det samlede antal MSS patienter med ACVR2 tab, der blev undersøgt i denne undersøgelse ikke er stort, hvilket understreger, at dette er en relativt sjælden begivenhed [15]. Vi havde ikke til hensigt at bestemme de overordnede frekvenser af sådanne begivenheder, men at vise en alternativ mekanisme ACVR2 protein tab i MSS tyktarmskræft. Af 51 primære, populationsbaserede MSS tumorprøver, 7 viste tab af ACVR2 udtryk. I tråd med de 51 emner bliver tilfældigt trukket fra kohorten, mellem 7% og 21% af MSS tumorer i befolkningen skal vise lignende tab af ACVR2 udtryk med 95% sikkerhed (Clopper-Pearson eksakt konfidensinterval). Forøgelse af stikprøvens størrelse til 77 afslørede tab af ACVR2 i 12/77 eller 16%, og en statistisk signifikant korrelation af tab af ACVR2 med øget tumorstørrelse. Endvidere genomisk subtype analyse afslørede, at LOH ved

ACVR2

var forbundet med CIN fænotype, mens

ACVR2

hypermethylering korreleret med CIMP fænotype. Mens disse kategoriseringer tillader tildeling af tab af

ACVR2

udtryk for promotor hypermethylering og /eller kromosomal ustabilitet som en mekanisme i MSS kræftformer, alternative mekanismer såsom histon modifikation og /eller microRNA’er kan være på spil, især i LOH negativ /methylering negative cancere. Vores data viser imidlertid en signifikant sammenhæng mellem tab af ACVR2 udtryk og LOH /epigenetisk inaktivering. giver således vi beviser for eksistensen af ​​enten kromosomal ustabilitet eller epigenetisk modifikation af

ACVR2

i tyktarmskræft og identificere en celle model for epigenetisk inaktivering af

ACVR2

. Den fulde kliniske effekt af disse data vil kræve yderligere bekræftelse i fremtidige studier med større patientprøver.

Som konklusion, tab af ACVR2, ACVR1 og pSMAD2 udtryk forekommer i en delmængde af MSS tumorer, og beviserne understøtter, at dette resulterer i ophævelse af de normale vækst suppressive aktivitet af activin signalering. Nedsat pSMAD2 er ofte forbundet med vildtype ACVR2 og ACVR1. Mekanismer til

ACVR2

tab omfatter LOH på

ACVR2

ACVR2

promotor hypermethylering mellem nukleotider -1297 og -958, som er forbundet med CIN og CIMP fænotyper hhv. Tab af ACVR2 er forbundet med øget tumorstørrelse. Derfor kan activin signalering inaktiveres ved markante mekanismer i MSI og MSS tyktarmskræft, hvilket tyder på vigtigheden af ​​denne vej i at kontrollere colonocyte vækst.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev foretaget i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board fra University of North Carolina hospitaler. Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke til indsamling af prøver som en del af under IRB godkendelse som en del af North Carolina Colorectal Cancer Study (NCCCS) se nedenfor. Analyse som en del af denne undersøgelse var helt de-identificeret, og ingen identificerende oplysninger var tilgængelige for PI, hvilket gør denne undersøgelse fritaget fra en separat samtykke.

Patient prøver

Sporadiske kolon tumorer blev prospektivt indsamlet under IRB godkendelse som en del af North Carolina Colorectal Cancer Study (NCCCS), en befolkning-baseret, case-kontrol undersøgelse omfattende 503 patienter [15], [16]. Mikrosatellit-analyse blev udført fra paraffinindlejret væv som tidligere beskrevet [2], adskillelse kohorten i 54 MSI-H, og 449 MSS /MSI-L patienter. Til denne undersøgelse blev udvalgt 51 MSS patientprøver med rigelig tumor og normalt væv tilfældigt.

cellelinier

MSI tyktarmskræft cellelinjer HCT116, SW48, DLD1, HCA7, HCT15, LoVo, LS174T, SNU175, SNU407, SW48, og RKO, samt MSS tyktarmskræft cellelinjer CaCo2, HT29, SNU81, SNU503, SW480, og T84 blev opretholdt i Iscoves modificerede Dulbeccos medium (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) og FET var opretholdt i F12 /Dulbecos Modified Eagles Medium ved betingelser tidligere beskrevet [12]. Alle cellelinjer er tilgængelige fra ATCC bortset FET (slags gave fra Michael Brattain, Medical College of Ohio, Toledo, OH) [21].

Tissue mikrodissektion, DNA ekstraktion, og RNA Extraction

DNA fra formalin-fikserede, paraffin-indlejret materiale blev ekstraheret efter mikrodissektion under anvendelse af Takara DEXPAT kit (Takara Bio Inc., Japan). Genomisk DNA fra cellelinier blev opnået ved anvendelse QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA fra cellelinier blev opnået under anvendelse af TRIzol-reagens (Life Technologies Inc. Carlsbad, CA).

Antistoffer

Rabbit anti-TyrGly mACVR2 (482-494) (generøse gave fra W. Vale , Salk Institute), med sit mål epitop i C-terminus region ACVR2 (ud over den resulterende trunkering fra læserammeforskydning i exon 10) blev anvendt til immunhistokemi som beskrevet tidligere [2], [12]; kanin anti-TyrGly ACVR1 (474-494) blev anvendt ved 1:800; pSMAD2 (Cell Signaling) ved 1:250; samlede SMAD2 (Epitomics) ved 1:400; og TGBR2-C16 (Santa Cruz) ved 1:300.

Immunhistokemi for ACVR1, ACVR2, pSMAD2, TGFBR2 og SMAD2 Protein Expression

Immunhistokemi blev udført som tidligere beskrevet [2]. Farvning blev grupperet i tab eller 0 (fravær eller markant fald i forhold til tilstødende normale væv), reduceres eller 1+ (subtile nedgang i forhold til tilstødende normale væv), uændret eller 2+ (ingen ændringer i forhold til tilstødende normale væv), og øget eller 3+ (stigning sammenlignet med tilstødende normalt væv). Tre uafhængige efterforskere blindt scoret alle dias. Alle tre efterforskere skulle være i aftale om en tumor at blive kaldt 0 eller tab af udtryk.

Tab af heterozygositet (LOH) Analyse

Vurdering af LOH i

ACVR2

og

ACVR1

loci blev udført som tidligere beskrevet [22] udnytte 2 mikrosatellitmarkører (D2S1353 og D2S1399) flankerende

ACVR2

[19] samt en intragenisk markør for

ACVR1

(D2S2686) (se tabel S1).

CIN Analyse

Analyse for CIN blev udført som tidligere beskrevet [23]. Kort beskrevet forward oligonukleotidprimere var fluorescerende-mærket med FAM i 5′-enden (Applied Biosystems) og et sæt af 6 polymorfe mikrosatellitmarkører (D5S346, D5S409 D17S261 D17S250 D18S81, D18S91, og D18S69) (se tabel S1) blev anvendt til bestemmelse LOH på kromosom 5q, 17q og 18q.