PLoS ONE: Foxp3 + lymfocyt Density i kræft i bugspytkirtlen korrelerer med lymfeknuder Metastasis

Abstrakt

Målsætning

For at afgøre, om tætheden af ​​foxp3

+ lymfocytter i primære tumorer og lymfeknuder i bugspytkirtelkræft korrelerer med tilstedeværelsen af ​​lymfeknudemetastaser.

Metoder

foxp3

+ lymfocyt densitet i primær kræft i bugspytkirtlen væv og drænende lymfeknuder blev målt under anvendelse immunohistokemi. Vi analyserede de kliniske og patologiske aspekter i forbindelse med ophobning af foxp3

+ lymfocytter i bugspytkirtelkræft. Vi analyserede også korrelationen af ​​tætheden af ​​foxp3

+ lymfocytter i lymfeknuder med nodal status og afstand fra den primære tumor.

Resultater

Foxp3

+ lymfocyt tæthed i bugspytkirtlen kræft var betydeligt højere end i paratumoral pancreas væv. Densiteten af ​​foxp3

+ lymfocytter i lokal tumorvæv korrelerede signifikant med den histologiske grad og samlet lymfeknude-status. Endvidere Foxp3

+ lymfocyt massefylde var signifikant højere i positive lymfeknuder end i negative, mens det havde ingen korrelation med afstanden af ​​lymfeknuderne fra den primære tumor.

Konklusion

foxp3

+ lymfocyt densitet i primær tumor væv hos patienter med kræft i bugspytkirtlen korrelerer med lymfeknude-metastase. Lymfeknuder indeholder metastaser har højere Foxp3

+ lymfocyt tætheder end gøre negative lymfeknuder

Henvisning:. Jiang Y, Du Z, Yang F, Di Y, Li J, Zhou Z, et al. (2014) Foxp3

+ lymfocyt Density i kræft i bugspytkirtlen korrelerer med lymfeknudemetastase. PLoS ONE 9 (9): e106741. doi: 10,1371 /journal.pone.0106741

Redaktør: Valli De Re, Centro di riferimento Oncologico, IRCCS National Cancer Institute, Italien

Modtaget: November 25, 2013; Accepteret: August 9, 2014; Udgivet: September 5, 2014

Copyright: © 2014 Jiang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Shanghai Municipal Natural Science Foundation (11ZR1405500) og tilskud fra Shanghai Municipal Videnskab og Teknologi Kommissionen (13140902401). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

pancreas duktalt adenokarcinom, almindeligvis kendt som kræft i bugspytkirtlen, er blandt de mest aggressive af menneskelige maligniteter. Radikal kirurgisk resektion af lokaliseret sygdom giver en lille chance for helbredelse; er det imidlertid sjældent indiceret på grund større vaskulær invasion og /eller fjernmetastaser ofte opdages ved diagnose. Selv når kirurgisk resektion er mulig, metastaser og tilbagefald er særligt fremtrædende i bugspytkirtelkræft [1].

Meget af den traditionelle fokus på kræftforskning har involveret studere genotypiske og fænotypiske forandringer, der ligger til grund for kræft udvikling, progression, og metastase. I modsætning til disse celle-autonome aspekter af solide tumorer, er igangværende undersøgelser kaste lys over andre kritiske elementer i tumor mikromiljø [2]. Baseret på disse undersøgelser, bliver det klart, at immunceller og deres associerede cytokiner er vigtige elementer i tumormikromiljøet af pancreascancer [3]. Regulatoriske T-celler (Treg), som oprindeligt blev fastlagt i forbindelse med autoimmune sygdomme og er kendt for at undertrykke T-celle-medierede immunreaktioner, er nu menes at spille en afgørende rolle i at hindre immun overvågning mod kræft og hæmmer udviklingen af ​​effektiv antitumor immunitet. Det blev rapporteret, Treg steg i det perifere blod, tumor mikromiljø og ascites i forskellige maligniteter og synes at interferere med flere aspekter af antitumor-immunitet [4] -. [7]

I pancreas kræftpatienter, det er veldokumenteret, at forekomsten af ​​treg både perifert blod og tumor mikromiljøer er forhøjet, og at treg infiltration korrelerer direkte med tumor patologisk stadium og prognose [8] – [12]. Vi har for nylig bekræftet, at kræft i bugspytkirtlen er infiltreret af Foxp3

+ formodet Treg, og dette tjente som en potentiel forklaring på den ringe overlevelse af patienter til trods for den høje forekomst af CD8

+ T-celler [13]. I denne undersøgelse, vi også brugt flowcytometri at bekræfte, at Foxp3

+ celler var også CD3

+ CD4

+ CD25

+ CD127

– og dermed styrke forslaget om, at Foxp3 kan tjene som en nyttig markør for treg i bugspytkirtelkræft

tilstedeværelsen eller fraværet af lymfeknudemetastaser er den stærkeste indikator for resultater efter kirurgisk resektion af kræft i bugspytkirtlen.; imidlertid kun lidt om forholdet mellem Treg infiltration af kræft i bugspytkirtlen og lymfeknudemetastase. Derfor testede vi den hypotese, at forhøjede niveauer af foxp3 immunfarvning i primære tumorer og regionale lymfeknuder ville forudsige tilstedeværelsen af ​​lymfeknudemetastaser i bugspytkirtelkræft.

Patienter og metoder

Patienter

i denne undersøgelse vi samlet de kliniske og patologiske data fra 50 patienter, som gennemgik radikale resektion for duktalt adenokarcinom i pancreas hoved fra april 2005 og december 2008 kl Huashan Hospital, Fudan University. Patienter med tidligere autoimmun sygdom og kronisk /akut infektion, og dem, der havde fået strålebehandling eller kemoterapi før deres operation blev udelukket. Nomenklaturen af ​​de hentede lymfeknuder og den patologiske iscenesættelse var baseret på den

Second engelsk udgave af klassificering af pancreas karcinom

foreslået af den japanske Pancreas Society (JPS) [14]. De drænende lymfeknuder fra den første, anden og tredje gruppe omtales N1, N2 og N3, henholdsvis. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai, Kina (NO. 2.012.215). Patientjournaler blev anonymiseret og anonymiseres før analyse.

Immunhistokemi

Vi gennemgik hæmatoxylin-eosin-farvede sektioner af pancreas tumor og paratumoral (tilstødende ikke-neoplastisk bugspytkirtlen parenchym) væv, og stikprøven lymfeknuder, fra patienter med histologisk bekræftet pancreas duktalt adenokarcinom. De tilsvarende formalinfikserede, paraffinindlejrede væv blev opsamlet, og 5-um tykke snit blev fremstillet. Immunhistokemisk farvning af foxp3 blev udført under anvendelse af avidin-biotin kompleks peberrodsperoxidasekonjugeret metode. Kort fortalt blev paraffinsnit først afparaffiniseret og hydreret, og derefter udsat for en varmeinduceret antigen hentning trin (EDTA ved pH 7,8). Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret, og de slides inkuberes i 0,3% H

2O

2. De ikke-specifikke bindingssteder blev blokeret med Protein Block (RE7102; Novocastra). Objektglassene blev derefter inkuberet med primære monoklonale antistoffer mod Foxp3 protein (klon ab10563, 1:50; ABCAM). De bundne sekundære antistoffer blev visualiseret med diaminobenzidin (Dako) og modfarvet med Harris hematoxylin. Negativ kontrol farvning blev udført med det primære antistof udeladt.

Foxp3

+ lymfocyt tælling

Hver sektion blev evalueret uafhængigt af to patologer (Du ZG, Zhou ZW), der var blindet til patienternes kliniske og patologiske profiler. Celler positive for Foxp3 blev talt i fem tilfældigt udvalgte områder under stor forstørrelse (× 400) (Olympus, Japan) og udtrykt som det gennemsnitlige antal positive celler pr high-power felt (/HP). Uoverensstemmelser mellem de to patologer blev revideret i fællesskab at nå frem til en konsensus.

Dataanalyse

Kontinuerlige variabler er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD), og kategoriske variable udtrykkes som frekvenser (% ). Pearson χ

2 og multiple logistiske regressioner blev anvendt til univariate og multivariate analyse. Samlet overlevelse blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. The Log-rank test og Cox proportionel risiko modeller blev anvendt til univariate og multivariate analyser af risikofaktorer for overlevelse, hhv. Alle p-værdier og 95% konfidensintervaller [CI] blev estimeret i en to-tailed mode. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikante ved P 0,05. Data blev analyseret ved hjælp af SAS-version 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

Resultater

Generelle data

Vi identificerede 50 patienter (29 mænd og 21 kvinder, median alder: 61 år; interval:. 20-79 år) med adenocarcinom i pancreas hoved, der undergik pancreaticoduodenectomy (n = 48) eller total pankreatektomi (n = 2). Ud over primære tumorer, vi analyserede i alt 157 lymfeknuder, med 70 lymfeknuder fra N1 (herunder 24 positive og 46 negative lymfeknuder fra de bageste og forreste aspekter af hovedet i bugspytkirtlen), 46 lymfeknuder fra N2 ( herunder 11 positive og 35 negative lymfeknuder fra områderne omkring øvre mesenteriske arterie eller hepatoduodenal ligament), og 41 lymfeknuder fra N3 (herunder 3 positive og 38 negative lymfeknuder fra området omkring den abdominale aorta).

Massefylde af foxp3

+ lymfocytter i tumor og paratumoral pancreas væv

i overensstemmelse med tidligere rapporter, foxp3

+ lymfocytter infiltreret de primære tumorer, og blev fundet spredt i hele de interstitielle områder af tumor ( Figur 1A B). Få Foxp3

+ lymfocytter blev observeret infiltrere paratumoral pancreasvæv (figur 1C 0,001, figur 1E).

immunhistokemisk farvning af foxp3

+ lymfocytter i bugspytkirtelkræft (A: lav forstørrelse, × 100; B: stor forstørrelse, × 400) og paratumoral pancreas væv (C: lav forstørrelse, × 100; D: stor forstørrelse, × 400): den foxp3

+ lymfocytter blev defineret som cellerne med brun-farvende kerner i mononukleære lymfocytter. (E) Forskelle i Foxp3

+ lymfocyt tæthed mellem kræft i bugspytkirtlen væv og paratumoral pancreas væv. (P 0,01).

Foxp3

+ lymfocyt tæthed korrelerede ikke med alder, køn eller T fase (herunder tumorstørrelse og den lokale infiltration) af kræft i bugspytkirtlen (tabel 1). Tætheden af ​​foxp3

+ lymfocytter var højere i tumorer med højere histologisk bedømmelse (godt differentieret: 1,3 ± 1,0 /HP; vs. moderat differentieret: 4,3 ± 4,5 /HP vs. dårligt /udifferentieret: 7,9 ± 7,8 /HP, s = 0,014). Densiteten af ​​foxp3

+ lymfocytter var signifikant højere i pancreascancer med lymfeknudemetastaser sammenlignet med dem uden lymfeknudemetastaser (6,7 ± 5,9 /HP vs. 2,3 ± 2,6 /HP, p = 0,002). Ligeledes var der en tendens i retning af højere tæthed af foxp3

+ lymfocytter i fremskreden fase bugspytkirtelkræft end tidlige fase sygdom. (I, II: 2,7 ± 3,1 vs. III, IV: 5.5 ± 5.6, p = 0,094).

massefylde foxp3

+ lymfocytter i drænende lymfeknuder

foxp3

+ -lymfocytter akkumuleret i positive lymfeknuder, primært omkring den metastatiske foci, ved en densitet signifikant højere end blev observeret i de negative lymfeknuder (66,2 ± 36,9 /HP vs. 48,1 ± 29,9 /HP, p = 0,003, figur 2A-E). Ingen signifikant forskel i tætheden af ​​foxp3

+ lymfocytter blev observeret i de forskellige lymfeknuder grupper for positiv (N1 vs N2 vs N3: 63,0 ± 2,7 /HP vs. 69,9 ± 37,0 /HP vs. 78,3 ± 75,2 /HP , p = 0,747, figur 2F) eller negative lymfeknuder (N1 vs N2 vs N3:. 50.4 ± 32,5 /HP vs. 50,0 ± 30,3 /HP vs. 43,4 ± 26,4 /HP, p = 0,516, figur 2G)

Immunhistokemisk farvning af foxp3

+ lymfocytter i en positiv lymfeknude (a: lav forstørrelse, × 40, B, høj forstørrelse, × 400) og en negativ lymfeknude (C: lav forstørrelse, × 40; D: stor forstørrelse, × 400), og en sammenligning af den foxp3

+ lymfocyt tætheder i positive og negative lymfeknuder (E) (p = 0,03), blandt forskellige grupper i positive lymfeknuder (F) (p = 0,75 ), og blandt forskellige grupper i negative lymfeknuder (G) (p = 0,52).

foxp3

+ lymfocyt infiltration af kræft i bugspytkirtlen tumor er en uafhængig risikofaktor for lymfeknude metastaser

lymfeknudemetastase er de vigtigste prognostiske indikatorer for resektable bugspytkirtelkræft. Medianen densitet Foxp3

+ lymfocytter (4 /HP) i hver tumor blev betragtet som cutoff-niveau og blev analyseret i forhold til patientens alder, køn, histologisk bedømmelse og T stadium af tumoren at identificere risikoen faktorer af lymfeknudemetastaser i bugspytkirtelkræft. Univariate og multivariate analyser bekræftede, at høj intratumoral tæthed af foxp3

+ lymfocytter er en selvstændig risikofaktor for nodal metastaser (tabel 2).

Den intratumoral tæthed af foxp3

+ lymfocytter tendens til at korrelerer med prognose efter radikal resektion

af de 50 patienter i vores undersøgelse, som gennemgik radikal resektion, opnåede vi overlevelse status og overlevelse tid til 47 patienter gennem ambulatorium eller telefon opfølgning. Den mediane follow-up tid var 21 måneder (4-87 måneder). I univariate analyse, både lymfeknude status og densiteten af ​​foxp3

+ lymfocytter i tumorerne korreleret med prognosen for pancreas cancer patienter efter radikal resektion (som vist i figur 3 og tabel 3). En multivariat analyse inkorporerer de to faktorer foreslog, at Foxp3

+ lymfocyt tæthed i tumor lover som en selvstændig prognostisk faktor, men dette ikke statistisk signifikans (p = 0,06)

Lymfeknude status. ( p = 0,03) (A) og tætheden af ​​foxp3

+ lymfocytter i bugspytkirtelkræft væv (p = 0,01) (B) var signifikant korreleret med prognosen af ​​pancreas hoved kræft efter radikal resektion.

diskussion

i denne undersøgelse har vi vurderet fordelingen af ​​foxp3

+ formodet treg i bugspytkirtelkræft primære tumorer og drænende lymfeknuder, og bestemt dets overensstemmelse med kritiske klinisk-patologiske træk. Som Foxp3 er den mest udbredte enkelt immunhistokemisk markør for Treg og har vist sig at have en vis prognostisk værdi, vi bekræftet, at Foxp3 akkumuleret i kernerne i små runde mononukleære lymfocytter, der var klart adskilt fra tumorceller [10] – [13] . Vigtigere er det, vores undersøgelse viste en ny sammenhæng mellem densiteten af ​​foxp3

+ lymfocytter i bugspytkirtelkræft og lymfeknudemetastase. Desuden har vi gjort romanen observation, at Foxp3 udtryk er højere i lymfeknuder, der indeholder pancreas cancer metastaser end i dem, der er negative for carcinoma

I overensstemmelse med tidligere undersøgelser [10] – [13]., Fandt vi, at tætheden af ​​foxp3

+ -lymfocytter i bugspytkirtelkræft korrelerede signifikant med den histologiske karakteren af ​​tumor, uanset patienternes alder, køn, tumorstørrelse eller lokal invasion. Forskelle i cellefænotype, chemokinekspression, metabolisme, oxidative status, og pH af tumormikromiljøet mellem forskellige histologiske kvaliteter af pancreascancer kan påvirke Foxp3

+ lymfocyt tæthed i tumorvæv; Men de præcise mekanismer kørsel treg infiltration af menneskelig bugspytkirtelkræft er endnu ikke belyst

lymfeknudemetastase er helt klart en vigtig begivenhed i fast tumorer patogenese, især kræft i bugspytkirtlen [15] – [18].. Som lymfeknuder er steder for antigenpræsentation og immunreaktion initiering, kan de tjene som tidlige barrierer, der forhindrer tumorcelle indtræden i det systemiske kredsløb [19]. Den lokale mikromiljø lymfeknuder er afgørende ved fastsættelsen løbet af efterfølgende immunresponser. Imidlertid har tidligere undersøgelser ikke påvist en sammenhæng mellem Foxp3 infiltration og nodal status. Hiraoka et al. [10] havde tidligere studeret både primær bugspytkirtlen kræftsvulster og lymfeknuder, men forskellen mellem vores fund og deres kan skyldes vores opregning af total Foxp3

+ celler snarere end forholdet mellem foxp3

+ til CD4

+ -celler. Vi antager, at det absolutte antal foxp3

+ formodede treg kan faktisk være mere relevant at bestemme virkninger på udviklende immunrespons anti-tumor.

I denne undersøgelse har vi analyseret 157 lymfeknuder fra de 50 patienter, og fundet signifikant højere tæthed af foxp3

+ lymfocytter i positive lymfeknuder sammenlignet med negative. Mens niveauer af Foxp3

+ lymfocytter i lymfeknuderne korrelerede med tilstedeværelsen eller fraværet af metastaser, blev dette ikke uafhængigt påvirket af afstanden af ​​lymfeknuder fra den primære kræft i bugspytkirtlen. Deng et al. [20] fandt lignende resultater i colorektal cancer, men dette ikke tidligere er blevet vist i bugspytkirtelkræft. Der er grundlæggende to mekanismer til at forklare vores resultater. Første, immuntolerance medieres af Foxp3

+ -lymfocytter kan bidrage til overlevelse og proliferation af tumorceller, der dræner til lymfeknuderne og i sidste ende danner foci, der er synlige under lysmikroskopi. Alternativt kan tilstedeværelsen af ​​tumorceller i lymfeknuder resultere i Foxp3

+ lymfocytter ophobning gennem migration, ekspansion, eller perifere omdannelse. Som vist i figur 2A og 2B, Foxp3

+ lymfocytter hovedsagelig akkumuleret i periferien af ​​metastatiske foci. Foxp3

+ lymfocytter ophobning i lymfeknuderne kan fremme tumor celle infiltration i det systemiske kredsløb og fremskynde udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen gennem hæmning af effektor T-celle funktion.

Den prognostiske værdi af måling Foxp3

+ T-celler i forskellige gastrointestinale cancere forbliver kontroversiel. I en nylig offentliggjort meta-analyse blev det vist, at tumor-infiltrerende Foxp3

+ T celler korrelerede med dårlig prognose i hepatocellulært carcinom og mavekræft, men god prognose i kolorektal cancer [21]. I indstillingen af ​​kræft i bugspytkirtlen, blev det påvist, at tumor-infiltrerende Foxp3

+ celle fungerer som negativ prognostisk faktor [10], [12], [22]. I vores undersøgelse, univariat analyse viste, at lymfeknude status og lokal tumor Foxp3

+ lymfocytter tæthed var prognostiske faktorer af kræft i bugspytkirtlen hos patienter efter radikal resektion. Ingen forskel i prognosen stratificeret med patologisk stadium blev set i de 50 patienter kræft i bugspytkirtlen. Efter factoring i lymfeknude status og lokal tumor tæthed af foxp3

+ lymfocytter, multivariat analyse viste sidstnævnte som kun at have borderline statistisk signifikans. I denne patient sæt, den lokale tumor Foxp3

+ lymfocytter densitet syntes at have større prognostiske værdi end selv nodal status.

Som konklusion bekræftede vi, at akkumuleringen af ​​foxp3

+ -lymfocytter i primære tumorvæv korrelerer med lymfeknudemetastaser i bugspytkirtelkræft. Vigtigt er det, vi viste ligeledes, at tilstedeværelsen af ​​foxp3

+ -lymfocytter i regionale lymfeknuder er forbundet med nodal metastaser, og at metastatiske lymfeknuder indeholde væsentligt flere Foxp3

+ celler end gøre negative lymfeknuder.