PLoS ONE: Mitotisk skridning og ekspression af Survivin er knyttet til Differential følsomhed for Human kræftcelle-Lines til kinesin-5 Inhibitor Monastrol

Abstrakt

De mitotiske kinesin-5 motor proteiner krydsbinding og skub hinanden antiparallelle spindel mikrotubuli, hvilket udfører vigtige funktioner i mitotiske spindel dynamik. Specifik hæmning af deres funktion ved monastrol-lignende små molekyler er blevet undersøgt i kliniske forsøg som anticancer behandling, med kun delvis succes. Således er strategier, der forbedrer effektiviteten af ​​monastrol-lignende anticancerlægemidler påkrævet. I den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi sammenhængen mellem følsomhed over for monastrol og forekomst af mitotisk skred i flere humane cellelinjer. Vi fandt, at rang af følsomhed over for monastrol, fra mest følsomme over for mindst følsomme, er: AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29. Vi viser korrelation mellem følsomheden af ​​en bestemt celle-linje til monastrol og tendensen af ​​den samme celle-linie til at undergå mitotisk glidning. Vi fandt også, at i de monastrol resistente HT29-celler, langvarige monastrol behandlinger øger mRNA og protein niveauer af kromosomale passager protein survivin. I modsætning hertil er survivin niveauer ikke forhøjes ved denne behandling i monastrol-sensitive AGS celler. Vi viser endvidere, at overekspression af survivin i monastrol-følsomme AGS celler reducerer mitotisk skred og øger modstanden mod monastrol. Endelig viser vi, at under kortvarig eksponering for monastrol, Si RNA silencing af survivin ekspression reducerer cellernes levedygtighed i begge AGS og HT29-celler. Vores data tyder på, at effektiviteten af ​​anti-cancer behandling med specifikke kinesin-5-hæmmere kan forbedres ved modulation af ekspressionsniveauer for survivin

Henvisning:. Asraf H, Avunie-Masala R, Hershfinkel M, Gheber L ( 2015) Mitotisk skridning og ekspression af Survivin er knyttet til Differential følsomhed for human Cancer Cell-Lines til kinesin-5 Inhibitor Monastrol. PLoS ONE 10 (6): e0129255. doi: 10,1371 /journal.pone.0129255

Academic Redaktør: Qiliang Cai, Fudan University, KINA

Modtaget: Maj 16, 2014; Accepteret: 6 maj 2015; Udgivet: Juni 2, 2015

Copyright: © 2015 Asraf et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af Startup Fund, det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Ben-Gurion-universitetet i Negev, tildelt MH og LG; af den israelske Science Foundation tilskud 165/2013 bygherren til LG (https://www.isf.org.il/english/) og den israelske Science Foundation giver ingen. 891/2014 tildelt MH (https://www.isf.org.il/english/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

De mitotiske kinesin-5 motor proteiner (BIMC /Kif11 /EG5 /N-2) udføre bevarede funktioner i mitosespindelen dynamik. Opdaget i begyndelsen af ​​1990’erne, disse var de første kinesiner for hvilke der er påvist mitotiske roller i en række organismer [1-5]. Kinesin-5 motorer fungerer som homotetramerer med to par af katalytiske motordrevne domæner placeret på modsatte sider af en håndvægt-lignende tetramert kompleks [6, 7]. Ved denne bipolar struktur, kan kinesin-5 motorer krydsbinde og skub hinanden antiparallelle spindel mikrotubuli [8-11], således at udføre deres opgaver i spindel forsamling [1-5] og anafase spindel forlængelse [12-19].

Det humane kinesin-5 HsEg5 overudtrykkes i en lang række faste tumorer, hvilket tyder dets rolle i tumorigenese [20, 21]. På grund af de væsentlige mitotiske funktioner kinesin-5 motorer i spindel dynamik, og fordi mitose er en accepteret fase celle-cyklus for anti-cancer-foranstaltninger [22, 23], blev det den generelle opfattelse, at specifik hæmning af kinesin-5 motorer kunne tjene som en potentiel anti-cancerbehandling. Monastrol var den første rapporterede specifikke inhibitor af human kinesin-5, der er konstateret i en screening for små molekyler, der forårsagede mitosestandsning uden at påvirke mikrotubulusdynamik og andre cellefunktioner [24]. Siden opdagelsen af ​​monastrol blev adskillige gange ti molekyler rapporteret som allosteriske inhibitorer af HsEg5, med variable kræfter [23, 25]. De fleste af disse molekyler er specifikke for det humane HsEg5 fordi de binder til et allosterisk sted, loop 5 i det katalytiske domæne af kinesin-relaterede motorer (gennemgået i [23, 26, 27]), der varierer i længde og sekvens blandt kinesin homologe [28, 29]. Humane celler behandlet med monastrol og monastrol molekyler anholdelse i mitose med beskadigede monopolære spindler [24, 30] og undergå mitotisk celledød [31]. I nogle tilfælde monastrol behandlede celler findes i en G1-lignende fase på grund af mitotisk glidning [32]. Sidstnævnte fænomen tillader celler til at fortsætte til næste G1 fase uden at dividere deres DNA i tilstedeværelse af spindel skader (revideret i [33, 34]). Efter mitotisk glidning kan celler dø af apoptose forårsaget af en specifik checkpoint der overvåger DNA-indholdet i celler, exit mitose, kendt som “tetraploidy kontrolpunkt” [33, 35].

Adskillige specifikke HsEg5 inhibitorer har indtastet kliniske undersøgelser som anticancer midler [36-38]. Trods den reproducerbare cytotoksiske virkning i vævskulturer, disse kliniske forsøg afslørede begrænset succes (gennemgået i [27, 39]). En af de foreslåede årsager til denne ineffektivitet er ufuldstændig viden om de mitosestandsning veje og, som følge heraf manglende evne til at identificere molekylære bestanddele, der kan målrettes udover kinesin-5-hæmmere til forbedring af deres effektivitet i kræftbehandling [27, 39] .

for at løse dette problem, i den aktuelle undersøgelse undersøgte vi følsomhed over for monastrol og forekomst af mitotisk skred i flere humane cellelinjer. Vi fandt, at der er en korrelation mellem følsomheden af ​​en bestemt cellelinje til monastrol og tendensen af ​​den samme celle-linie til at undergå mitotisk glidning. Gennemgået yderligere ekspressionen af ​​survivin, et anti-apoptotisk kromosomale passager protein, der er blevet påvist at have flere mitotiske roller (gennemgået i [40-43]). Vi fandt, at behandling med monastrol inducerer stigning i ekspression af survivin i monastrol-resistente celler, men ikke i celler, der er monastrol-følsomme. Konsekvent, viser vi, at overekspression af survivin i monastrol-sensitive celler reducerede mitotisk skred og øget monastrol-resistens. Endelig viser vi, at en delvis dæmpning af survivin udtryk ved Si-RNA reducerer cellernes levedygtighed efter kort udsættelse for monastrol. Således er vores data tyder på, at kombinerede hæmning af HsEg5 og modulering af survivin udtryk kan forbedre styrken af ​​anticancer behandling af kinesin-5-hæmmere.

Materialer og metoder

Cell kultur, levedygtighed, transfektion, og monastrol behandling

AGS og LoVo celler blev dyrket i DMEM /F-12 (HAM) 1: 1, HT29-celler i DMEM, DU145 celler i RPMI 1640 suppleret med 1% natriumpyruvat og HepG2-celler i MEM -Eagle Earles medium. Alle medier blev suppleret med 10% føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin og 1% antibiotisk-antimykotisk opløsning indeholdende 10 enheder /pl penicillin, 10 pg /pl streptomycin og 1250 enheder /ml nystatin. Medier reagenser blev indkøbt fra Beit Haemek, Israel. Cellelevedygtighed blev undersøgt under anvendelse natrium 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilid salt (XTT, Sigma, Israel) efter en standardprocedure [44] eller ved trypanblåt assay [30]. For levedygtighed eksperimenter, op til 3-dage ved hjælp af XTT-assay, ~ 4×10

3-celler blev udpladet pr brønd i 96-brønds plader. Antallet af celler i nærvær af monastrol blev normaliseret til antallet af celler i nærvær af DMSO alene. For forsøg med 12 og 24 monastrol behandling, ~ 1,5×10

5 celler per brønd blev udpladet i plader med 24 brønde. Behandling med monastrol blev udført 24 timer efter udpladning, på hvilket tidspunkt 70-80% konfluens blev opnået. Plasmider, der udtrykker GFP-mærket survivin og GFP-vektoren kun var en gave fra Dr. Dario C. Altieri [45]. Celletransfektion blev udført under anvendelse af JetPEI transfektionsreagens (POLYPLUS transfektion, Tal Ron, Israel). Stabil transfektion blev opnået ved dyrkning af celler i medium indeholdende G418 3 mg /ml (Sigma, Israel) i flere uger, indtil 80% af cellerne indeholdt GFP-fluorescens-signal. koncentrationer Monastrol (Tocris, UK) er angivet for hvert forsøg. Til sammenligning mellem monastrol-sensitive AGS og monastrol-resistente HT29-celler blev forskellige koncentrationer af monastrol anvendes til at opnå sammenlignelige fænotyper: 100 um og 150 um af monastrol for AGS og HT29-celler, hhv. Baseret på figur 1, ville lav koncentration af monastrol have resulteret i manglende virkning på HT29-celler, mens høj koncentration af monastrol ville have resulteret i dødsfald af AGS celler, begge tilfælde ikke tillader analyse af fænotypen. Kontrol blev udført i tilstedeværelse af DMSO.

Celler fra AGS, HepG2, Lovo39, DU145, og HT29 cellelinjer, angivet i nederste venstre hjørne af hvert panel, blev inkuberet i op til tre dage med forskellige koncentrationer af monastrol, angivet til højre (0, 20, 50, 100, og 150 um). Antallet af levedygtige celler (% af kontrol) blev bestemt ved XTT-assay for mitokondriel aktivitet. Points og søjler repræsenterer et gennemsnit og SEM for 3-4 uafhængige forsøg. * P 0,05: antallet af levedygtige DU145 celler efter 2 dages behandling med 20 eller 50 uM monastrol, sammenlignet med levedygtige HT29-celler identisk behandlede (rød og blå cirkler). Resultaterne viser, at de forskellige cellelinjer er forskelligt følsomme over monastrol, med følsomhed ranking: AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29

Immunfarvning

For at visualisere mikrotubuluscytoskelettet. og DNA blev celler dyrket på dækglas, fikseret med 4% paraformaldehyd i 30 minutter, og permeabiliseret i 2 minutter med 0,3% Triton-X-100 i 4% paraformaldehyd. Prøver blev vasket med PBS indeholdende 0,1% BSA (Sigma, Israel). Dækglas blev inkuberet med rotte-anti-tubulin YOL1 /34 og derefter med Alexa 488 konjugeret anti-rotte-sekundært antistof. DNA blev farvet med DAPI (0,07 ug /ml). Celler blev observeret med et Olympus BX51 mikroskop.

Cell cyklus analyse

Svævende og vedhæftende celler blev fikseret med 70% ethanol og opbevaret i -20 ° C i mindst 7 dage. Cellerne blev opsamlet ved centrifugering og resuspenderet i 0,1% Triton-X-100 og 30 ug /ml RNase A type I-A (Sigma, Israel) ved stuetemperatur i 40 min. Nuclear-DNA blev farvet med 15 ug propidiumiodid i PBS-opløsning og DNA-indhold blev målt ved flowcytometri (BD Biosciences, UK). Cell proportioner i sub-G0 /G1, G0 /G1, S og G2 /M faser blev analyseret ved hjælp af passende software. For hver prøve blev 10.000 celler scoret.

mRNA analyse

Niveauer af cyclin B, survivin, og actin som reference gen blev bestemt ved real time PCR (RT-PCR) af total RNA ekstraheret fra celler behandlet med monastrol. Total RNA-ekstraktion blev udført med RNeasy mini kit (Qiagen, Tyskland), med DNAse (Qiagen, Tyskland) behandling for at sikre fjernelse af genomisk DNA. CDNA template blev fremstillet med 1 ug RNA-prøver ved anvendelse af Verso cDNA Synthesis Kit, som beskrevet af producenten (Thermo Scientific). For kvantitativ real time PCR blev templates fortyndet 1:16 og udsat for Taqman real time PCR procedure ved hjælp af absolutte Blå QPCR kit (Thermo Scientific). Primere og prober (Solaris) til PCR-amplifikation og produktstørrelse var som følger: survivin (95 bp) fremadrettet primer 5′-TTTCTCAAGGACCACCGCAT-3 ‘, revers primer 5′-ATGAAGCCAGCCTCGGCCAT-3′, probe 5’-CACCCCGGAGCGGATGG-3 ‘; Cyclin B (86 bp) fremadrettet primer 5’-ATCTGAGACAACTTGAGGAAG-3 ‘, revers primer 5′-GATGGCTCTCATGTTTCCAG-3′, probe 5’-GGTCGGGAAGTCACTGG-3 ‘; Actin (134 bp) fremadrettet primer 5’-TGGAGAAAATCTGGCACCAC-3 ‘, revers primer 5′-GGTCTCAAACATGATCTGG-3′, probe 5’-ACCGCGAGAAGATGACC-3 ‘. Reaktioner blev udført i ABI-PRISM7500 sekvens detektor (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland). Standard cykelforhold for dette instrument blev brugt. Annealingstemperatur var 60 ° C i alle generne. For hver prøve blev niveauerne af cyclin B og survivin normaliseret til referencen genet (actin) niveauer. Real-time PCR-resultater repræsenterer et gennemsnit af tre forskellige eksperimenter

Protein niveau analyse blev udført under anvendelse af Western blot (WB) fremgangsmåde som tidligere beskrevet [30], ved anvendelse af anti human survivin antistof (R monastrol blev anvendt 24 efter plating. Celler blev transficeret med siSurvivin eller en kodet (SC) siRNA konstrukt (40nM, Sigma-Aldrich), blev siRNA transfektion udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens ifølge producentens protokol. Målsekvensen af ​​survivin for siRNA var: 5’GGACCACCGCAUCUCUACA 3′- eller krypteret 5’GCCCAGAUCCCUGUACGU 3 ‘. 12T og 24 efter transfektion celler blev talt under anvendelse trypanblå.

Statistisk analyse

Kolonner og barer i alle figurer repræsenterer gennemsnit ± SEM. Betydningen af ​​forskellene mellem de midlede værdier blev bestemt ved anvendelse af Students

t

-test. * P 0,05; ** P 0,01

Resultater

For at undersøge de faktorer, der påvirker følsomheden af ​​forskellige celler til monastrol, vi først karakteriseret denne følsomhed i fem forskellige cellelinier:. AGS fra mave adenocarcinom [46 ], HepG2 fra hepatocellulært carcinom [47], LoVo fra colonadenocarcinom [48], Du154 fra prostatacarcinom [49], og HT29 fra colon adenocarcinom [50]. Celler blev udsat for langvarig behandling med monastrol på op til tre dage. Ved hvert tidsinterval blev antallet af levedygtige celler undersøgt ved mitokondrie aktivitetsassay under anvendelse 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilid salt (XTT) [44 ]. Vores resultater viser, at som forventet, at antallet af levedygtige celler faldt efter langvarig behandling med monastrol i alle cellelinjer. Men andelen af ​​levedygtige celler i de forskellige cellelinier efter behandling med monastrol varieret. For eksempel behandling med 100 uM af monastrol i to dage resulterede i ~ 80% fald i antallet af AGS og HepG2-celler, ~ 60% fald i antallet af LoVo-celler, og kun ~ 30% fald i DU145 og HT29-celler (figur 1, grønne cirkler). Vi fandt også en lille, men reproducerbar forskel mellem levedygtighed DU145 og HT29-celler behandlet med monastrol. For eksempel: procentdelen af ​​levedygtige DU145 celler behandlet med 20 eller 50 uM monastrol i 2 dage er betydeligt mindre end de identisk behandlede HT29-celler. Baseret på levedygtighed data (Fig 1), vi etableret rang af følsomhed over for monastrol, fra mest følsomme over for mindst følsomme, som:. AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29

Mitotisk skridning er et fænomen, som der i nærvær af mitotisk skader, celler fortsætte til G1-fasen af ​​den næste cyklus uden at dividere deres DNA [31, 33, 34, 51]. Vi undersøgte dernæst, om modstanden i en bestemt cellelinie til monastrol er relateret til dets tendens til at undergå mitotisk glidning i nærvær af lægemidlet. Til karakterisering mitotisk glidning, behandlede vi cellerne med monastrol i 48 timer ved koncentrationer, der resulterede i mindst celleoverlevelse og undersøgt morfologien af ​​mikrotubuluscytoskelettet ved immunofarvning (Fig 2A og 2B) og celle-cyklus fordelingen ved flowcytometri (fig 2C). Celler standset i mitose ved monastrol er tidligere blevet vist at udvise monoastral spindler [24, 30]. Vi fandt, at efter 48h monastrol behandling to morfologier af celler var tydelige: G1-lignende eller monoastral mitotiske celler (fig 2A). Antallet af normale mitotiske celler eller celler med uidentificerede morfologier var ubetydelig. Vores resultater viser, at efter 48h behandling med monastrol, de forskellige cellelinjer udviste forskellige procentdele af celler med monoasters. For eksempel er størstedelen af ​​overlevende AGS-celler viste sig som G1-lignende store celler med enkelt kerner (fig 2A). Procentdelen af ​​monoasters i disse celler var meget lille, ~ 7% (figur 2B). Vi fandt, at både AGS og HepG2 cellelinier, som er følsomme over monastrol, udviste en lille procentdel af monoasters ( 10%) og en stor procentdel af G1-lignende celler, efter 48h monastrol behandling (Fig 2B). På den anden side, LoVo, DU145, og HT29 cellelinier, som er mere modstandsdygtige over for monastrol, udviser betydeligt større procentdele, 20-30%, af monoastral spindler (fig 2B), hvilket indikerer, at et stort antal af disse celler standset i mitose. Analyse af cellecyklus-fasefordeling afslørede, at efter 48h behandling med monastrol, til trods for forskellen i andelen af ​​mitotiske celler med monoasters, alle undersøgte cellelinjer indeholdt en stor procentdel af celler med dobbelt DNA-indhold (fig 2C, dobbeltpil ). Dette indikerer, at selv om nogle af cellerne optrådte med den typiske G1-lignende mikrotubuluscytoskelettet, havde cellerne fordoblet DNA-indhold, dvs. de undergik mitotisk glidning uden DNA division. Vores resultater foreslår derfor, at der er en sammenhæng mellem følsomhed over for monastrol og tendensen til at undergå mitotisk skred:. Monastrol-resistente celler holder mitosestandsning i længere tid, mens monastrol-sensitive celler undergår mitose skred

(A ) AGS og HT29-celler blev behandlet i 48 timer med 100 uM og 150 um af monastrol hhv. Tubulin cytoskelet blev visualiseret efter fiksering ved immunfarvning blev DNA farvet med DAPI. Efter 48h af monastrol behandling, at størstedelen af ​​AGS-celler viste sig som store, G1-lignende celler med en kerne (gule pile), medens en høj procentdel af HT29-celler blev standset i mitose som monoasters (grønne pile). (B) Effekt af langvarig behandling med monastrol på procentdel af monoasters i de forskellige cellelinjer, angivet i bunden. Celler blev behandlet med monastrol, forarbejdet til immunfarvning, og procentdelen af ​​monoasters blev bestemt ved scoring 200-300 celler for hver cellelinje. Kolonner og barer repræsenterer gennemsnit og SEM af 3 uafhængige forsøg, * P 0,05, sammenlignet med AGS celler. (C) Fordeling af celle-cyklus faser blev bestemt ved flowcytometri i fravær (kontrol) eller tilstedeværelse af monastrol. Cellelinjer angives øverst. Enkelt og dobbelt pile repræsenterer toppe med 2n og 4n DNA-indhold, henholdsvis.

Nedregulering af anti-apoptotiske protein survivin blev tidligere vist at øge mitotisk skred i overværelse af spindel skader [52] . Vi hypotese således, at under udsættelse for monastrol, vil udtryk for survivin variere mellem monastrol følsomme og resistente celler. For at teste denne hypotese, vi sammenlignet mRNA og protein niveauer af survivin i monastrol-resistent HT29 celler og monastrol-sensitive AGS celler (Fig 3). For at tillade målingen af ​​ændringer i proteinniveau før apoptose [30], vi behandlede celler med monastrol for kortere tider, 12h og 24h. For at vurdere den mitotiske status af de undersøgte celler fulgte vi mRNA (Fig 3A) og protein (figur 3B og 3C) niveauer af det mitotiske protein cyclin B. Vi fandt, at efter 24 h behandling med monastrol HT29-celler udviser forhøjede niveauer af cyclin B sammenlignet til 12 timer af behandlingen, hvilket indikerer, at de er standset i mitose (figur 3). På den anden side, i AGS celler, cyclin B-niveauer blev allerede øget ved 12 h behandling med monastrol og cyclin B-niveauer udviste en tendens til at falde ved 24 h, 0,05 P 0,1 (figur 3). Dette tyder på, at behandling med monastrol for 24 timer allerede forårsager delvis mitotisk skred i AGS celler, mens de HT29-celler opretholder mitosestandsning. Undersøgelse af survivin mRNA (Fig 3A) og protein (figur 3B og 3C) niveauer afslørede, at cellernes niveauer af survivin i HT29 steget 24h behandling med monastrol, hvilket antyder at survivin er involveret i at opretholde mitosestandsning. På den anden side, i AGS celler mRNA niveauer af survivin forblev uændret på 24 i forhold til 12 h behandling med monastrol. I øvrigt i det AGS celler, gennemsnitlige proteinniveauer af survivin var lavere ved 24 timer sammenlignet med 12 timer for monastrol behandling, skønt denne forskel ikke nåede statistisk signifikans (Fig 3B og 3C, højre panel). Disse resultater antyder, at forhøjede niveauer af survivin i en bestemt cellelinje er korreleret med modstanden i denne celle-linie til monastrol behandling.

HT29 og AGS celler blev behandlet med monastrol i 12 h og 24 h og bearbejdet til mRNA analyse af RT-PCR (A) og proteinniveau analyse af WB (B og C). 150 um og 100 uM monastrol blev anvendt til HT29 og AGS celler. I A og C, søjler og bjælker repræsenterer gennemsnit og SEM-værdier for 3-4 uafhængige forsøg. I hvert forsøg niveauer af cyclin B (til venstre) og survivin (højre), angivet øverst, i nærvær af monastrol blev normaliseret til kontrolværdierne opnået med DMSO alene. * P 0,05; ** P 0,01; a-0,05 P 0,1 sammenlignet med 12 timer for monastrol behandling. (B) repræsentant WB analyse af cyclin B og survivin proteinekspression i AGS (venstre) og HT29 (højre) celler behandlet med monastrol i 12 timer og 24 timer, der vises nederst. Lig protein loading var følge af ekspression af actin (lavere paneler). (+) Monastrol; (-) DMSO

For at undersøge, om forhøjede ekspressionsniveauer af survivin direkte opretholde vedvarende mitosestandsning, vi transficeret de monastrol-følsomme AGS celler med et plasmid, der koder for vildtype survivin protein fusioneret til GFP (. pSurvivin, [45]), og skabte en poly-klonale stabilt transficeret AGS cellelinje (se Materialer og fremgangsmåder). GFP-udtrykkende vektor blev anvendt som kontrol. AGS celler, der udtrykker pSurvivin plasmidet udviste 5,2 ± 0,9 (SEM, n = 4) fold stigning i survivin ekspression (fig 4A, nederst). Efter genereringen af ​​stabilt-transficerede cellelinier, blev celler behandlet med 100 pM monastrol og bearbejdet til tubulin immunfarvning, levedygtighed, og cellecyklus-fordelingen analyse (Fig 4A-4D). Vi fandt, at der efter 24 h behandling med monastrol, procentdelen af ​​mitotiske celler standset med monoasters steget betydeligt i survivin-udtrykkende celler sammenlignet med AGS celler, der udtrykker vektoren alene (Fig 4A og 4B). Disse data indikerer, at overekspression af survivin øger evnen af ​​AGS celler at opretholde mitosestandsning i nærvær af spindlen er beskadiget af monastrol. Analyse af cellecyklus-fasefordeling viser, at efter 12 h behandling med monastrol, procentdelen af ​​survivin-udtrykkende AGS celler med dobbelt (4n) DNA-indhold signifikant forøget sammenlignet med celler kun udtrykker vektoren (fig 4C, 12H), hvilket indikerer, at survivin inducerer vedvarende mitosestandsning. Vigtigere, efter 24h behandling med monastrol fandt vi ingen forskel i procentdelen af ​​cellepopulation med 4n DNA-indhold mellem celler, der udtrykker survivin og dem, der udtrykker vektoren alene (figur 4C, 24h). Men efter 24 h behandling med monastrol, var der en signifikant stigning i antallet af celler med monoasters i survivin-udtrykkende celler, hvilket indikerer cellerne er i mitosestandsning, sammenlignet med celler kun udtrykker vektor, som undergik mitotisk slip og var bestemt til celle død (fig 4A og 4B). Således er vores data viser, at i fravær af survivin overekspression, AGS celler undergår mitotisk glidning og celledød efter behandling med monastrol, mens overekspression af survivin inducerer mitosestandsning, sandsynligvis redning cellerne. Desuden overensstemmelse med den foreslåede anti-apoptotiske funktion survivin [45, 53], fandt vi, at overekspression af survivin i AGS celler forøgede levedygtighed af disse celler efter 24 timer og 48 timer behandling med monastrol (Fig 4C).

(a-D) AGS celler blev stabilt transficeret med et plasmid, der udtrykker GFP (vektor) eller et plasmid, der koder for overekspression af survivin-GFP (pSurvivin). Celler blev behandlet med 100 pM monastrol og bearbejdet til mikrotubulus immunfarvning (A og B), celle-cyklus fordelingen analyse (C), og levedygtighed (D). (A) Repræsentative billeder af mikrotubuluscytoskelettet i AGS celler, der bærer en tom vektor eller pSurvivin, angivet ved bunden. Celler blev behandlet med 100 pM monastrol i 24 timer. G1-lignende celler (gule pile) og mitotiske celler (grøn pil) overholdes. Da de mitotiske celler er runde, deres fokalplan er forskellig fra den af ​​de flade G1-lignende celler. Billeder i (A) er fokuseret på G1 celler og derfor monoasters i mitose ikke ses i disse billeder. Følgelig mitotiske celler vises som lyse sfærer (grønne pile). Nederst: survivin WB analyse af prolifererende AGS celler i nærvær (+) eller fravær (-) af pSurvivin overekspression plasmid. (B) Kvantificering af% af mitotiske celler baseret på billeder, såsom vist i (A). kun Gray-vektor; blå-pSurvivin. Kolonner og barer repræsenterer gennemsnit og SEM for tre uafhængige forsøg, hvor i alt 200-300 celler blev talt. ** P 0,01, sammenlignet med vektor alene. (C) Stabilt-transficerede AGS-celler blev behandlet med monastrol i 12 h og 24 h (angivet øverst) og behandlet til cellecyklus-fasefordeling analyse ved flowcytometri. Enkelt og dobbelt pile repræsenterer toppe med 2n og 4n DNA-indhold, hhv. Tal i parentes angiver procentdelen af ​​celler med dobbelt (4n) DNA-indhold. (D) Levedygtighed af stabilt transficerede celler i nærvær af 100 pM monastrol i 24 timer og 48 timer. kun Gray-vektor; Blue-pSurvivin. Antallet af levedygtige celler blev bestemt ved XTT-assay for mitokondriel aktivitet. Procent af levedygtige celler blev beregnet i forhold til kontrol eksperimenter med DMSO alene. Kolonner og barer repræsenterer gennemsnit og SEM af 3 uafhængige forsøg. * P 0,05, sammenlignet med vektor alene. (E) AGS og HT29-celler blev transient transficeret med survivin (mørkegrøn) eller krypteret (SC, lysegrøn) Si RNA-sekvens. 12h efter transfektion AGS og HT29-celler blev behandlet med 100 og 150 um monastrol henholdsvis i 12 h og 24 h (vises nederst). Cellernes levedygtighed blev bestemt ved trypanblåt. Procent af levedygtige celler blev beregnet i forhold til kontrol eksperimenter med DMSO alene. Kolonner og bjælker repræsenterer gennemsnittet og SEM for 2-4 uafhængige forsøg foruddannede i triplikater. * P 0,05; ** P 0,01; en-0,05 P. 0,1, sammenlignet med røræg Si RNA-sekvensen

For yderligere at undersøge sammenhængen mellem cellernes levedygtighed under monastrol behandling og udtryk survivin, vi delvist tavshed survivin udtryk ved Si RNA ( fig 4E). Scrambled RNA-sekvens tjente som kontrol. Undersøgelse af mRNA-niveauer af survivin ved RT-PCR bekræftede, at mens transient transfektion af krypterede RNA-sekvens forårsagede ingen ændring i mRNA-niveauer af survivin, transfektion med survivin Si RNA forårsaget ~ 70% og 50-60% fald i survivin mRNA-niveauer i AGS og HT29-celler, henholdsvis (ikke vist). Vi fandt, at efter 12 timer for udsættelse for monastrol, delvis inaktivering af survivin ekspression forårsagede et fald i levedygtighed AGS og HT29-celler med 50-60%, sammenlignet med celler transficeret med krypterede RNA-sekvens (Fig 4E). Mens monastrol-sensitive AGS celler viste kun en tendens (0,05 P 0,1), viste monastrol-resistente HT29-celler en klart signifikant fald i levedygtighed efter delvis overlevende silencing (P 0,05), hvilket indikerer, at survivin kræves for levedygtighed og modstand mod monastrol. Efter 24 timer af behandlingen med monastrol blev levedygtigheden af ​​monastrol-sensitive AGS celler yderligere reduceret i celler transficeret med survivin Si eller krypteret RNA (Fig 4E). I monastrol-resistente HT29-celler, delvis inaktivering af survivin ekspression induceret en forøget levedygtighed sammenlignet med den krypterede RNA-sekvens, hvilket indikerer, at der er tilpasningsmekanismer i disse celler til delvis reducerede niveauer af survivin. Tilsammen indikerer vore data, at stigende niveauer af survivin under mitosestandsning er knyttet til cellelevedygtighed, som er i det mindste delvist relateret til dets evne til at inducere langvarig mitosestandsning under behandling med monastrol.

Diskussion

Undersøgelser i det seneste årti har vist, at når celler behandles med anti-mitotiske lægemidler, såsom kinesin-5 specifikke hæmmere, kan to vigtigste scenarier forekomme: celler kan enten fastholde mitosestandsning og dø ved mitotisk apoptose [30, 31], eller gå videre til næste G1 fase af mitotisk skred og undergår apoptose [33, 34]. I sidstnævnte tilfælde, celler dør hurtigt af apoptose forårsaget af “tetraploidy kontrolpunkt” [33, 35]. Med dette scenario vil celler, der undergår mitotisk skridning lettere i nærvær af monastrol underkastes apoptose induceret af tetraploidy checkpoint og således være mere følsomme over for monastrol. Imidlertid blev tetraploidy checkpoint fundet at være afhængig af tumor suppressor protein p53 [51, 54]. Således er celler forventes at være mere følsomme over for monastrol hvis de undergår mitotisk skridning og udtrykke et vildtype-p53. Faktisk de cellelinjer undersøgt i denne undersøgelse udtrykker begge versioner af p53-proteinet: p53 er vildtype i AGS [55], HepG2 [56], og LoVo [57] cellelinjer, mens den er muteret i HT29 [58] og DU145 [49] celler. Vores konklusion, rang af følsomhed over for monastrol er AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29 støtter tanken om, at cellerne bliver mere følsomme over for kinesin-5-hæmmere, hvis de har tendens til at undergå mitotisk glidning og bære vildtype p53 allel. Tendensen til at undergå mitotisk glidning i sig selv ikke direkte afhængig af p53 status siden de LoVo celler, som bærer WT p53 [57] underkastes mitotisk glidning i samme grad som den HT29 og Du125 celler, som bærer et muteret p53 [49, 58 ] (fig 2B og 2C). Ikke desto mindre, øget celledød opstår i LoVo celler, når WT p53 tillader aktivering af “tetraploidy checkpoint”.

Når mitotisk skred forekommer i p53 muterede celler, celler fortsætte med spredning uden korrekt dividere DNA.

In vivo

, dette kan resultere i ophobning af mutationer, der reducerer cytotoksisk /anti-cancer aktivitet af kinesin-5-hæmmere [22, 27, 39]. Således er en af ​​de strategier for at øge effektiviteten af ​​anti-mitotiske anticancerlægemidler kan være at inducere langvarig mitosestandsning i cancere, der udtrykker muterede versioner af p53.