PLoS ONE: Integreret Genomisk Analyse af 8q24 Amplification i livmoderkræft Identificerer ATAD2 som afgørende for myC-Dependent Cancers

Abstrakt

kromosom 8q24 er den mest almindeligt forstærket region på tværs af flere typer cancer, og den typiske længde forstærkningen tyder på, at det kan målrette yderligere gener til

MYC

. At undersøge rollerne for de gener hyppigst indgår i 8q24 amplifikationer, analyserede vi relationen mellem kopital ændringer og genekspression i tre sæt endometriecancere (N = 252); og i glioblastom, ovarie og brystkræft profileret af TCGA. Blandt de gener, der grænser

MYC

, udtryk for bromodomain-holdige gen

ATAD2

blev den mest forbundet med forstærkning. Bromodomain-holdige gener er blevet impliceret som mediatorer af MYC transkriptionel funktion, og faktisk

ATAD2

udtryk blev mere tæt forbundet med ekspression af gener vides opreguleret ved MYC end var

MYC

selv. Amplifikationer af 8q24, ekspression af gener nedstrøms fra MYC og overekspression af

ATAD2

forudsagde dårligt resultat og øget fra primær til metastatiske læsioner. Knockdown af

ATAD2

og

MYC

i syv endometrie og 21 brystcancercellelinier viste, at cellelinjer, der var afhængige af MYC også afhang ATAD2. Disse samme cellelinjer var også de mest følsomme over for histon deacetylase (HDAC) -hæmmer Trichostatin-A, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der identificerer bromodomain-holdige proteiner som mål for inhibering med HDAC-inhibitorer. Vores data indikerer høj ATAD2 udtryk er en markør for aggressive livmoderkræft, og foreslå specifikke inhibitorer af ATAD2 kan have terapeutisk anvendelighed i disse og andre MYC-afhængige kræftformer

Henvisning:. Ræder MB, Birkeland E, Trovik J, Kråkstad C, Shehata S, Schumacher S, et al. (2013) Integreret Genomisk Analyse af 8q24 Amplification i livmoderkræft Identificerer

ATAD2

som afgørende for

MYC-

afhængige kræftformer. PLoS ONE 8 (2): e54873. doi: 10,1371 /journal.pone.0054873

Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina

Modtaget: September 28, 2012; Accepteret: 17. december 2012; Publiceret: 5 feb 2013

Copyright: © 2013 Raeder et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte : Helse Vest Tilskud 990.172 (MBR), 911.351, 911.624, og 911.626 (HBS); Universitetet i Bergen; det norske Cancer Society; forskningsrådet Norges Tilskud 205404 og 193.373 (HBS); National Cancer Institute (K08CA122833 og U54CA143798); og en V Foundation Scholarship (RB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

endometriekarcinom er den mest almindelige bækken gynækologiske malignitet, med en levetid risiko blandt kvinder på 2-3% [1]. Ca. 75% af tumorer er begrænset til livmoderen corpus ved diagnose og er resekteres. Men 15% -20% af disse tumorer tilbagefald. Disse tumorer og tumorer, der er metastatiske ved præsentationen, reagerer dårligt på kemoterapi eller strålebehandling og har normalt dødelig [1], [2].

Der er behov for hidtil ukendte markører til at identificere patienter med høj risiko for tilbagefald , og til at udvikle nye behandlinger til patienter med metastatisk sygdom [3], [4]. Desværre er forskningen mod disse mål er stærkt underrepræsenteret i endometriecancer forhold til andre typer kræft, såsom bryst- og ovariecancer. En fremgangsmåde er at identificere gener, som, når ændret af somatiske genetiske begivenheder, drive tumor progression. Disse ændringer kan således anvendes som markører for aggressive cancere og generne kan tjene som potentielle terapeutiske mål.

Den hyppigste fokal amplifikation i endometriecancer er på 8q24 [5]. Faktisk 8q24 er den mest almindeligt amplificerede område på tværs af flere cancertyper [6], og denne forstærkning er en negativ prognostisk markør i flere kræftformer [7]. Selvom

MYC

er et sandsynligt mål [6], virkningerne af denne forstærkning i endometriecancer er aldrig blevet dissekeret. Det er faktisk muligt, at det er målrettet mod flere gener, som det er blevet vist for amplificeringer andetsteds i kræft genomet [8]. For eksempel kan et tilstødende gen,

ATAD2

, har vist sig at være en co-regulator af

MYC

og overekspression af

ATAD2

er blevet associeret med dårlig prognose i bryst- , lunge og prostatakræft [9], [10], [11].

Vi udforsker den rolle, 8q24 forstærkning i endometriecancer gennem integrative genomiske analyser af primære og metastatiske livmoderkræft med omfattende kliniske data, og identificere

ATAD2

som en ekstra mål af 8q24 forstærkning i disse kræftformer. Vi identificerer kopi nummer gevinst på

ATAD2

som en regulator af

ATAD2

udtryk, præsentere de første data forbinder

ATAD2

overekspression til

MYC

aktivering, og give funktionelle data tyder ATAD2 som et terapeutisk mål i MYC-afhængige kræftformer.

Materialer og metoder

Etik Statement

indsamlingen af ​​endometrie karcinom primærvalg og metastaser til denne undersøgelse var godkendt af det norske Datatilsynet (961.478-2), Norsk Samfundsvidenskab data Services (15501) og “regional Research Ethics.

Udvalg i medicin, Western Norge” (referere 052.01). Alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke.

Patient Series

endometrialcarcinom primærvalg og metastaser blev indsamlet fra patienter, der behandles ved Haukeland Universitetshospital, Norge som beskrevet tidligere [5]. Tumorer indsamlet til den primære undersøgelse og qPCR validering serien blev fastfrosset straks efter resektion; tumorer indsamlet til FISH blev formalinfikseret og paraffinindlejret. Patienterne blev fulgt fra primær kirurgi indtil oktober 2010 eller død. De kopi-nummer profiler af den primære undersøgelse serien, og udtrykket profiler (Agilent 21 k og 22 k oligoarrays) fra en delmængde af 57 tumorer, blev tidligere publiceret [5].

RNA analyse

RNA blev ekstraheret og hybridiseret til Agilent 44K arrays (Kat G4112F) ifølge producentens anvisninger og som tidligere beskrevet [5]. Signalintensiteter blev vurderet ved anvendelse BRB-ArrayTools (National Cancer Institute, USA). De arrays var batch median normaliseret.

Real-time kvantitativ PCR

cDNA blev syntetiseret fra 1 pg RNA ved hjælp af Høj kapacitet RNA til cDNA kits (Applied Biosystems). Angivelse af

ATAD2

MYC

blev bestemt ved anvendelse af TaqMan genekspression assays Hs00204205 og Hs00905030 henholdsvis (Applied Biosystems), og alle prøver blev kørt på mikrofluide kort pr producentens instructuions, hjælp GAPDH-Hs99999905_m1 som endogen kontrol. Prøver blev kørt i tre eksemplarer og analyseret i RQ manager (Applied Biosystems).

FISH

Tissue microarrays (TMAS), der repræsenterer den højeste kvalitet områder i hver tumor blev fremstillet som tidligere rapporteret [12] og behandlet ved 56 ° C ° natten før hybridisering. FISH blev udført ved hjælp af MYC Spectrum Orange FISH probe kit og kromosom tælling sonde 8 (CEP8) (Vysis) i henhold til producentens anvisninger, som tidligere rapporteret [13]. Tælling blev udført i områder med optimal vævsfordøjelse og ingen overlappende kerner. Probe og styresignaler blev talt i 40-60 celler i områder med optimal væv fordøjelse og ingen overlappende kerner. Amplifikationer blev scoret, da den MYC /CEP8 forholdet var . 1.0

TCGA Validering Dataset

Vi adgang niveau 3 data fra TCGA dataportal i november og december 2010. brystkræft vi opnåede genekspression data for 279 tumorer og 24 normale kontroller (Agilent 244K udtryk arrays) og copy-nummer fra 176 tumorer (Affymetrix SNP 6,0 arrays). For kræft i æggestokkene opnåede vi genekspression (Agilent 244K udtryk arrays) og copy-nummer (Agilent 1M arrays) data fra 514 og 489 tumorer, hhv. For glioblastom opnåede vi genekspression data fra 385 tumorer og 10 normale kontroller (Affymetrix U133A arrays) og kopi-nummer data fra 261 tumorer (Agilent 244K arrays).

Cell Levedygtighed

Lentivirale vektorer kodning shRNAs specifikke for

ATAD2

,

MYC

, og kontrollen

GFP

,

LACZ1

, og

LACZ2

(tabel S1) blev opnået fra The RNAi Consortium. Lentivirus blev produceret af transfektion af 293T-celler med vektorer koder hver shRNA (5 ug) med emballage plasmider koder PSPAX2 og PDM2.G hjælp Fugene HD (Roche). Lentivirus-holdige supernatant blev opsamlet 48 og 72 timer efter transfektion, samlet og opbevaret ved -80 ° C. Celler blev inficeret i polybren-holdige medier, centrifugeret ved 1.000 g i 30 min, og udvalgt i puromycin (2,5 ug ml

-1), startende 24 timer efter infektion.

cancercellelinier blev opnået fra ATCC , DSMZ, ECACC og HSRRB, og dyrkes efter leverandørens anvisninger (tabel S2). Cellelevedygtighed efter RNAi blev målt i 96-brønds plader. Otte brønde podet med celler blev inficeret ved anvendelse af 1:30 fortyndinger af virus indeholdende hver shRNA. Halvdelen af ​​brøndene undergik puromycinselektion, og cellelevedygtighed blev målt under anvendelse Cell-Titer Glo (Promega) en uge senere. Værdierne fra hver fire eksemplarer blev midlet; “Outlier” brønde blev udelukket, hvis replikatbrønde havde SD /middelværdi 0,2 og eksklusive godt forbedret variansen. De gennemsnitlige ATAD2- og MYC- hårnål værdier blev normaliseret til de middelværdier fra GFP kontrol.

For at bestemme Trichostatin-A følsomhed, Trichostatin-A (Sigma) (0,040 til 10 uM) og køretøj (DMSO) kontrol blev hver tilsat til tre brønde indeholdende hver cellelinie på plader med 96 brønde. Cellelevedygtighed blev bestemt efter 72 timer under anvendelse af celle-Titer Glo (Promega).

immunblotting

Celler blev vasket med PBS, høstet, lyseret under anvendelse af RIPA-lysepuffer med protease og phosphataseinhibitorer og centrifugeret ved 16.000 x g. Supernatant blev blandet med 4X SDS-prøvebuffer, kogt i 7 minutter og underkastet SDS-PAGE på 4-12% gradientgeler. Blots blev sonderet med antistoffer mod ATAD2 (HPA029424, Sigma), MYC (sc-764, Santa Cruz) og actin (sc-1615, Santa Cruz).

Statistik

Molekylære data var relateret til klinisk fænotype under anvendelse Pearsons χ

2 eller tosidet Student t-test efter behov. Vi brugte multivariat lineær regressionsanalyse til forudsigelse af

ATAD2

ekspressionsniveauerne. Univariate og multivariate overlevelse analyser blev udført ved log rank og Mantel-Cox metoder, hhv. “MYC signalerer styrke” og genekspression niveauer blev præsenteret som Z-scores.

Resultater

Vurdering af

MYC

som et mål af 8q24 Amplification

Omfattende biologisk data support

MYC

som et onkogen [14], og 8q24, husly

MYC

, er den mest almindelige forstærket region på tværs af flere typer kræft [6]. Men betydningen af ​​MYC aktivering i endometriecancer er hovedsagelig ukendt.

Vi udførte en integreret analyse af kopi-nummer og udtryk data til at lede efter beviser for, at

MYC

er et mål på 8q24 forstærkning i endometriecancer. Vi evaluerede udtryk data fra en række af 82 livmoderkræft opnået i et enkelt amt i Norge, med tilsvarende genom-dækkende kopi-nummer data fra 70 tumorer (den “primære undersøgelse serien”). Seksten af ​​disse tumorer (23%) havde 8q24 amplifikation. De fleste af disse amplifikationer var lavt niveau, nemlig op til en kopi-antal på 4,7. Vi valideret vores resultater i yderligere fire datasæt. To af disse repræsenterer prøver med genom-dækkende udtryk profilering: en “intern validering serien” som vi genererede data fra 40 primære og 19 metastatiske livmoderkræft rekrutteret fra samme region i Norge, og en “ekstern validering serien” repræsenterer tidligere offentliggjorte udtryk profiler fra 111 tumorer [5]. De andre to validering sæt repræsenterer analyserede prøver med fokuserede analyser: en “qPCR serien” af 162 prøver, og en “FISH-serie” af 399 prøver. Patient karakteristika og histopatologiske variabler for alle vores interne datasæt er vist i tabel S3.

Vi fandt, at både

MYC

og gener opreguleres af MYC blev overudtrykt i livmoderkræft med 8q24 forstærkning i forhold til endometrie cancere uden den (p = 0,047 og p = 0,0078, henholdsvis) (figur 1A-b). Vi brugte en tidligere offentliggjorte liste over 68 gener fundet at være opreguleret af MYC tværs af flere sammenhænge og assays (tabel S4, www.myccancergene.org) [15] og scorede deres overekspression ( “MYC signalering styrke”) ved hjælp GSEA [16]. Vi testede også fem ekstra MYC aktivering signaturer opnået fra “gensæt Berigelse database”, hvilket afspejler aktiveringen af ​​MYC i forskellige sammenhænge. Fire af disse blev udtrykt ved højere niveauer i livmoderkræft med 8q24 forstærkning (Figur S1a).

(a)

MYC

udtryk og (b) MYC signalering er begge steget blandt livmoderkræft med 8q24 amplifikation. (C) Variationer i

MYC

udtryk kun forklare en lille del af variationen i MYC signalering. Lineære passer vises i rød, gul og grøn for den primære undersøgelse serien, intern validering serie, og ekstern validering serie hhv. (D) Længderne af amplifikationer, der indeholder

MYC

er betydeligt større end forventet sammenlignet med amplificeringer observeret andetsteds i disse kræftformer. (E) Blandt 26 gener i 8q24 top med tilsvarende udtryk data, udtryk for

ATAD2

er stærkest, og signifikant associeret med forstærkning. Blå bjælker viser den procentvise forøgelse i genekspression og røde bjælker viser p-værdierne. Tærsklen betydning er Bonferroni-korrigeret for flere hypoteser. (F) Angivelse af

ATAD2

er stærkt korreleret med MYC signalering styrke. Lineære passer vises som i panel c.

Men variationer i

MYC

udtryk selv kun forklarede en lille del af variationer i MYC signalering styrke (R2 = 0,11, p = 0,002 ) (figur S1b). Vi opnåede tilsvarende svage resultater i de interne og eksterne validering datasæt (R2 = 0,00, p = 0,34 og r2 = 0,06, p = 0,012, henholdsvis; fig S1B). På tværs af alle tre datasæt, variationer i MYC udtryk kun udgør 5% af variationer i MYC signalering styrke (R2 = 0,05, figur 1c).

Desuden 8q24 amplifikationer er længere end den typiske fordeling af forstærkning størrelser i endometrie cancer (p = 0,0021) (fig 1c), og som regel involverer multiple gener. Vi hypotese derfor, at 8q24 amplificeringer kan målrette yderligere gener, hvoraf nogle kan fungere ved at øge MYC signalering. For at identificere disse, vi evalueret alle 26 gener i toppen region forstærkning på 8q24, som vi havde udtryk data, til at identificere gener, hvis udtryk korreleret stærkest med forstærkning.

Angivelse af

ATAD2

korrelerer kraftigt med 8q24 amplifikation og MYC Signaling

ekspression af

ATAD2

blev mere stærkt forbundet med amplifikation af 8q24 end var ekspression af ethvert andet gen i top region af amplifikation (p-værdi = 2.77E-06) (figur 1d). Fire andre gener,

NDUFB9

,

DERL1

,

FAM91A1

, og

WDR67,

signifikant opreguleret ved 8q24 forstærkning, om end mindre stærkt end

ATAD2

Angivelse af

ATAD2

også korreleret med MYC signalering styrke stærkere end gjorde udtryk for noget andet gen i 8q24 peak region (R2 = 0,48, p. 0,001; Figur 1e, fig S1b). Faktisk sammenhængen mellem

ATAD2

udtryk og MYC signalering styrke blev observeret selv blandt prøver uden 8q24 forstærkning (R2 = 0,48, p 0,001). Sammenhængen mellem

ATAD2

udtryk og MYC signalering styrke var mere end dobbelt så stærk som den næste mest signifikant associeret gen (

NDUFB9

) og stærkere end for

MYC

selv ( R2 = 0,05, figur 1c).

ATAD2

er ikke en af ​​de 68 gener i MYC aktivering signatur, og til vores viden

MYC

har ikke vist sig at modulere ekspressionen af ​​

ATAD2

[15]. Imidlertid ATAD2 blev tidligere fundet at binde til MYC og E-box-regionen i flere MYC målgener, og ATAD2 niveauer blev fundet at være begrænsende for MYC-afhængig transskription [9].

Både hele genomet validering serien udstillet også sammenhængen mellem MYC signalering og

ATAD2

udtryk (R2 = 0,54, p 0,001 og R2 = 0,45, p 0,001 i den interne og eksterne validering serien, henholdsvis), og den relative mangel på korrelation med

MYC

udtryk (R2 = 0,00, p = 0,33 og R2 = 0,06, p = 0,012; Tal 1f og S1b). Angivelse af

ATAD2

også korreleret med fire af de fem ekstra underskrifter MYC aktivering, og korreleret stærkere med disse underskrifter end gjorde udtryk for

MYC

selv (tabel 1). Den sidste signatur viste ingen sammenhæng med

ATAD2

eller

MYC

udtryk.

Forstærkning af 8q24 og ekspression af

ATAD2

, men ikke MYC , er forbundet med sygdom progression

Blandt de 70 livmoderkræft, som vi havde genom-dækkende SNP-array data, 8q24 forstærkning blev forbundet med reduceret progressionsfri overlevelse (p = 0,024) og øget risiko for sygdomsspecifikke død (p = 0,043). Forstærkning af 8q24 var hyppigst i ikke-endometrioide (p = 2.98E-05) og high-grade tumorer (p = 2.90E-08) (tabel S5), har også forbundet med aggressive kræftformer [17].

Vi bekræftede 8q24 forstærkning er forbundet med dårlig prognose ved hjælp FISK i en selvstændig serie af 399 livmoderkræft. Tyve cancere (5%) udviste forøget 8q24 kopital i forhold til kromosomet 8 centromeren (figur 2a). Disse var forbundet med 64% 5-års overlevelse, versus 85% for cancere uden 8q24 amplifikation (p 0,001) (figur 2b). Et lignende mønster blev set for fornyet overlevelse (p = 0,001). Amplifikation af 8q24 var også forbundet med høj FIGO fase (p = 0,003), ikke-endometrioide histologisk subtype (p 0,001), og høj bedømmelse (p 0,001). (Tabel S5)

FISH-prober mod 8q24 (rød) og kromosom 8 centromer (grøn) i en primær tumor og den parrede metastaser show forstærkning kun i sidstnævnte (a) (b) Blandt 399 patienter vurderet ved FISH, dem med 8q24 amplifikationer har dårligere resultat. I den primære undersøgelse serien, tumorer blandt de højeste kvartiler af (c)

ATAD2

udtryk og (d) MYC signalering styrke også havde øget risiko for sygdomsspecifikke død. (E) østrogen receptor negativ (ER-) tumorer med

ATAD2

udtryk i den øverste kvartil blev også forbundet med en høj risiko for sygdomsspecifikke død; risikoen var meget lavere blandt østrogen receptor positive (ER +) tumorer med

ATAD2

udtryk i den nederste kvartil. (F)

ATAD2

udtryk og (g) MYC signalering er både højere blandt metastaser end primære tumorer i det indre validering serien.

Høj udtryk for

ATAD2

og MYC signalering blev også forbundet med øget risiko for cancer progression (p = 0,003 og p = 0,015, henholdsvis), cancer-specifik død (p = 0,004 og p = 0,001) (figur 2c-d), og andre dårlig prognose funktioner .

ATAD2

udtryk var højere i ikke-endometrioide, høj kvalitet og ER negative tumorer (p 0,001, p 0,001 og p = 0,02 henholdsvis; Tabel S6); høj MYC signalering var associeret med dårligt differentierede (p = 0,0016) og ikke-endometrioide (p 0,001) cancere. Angivelse af

ATAD2

blev også negativt forbundet med udtryk for

ESR1

(R2 = 0,10, p = 0,005). Ligeledes har tidligere undersøgelser vist, at

ATAD2

udtryk er højere i triple negativ brystkræft tumorer [18], og nedreguleres af østrogen i cellekultur [19].

Faktisk

ATAD2

udtryk var en uafhængig prædiktor for sygdomsspecifikke død (HR = 1,83, p = 0,027) og sygdomsprogression (HR = 1,62, p = 0,011) efter justering for eR status. ER-negative tumorer med øverste kvartil

ATAD2

udtryk var særligt dødelige. (HR = 4,1, p = 0,002, figur 2e)

Vi bekræftede disse resultater ved at vurdere

ATAD2

ekspression ved kvantitativ PCR og ER status ved immunhistokemi i vores qPCR validering serie af 162 yderligere tumorer. Blandt disse, ER-negative tumorer med øverste kvartil

ATAD2

udtryk var forbundet med endnu værre resultater end i den primære serie (HR = 6,8, p 0,001) (Figur S1c). Høj

ATAD2

udtryk også forblev forbundet med øget risiko for sygdomsspecifikke død (p = 0,0043) og kortere progressionsfri overlevelse (p = 0,016). Efter justering for ER status,

ATAD2

udtryk fortsatte med at forudsige sygdomsspecifikke død (HR = 1,86, p = 0,018), men kun trended mod en forening med sygdomsprogression (HR = 1,31, p = 0,11). Angivelse af

ATAD2

var også højere i høj kvalitet (p 0,001)., Ikke-endometrioide (p = 0,005), og ER-negative tumorer (p = 0,02) (tabel S6)

i modsætning hertil

MYC

udtryk var ikke forbundet med progression eller risiko for sygdomsspecifikke død i enten vores primære undersøgelse serien (p = 0,07 og p = 0,68 henholdsvis) eller qPCR validering serien (p = 0,53 og p = 0,28 henholdsvis). Høj ekspression af

MYC

var forbundet med højkvalitets i begge serier (p 0,001 og p = 0,02, henholdsvis), og med ikke-endometrioide histologi i den primære undersøgelse serien (p = 0,03) (tabel S6) .

Metastaser også udviser mere 8q24 forstærkning,

ATAD2

udtryk, og

MYC

signalering styrke end primære tumorer. I forhold til primære tumorer, metastaser udstillet 2,4 × højere omdrejningspunkt 8q24 forstærkning ved FISH (14,3%; p 0,007). Blandt de 399 patienter i FISH-serien, 49 havde parret primære og metastatiske tumorer. Fem af disse prøver (10%) udviste ikke 8q24 amplifikation i den primære men erhvervede det i metastase. Kun en prøve (2%) udviste den modsatte mønster. For at undersøge

ATAD2

udtryk og MYC signalering, vi sammenlignet også de 42 primære tumorer med de 19 metastaser i vores interne validering serie. Begge

ATAD2

udtryk og MYC signalering styrke var højere i metastaser (p = 0,002 og 0,004 henholdsvis; Figur 2f-g), herunder blandt 8 patienter med parrede primære tumorer og metastaser (p = 0,01 og 0,05 henholdsvis) .

Udvidelse til andre kræft typer og Normal Tissue

Vi undersøgte også, om 8q24 forstærkning er forbundet med øget

ATAD2

udtryk i andre typer kræft. Konkret brugte vi data fra 514 æggestokkene, 279 brystkræft og 385 glioblastomer fra The Cancer Genome Atlas [20], [21]. Disse omfattede udtryk data fra tilstødende normale væv i 24 brystcancere og 10 glioblastomer. 8q24 amplifikationer blev observeret i 72% (N = 126) af de brystcancere, 74% (N = 364) af de ovariecancere, og 10% (N = 27) af glioblastomer.

ATAD2

blev co-forstærket til det samme niveau som

MYC

i næsten alle tumorer (som det var blandt vores livmoderkræft, Figur S1d-g)

Angivelse af.

ATAD2

korreleret med 8q24 forstærkning blandt alle tre kræftformer (R2 = 0,47, 0,11, og 0,36 for brystkræft, glioblastomer og æggestokkene henholdsvis; p 0,001 i alle tilfælde tabel S7), og var 2,6 × og 2,5 x højere blandt de kræftformer i forhold til normalt væv i brystkræft og glioblastom (p 0,001 i begge tilfælde).

MYC

udtryk korreleret mindre kraftigt med 8q24 forstærkning i alle tre kræfttyper (R2 = 0,12, 0,07, og 0,10 for brystkræft, glioblastomer og æggestokkene henholdsvis; p 0,001 i alle tilfælde).

MYC

udtryk i brystkræft var overraskende halvdelen af ​​normalt væv (p 0,001); i glioblastom det var højere med en faktor på 3,5 (p 0,001).

ATAD2

ekspression også korreleret med MYC signalering i alle tre cancertyper (R2 = 0,11, 0,21, og R2 = 0,31, henholdsvis for brystkræft, glioblastomer og æggestokkene; p 0,001 i alle tilfælde), og blev mere stærkt korreleret med MYC signalerer styrke end

MYC

udtryk var (R2 = 0,10, p 0,001; R2 = 0,09, p 0,001;. og R2 = 0,02, p = 0,003 i de tre kræfttyper)

ATAD2

Expression er korreleret til

E2F

Gene Expression og

ATAD2

Kopier antal i en additiv Manner

Vi udforskede også de relative bidrag af E2F, østrogen, og kopi-nummer på ATAD2 udtryk.

ATAD2

promoter region indeholder bindingssteder i flere E2F proteiner og tidligere funktionelle data har vist, at E2F stiger

ATAD2

udtryk i cellekultur [9], [22];

ATAD2

er også blevet fremkaldt af østrogen [23]. I vores data, udtryk for hver

E2F

transskription faktor var forbundet med

ATAD2

udtryk, men kun at medtage

E2F1

,

E2F2

E2F8

forbedret den samlede pasform af en model forudsige

ATAD2

udtryk fra

ATAD2

kopi-nummer og

ESR1

udtryk. Ekspressionsniveauerne for disse tre gener var stærkt korreleret, og vi fokuserede på

E2F1

.

Vi fandt, at

ATAD2

kopi-nummer,

ESR1

udtryk og

E2F1

udtryk forklarede 77% af variationen i

ATAD2

udtryk i endometriecancer, og hver af de prediktorvariabler forblev signifikant associeret med

ATAD2

udtryk i den justerede model (figur 3a og tabel S7). Vi fandt også, at

ATAD2

kopi-nummer og

E2F

udtryk uafhængigt forudsagt

ATAD2

udtryk i brystkræft, kræft og glioblastom æggestokkene (figur 3b-d og tabel S7) .

ESR1

, som var mindre stærkt forbundet med

ATAD2

udtryk, var signifikant i den justerede model kun i endometriecancer (p = 0,016) og glioblastom (p 0,001), ikke i æggestokkene eller brystkræft. Disse data tyder på, at den kopi-antal

ATAD2

er en vigtig faktor for

ATAD2

udtryk selv i sammenhæng med andre cellulære reguleringsmekanismer.

(a) Endometriecancer , (b) brystcancer, (c) ovariecancer, og (d) glioblastoma. Gule prikker repræsenterer prøverne og den blå plade er det forudsagte 3-D pasform. De grønne og røde linjer er afstanden mellem de forudsagte fit og den faktiske observationer for prøver over og under 3D-fit plade henholdsvis.

Afhængighed af

MYC

Forudsiger Afhængighed

ATAD2

reaktion på HDAC-hæmmere i Endometrial- og Breast cancer Cells

resultaterne ovenfor førte os til hypotesen, at

ATAD2

udtryk fremmer MYC signalering og at endometriecancer celler, er afhængige af

myc

vil også være afhængig af

ATAD2

. Vi målte effekten på levedygtighed shRNA knockdowns af

ATAD2

og

MYC

i syv endometriecancer cellelinjer. Vi brugte to shRNAs imod hvert gen, vælge dem, der udviste den største reduktion af protein udtryk blandt seks og tre shRNAs screenet mod

ATAD2

og

MYC

(figur 4a, b).

Western blots til (a) ATAD2 og (b) MYC angiver omfanget af knockdown med seks shRNAs mod

ATAD2

og tre shRNAs mod MYC henholdsvis. ATAD2 forsøg blev udført i KLE celler og MYC eksperimenter blev udført i TE9 celler inficeret med GFP kontrol og MYC vektorer. Efterfølgende eksperimenter anvendte

ATAD2

shRNAs a og e, og MYC shRNAs a og b. Reduktioner i cellelevedygtighed blandt syv endometriecancer cellelinier (c) og 21 brystkræft cellelinier (d) var stærkt korreleret efter knockdown af ATAD2 eller MYC og efter knockdown af MYC og behandling med HDAC-hæmmer Trichostatin-A (1,25 uM) ( e-f).

Knockdown af enten

ATAD2

eller

MYC

resulterede i stærkt korrelerede fald i levedygtighed på tværs af de syv celle endometriecancer linjer (R2 = 0,70 , p = 0,020, figur 4c). I to tilfælde, vi observeret over 75 reduktioner% i levedygtighed. Vi fandt ingen sammenhæng mellem udtryk for

ATAD2

eller

MYC

eller 8q24 kopi nummer og følsomhed over for

ATAD2

eller

MYC

knockdown.

Disse resultater antydede, at MYC-afhængige cancertyper i andre typer også kan være afhængig af ATAD2. Ingen reduktion i proliferation havde tidligere været set med

ATAD2

knockdown i TIG3-T eller U2OS celler [9]. Når vi testet en større panel af 21 brystkræft linjer, men bekræftede vi den tætte sammenhæng mellem fald i levedygtighed efter knockdown af ATAD2 eller MYC (R2 = 0,61, p 0,001; figur 4d).

Foreningen mellem afhængighed af

MYC

og

ATAD2

foreslår ATAD2 som et terapeutisk mål i

MYC

-afhængige kræftformer. Ud fra følgende betragtninger

MYC

har længe været en kendt onkogen, kliniske tilgange til at blokere MYC signalering er endnu ikke haft succes. Histon deacetylase (HDAC-hæmmere), har dog vist sig at indirekte hæmme bromodomain-holdige proteiner såsom ATAD2 [24].

Vi brugte Connectivity kort [25] for at identificere forbindelser, hvis underskrifter anticorrelated med MYC signalering underskrift. Blandt de 1309 små molekyler repræsenteret ved Connectivity Kort, blev underskrivelsen af ​​HDAC-hæmmer Trichostatin-A mest anticorrelated med MYC signalering signatur. (P-værdi 0,00001; Tabel S8). Vi genererede også en underskrift af aggressiv sygdom fra den primære undersøgelse serien, ved hjælp af de 50 mest over- og under-udtrykte gener hos patienter med metastatisk sygdom i forhold til patienter uden metastatisk sygdom. Vi fandt Trichostatin-En signatur blev også den mest anticorrelated med denne underskrift aggressiv sygdom, bundet med underskrifter fra fire andre molekyler (p 0,00001; Tabel S8).

For at funktionelt bekræfte forholdet mellem Trichostatin-A og MYC afhængighed, vi testede alle endometriecancer og brystkræft cellelinier for væksthæmning af Trichostatin-A og sammenlignet resultaterne til

MYC

knockdown. Trichostatin-A hæmmet vækst i de samme cellelinier, der var afhængige af

MYC

både i endometrie (R2 = 0,74, p = 0,013, figur 4e), og i brystkræft cellelinier (R2 = 0,31,