PLoS ONE: mikroRNA-145 Mål JA og STAT1 i Colon Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

MikroRNA’er (miRNA) er dukket op som vigtige gen regulatorer og indregnes som centrale aktører i tumorigenese. miR-145 er rapporteret at blive nedreguleret i flere kræftformer, men kendskab til sine mål i tyktarmskræft er fortsat begrænset.

Metode /vigtigste resultater

For at undersøge betydningen af ​​miR-145 i coloncancer, har vi ansat et mikroarray tilgang til at identificere mIR-145 mål. Baseret på frø websted berigelse analyser og fordomsfri ord analyser, vi fandt en signifikant berigelse af miRNA bindingssteder i 3′-utranslaterede regioner (UTR’er) af udskrifter nedreguleret på miRNA overekspression. Gene Ontology-analyse viste en overrepræsentation af gener involveret i celledød, cellulær vækst og proliferation, cellecyklus, genekspression og cancer. En række af de identificerede miRNA mål har tidligere været impliceret i cancer, herunder

YES

,

FSCN1

,

ADAM17

,

BIRC2

,

VANGL1

samt transskription faktor

STAT1

. Begge

YES

STAT1

blev verificeret som direkte miR-145 mål.

Konklusioner /Betydning

Undersøgelsen identificerer og validerer ny kræft-relevante direkte mål for miR-145 i tyktarmskræft celler og ret tilføjer vigtige mekanistisk forståelse af tumor-undertrykkende funktioner miR-145

Henvisning:. Gregersen LH, Jacobsen AB, Frankel LB, Wen J, Krogh A, Lund AH (2010) mikroRNA-145 Mål

YES

STAT1

i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 5 (1): e8836. doi: 10,1371 /journal.pone.0008836

Redaktør: Grzegorz Kudla, University of Edinburgh, England

Modtaget: 28 oktober, 2009; Accepteret: December 31, 2009; Udgivet: 21 Jan 2010

Copyright: © 2010 Gregersen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejde i forfatternes laboratorium er støttet af Europa-Kommissionen (EF) FP7 finansiering (ONCOMIRS, tilskudsaftale nummer 201102. Denne publikation afspejler kun forfatternes synspunkter. Provisionen er ikke ansvarlig for nogen brug, der måtte blive gjort af oplysningerne heri), Novo Nordisk Fonden, Lundbeckfonden, dansk Grundforskningsfond, det danske Medical Research Council, det danske Kræftens Bekæmpelse og dansk Højteknologifonden. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

I de senere år små ikke-kodende RNA er blevet anerkendt som vigtige gen regulatorer [1] – [4]. miRNA er en rigelig gruppe af endogene små ikke-kodende RNA’er, der fungerer som regulatorer af protein kodende gener gennem translationel undertrykkelse og /eller forringelse af deres mål mRNA’er [1]. Omfattende miRNA forskning har vist, at miRNA er involveret i reguleringen af ​​talrige vigtige cellulære funktioner, såsom metabolisme, celleproliferation, tumorigenese, apoptose, udvikling og differentiering [1], [3], [4]. For at regulere target mRNA modne miRNA er bundet til AGO proteiner og vejlede AGO-associerede RNA induceret tavshed kompleks (RISC) til mRNA-mål gennem ufuldkommen baseparring mellem miRNA og målet. Dette indebærer ofte perfekt base skrælle mellem 5′-enden af ​​miRNA streng og dens target, også betegnet frøet site. Bioinformatik analyser antyder, at hver miRNA kan styre hundredvis af målgener hos mennesker, og det er for nylig blevet rapporteret, at over 60% af protein-kodende gener er under selektivt pres for at opretholde parring med miRNA, hvilket indikerer, at miRNA har potentiale til at regulere de fleste protein koder gener [5].

Upassende udtryk for miRNA, som regulerer gener fungerer som enten tumor-undertrykkere eller onkogener i sidste ende kan føre til erhvervelse af kendetegnene for kræft, og dermed angive miRNA som både tumor-undertrykkere og onkogener [ ,,,0],3], [6], [7]. Specifikke ændringer i miRNA ekspressionsniveauer er forbundet med forskellige typer cancer [8] og et stort antal miRNA er lokaliseret i såkaldte cancerassocierede genomiske regioner, som ofte er udsat for ændringer i cancerceller [9]. Men i modsætning til det store antal miRNA, der er blevet identificeret i de sidste år, kun relativt få miRNA mål er blevet eksperimentelt valideret. I betragtning af den overvældende beviser for, at miRNA er vigtige regulatorer af tumorigenese [3], [6], identifikation af miRNA mål er nødvendig for at forstå den mekanistiske grundlag for inddragelse af miRNA i kræft.

MIR-145 har ofte blevet rapporteret som nedreguleret i cancere, herunder prostatacancer [10], [11], blærecancer [12], tyktarmskræft [13] – [18], ovariecancer [19], [20] samt B -celle maligniteter [21], [22], og det er blevet rapporteret, at den genomiske region, der koder mIR-145 er placeret i en skrøbelig websted ofte slettet i cancer [23]. Følgelig har MIR-145 overekspression blevet påvist at have en vækstinhiberende virkning [16], [17], [24], [25] og for at undertrykke forankringsuafhængig vækst [16]. Det er endvidere påvist, at MIR-145 ekspression induceres af p53 [16]. Her blev det rapporteret, at MIR-145 mål c-myc gennem ufuldkommen frø baseparring [16], og det blev foreslået, at p53-medieret nedregulering af c-Myc er, i det mindste delvist, skyldes den p53-medierede opregulering af MIR-145 . En anden undersøgelse fandt også en øget grad af miR-145 induceret af doxorubicin [26]. Men i stedet for en transkriptionel aktivering af MIR-145 fandtes det, at p53 aktiverer forarbejdning af primære MIR-145 transkripter i MIR-145 precursorer [26]. Dette fænomen var ikke kun begrænset til miR-145, men også anvendes på flere andre miRNA med kendt vækst undertrykkende funktioner, hvilket indikerer p53-medieret regulering af miRNA behandling som en måde at udøve sin tumor-undertrykkende funktion [26]. Ud over c-myc, har MIR-145 også blevet foreslået til at målrette den humane insulinreceptor substrat-1 (IRS-1) og type I insulin-lignende vækstfaktor-receptor (IGF-IR) i coloncancer [25], [ ,,,0],27]. Imidlertid blev specificiteten af ​​målet interaktion ikke bekræftet af mutationsanalyse af frø steder i nogen af ​​disse tilfælde.

Udtrykket niveau af miR-145 induceres under differentiering af humane embryonale stamceller og miR-145 overekspression har vist sig at forringe pluripotens i humane embryonale stamceller ved målretning af

OCT4

,

SOX2

KLF4 Hoteller, som er involveret i at opretholde selvfornyende kapacitet humane embryonale stamceller [28]. Denne rolle miR-145 som en inducer af differentiering i embryonale stamceller er i overensstemmelse med rollen som miR-145 som en repressor af væksten i kræftceller. En musemodel designet til at undersøge ekspressionsmønsteret for MIR-145 afslørede ekspression af MIR-145 i multipotente kardiale progenitorer og glatte muskelceller [29] og foreslog, at MIR-145 fremmer differentiering til glatte muskelceller [29]. en anden undersøgelse viste imidlertid, at mus der mangler miR-145 var levedygtig uden åbenlyse abnormiteter i glatte muskelceller differentiering [30], viser, at der findes yderligere initiativtagere til differentiering.

Tilsammen miR-145 ser ud til at have tumor-suppressor-funktioner ved overekspression i cancerceller og kan normalt spiller en rolle i differentieringsprocesser. Her har vi fokuseret på målet identifikation af miR-145 i tyktarmskræft, baseret på microarray udtryk profiler af celler, der overudtrykker miR-145. Gene Ontology analyser af MIR-145 responsive gener bekræfte regulering af gener involveret i celledød, cellecyklusregulering og cancer. Vi har identificeret en række miR-145 mål, der kunne være interessant i en kræft sammenhæng og kontrolleret, at miR-145 mål JA og STAT1 i colon cancerceller.

Resultater

Foranlediget af de mange rapporter om miR-145 nedregulering i kræft vi søgt at identificere miR-145 mål, som kan forklare den rolle, miR-145 i kræft. At få indsigt i ekspressionsniveauerne af MIR-145 i etablerede cellelinjer, vi profileret ekspressionsniveauerne i en række cancercellelinier og i ikke-tumorigene cellelinjer (fig S1). Ekspressionsprodukterne profiler af MIR-145 viste, at bortset MCF10A alle testede ikke-tumorigene cellelinjer udtrykte MIR-145, hvorimod ekspressionsniveauerne af MIR-145 var meget lav i alle testede cancercellelinier, understøtter tidligere resultater, hvor MIR-145 er nedreguleret eller tabt i kræft. På grund af dets implikationer i tyktarmskræft [13] – [18], besluttede vi at undersøge den rolle, miR-145 i coloncancercellelinie DLD-1. Co-transfektion af MIR-145 duplex med en luciferase reporter indeholdende et perfekt komplementær websted til de modne miRNA resulterede i en markant nedregulering af luciferaseaktiviteten, hvilket viser en meget effektiv overekspression (fig S2A). Som påvist ved både krystalviolet og MTT vækstassays, overekspression af MIR-145 resulterede i et fald celleproliferation (figur 1 og figur S3).

DLD-1-celler transficeret med 50 nM MIR-145 duplex udviser en reduceret celleproliferation som målt ved krystalviolet vækst assay. Data er vist som middelværdi ± S.D. af fire gentagelser.

Identifikation af miR-145 Mål

I betragtning af de tegn på, at miR-145 spiller en rolle i cancer, sammen med den begrænsede viden om sine mål i tyktarmskræft, målet var at identificere funktionelt relevante mål, der kunne hjælpe til at forklare den rolle miR-145 i kræft. For at opnå dette, anvendte vi et mikroarray baseret strategi svarende til den, der tidligere blev anvendt til at identificere MIR-21-mål [31]. DLD-1-celler blev transficeret med 50 nM MIR-145 duplex eller mock transficeret. Totalt RNA blev høstet 24 timer efter transfektion og analyseret på Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 humane arrays. blev analyseret i alt otte arrays. For filtrering blev uinformative gener med det samme udtryk niveau på tværs af alle arrays (herunder ikke-udtrykte gener) fjernes, og differentielt udtrykte gener, blev deres tilsvarende p-værdier og falske opdagelse satser beregnet som beskrevet i afsnittet om materialer og metoder.

for at afgøre, om de gener, der reguleres på miR-145 overekspression var relateret til specifikke cellulære funktioner, blev en søgning på de funktionelle anmærkninger i Ingenuity databasen (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) udføres for alle miR-145 responsive gener. De fem berigede funktionelle kategorier af genet ontologi analysen er anført i tabel 1. Blandt disse kategorier er celledød, cellulær vækst og proliferation, cellecyklusregulering og cancer. Tilsvarende analyser ved hjælp tilfældige gen sæt genereret fra Affymetrix HG-U133 Plus 2,0 anmærkninger, i nogle tilfælde resulterede i berigelse af de samme kategorier, som vi fandt beriget i miR-145 datasæt, men med p-værdier 10 størrelsesordener højere end i miR-145 datasæt (data ikke vist).

Seed websted berigelse analyse af forekomster af miR-145 frø steder i 3’UTRs viste en højsignifikant berigelse blandt de ned-regulerede udskrifter (figur 2A). P-værdier for berigelse af miR-145 frø sites (herunder 7mer, 7mer-1A og 8mer steder) var 1,4 · 10

-21 og 7,6 · 10

-8, når man overvejer de ned-regulerede udskrifter vs . opreguleret udskrifter og nedreguleret udskrifter vs. ingen ændring udskrifter hhv. To alternative metoder til beregning af frø webstedet berigelse, enten som frø websted forekomster efter korrigere op, ned og ingen ændringer indstiller til den samme størrelse eller som frø websted hændelser pr kb, viste en lignende berigelse i de ned-regulerede 3’UTRs ( FIGUR S4). Tilsammen har dette bekræfter, at mikroarrayet tilgang kan anvendes til at identificere miRNA targets. Når hele cDNA-sekvensen af ​​transkripterne blev anvendt til frø websted berigelse analyse (rapporteret som procentdelen af ​​transkripter med frø steder), vi stadig finde en betydelig berigelse af frø sites, selvom berigelse er mindre udtalt i forhold til kun overvejer 3 ‘UTR-sekvenser (FIGUR S5A). En tilsvarende analyse af kodningssekvenser og 5’UTR sekvenser afslørede ingen signifikant frø websted berigelse (FIGUR S5B og S5C).

A, Procenterne af gener i op, ned (dn) og ingen ændring (nc ) sæt med frø steder i deres 3’UTRs. Kun de 6mers som ikke er en del af en 7mer eller 8mer er rapporteret som 6mers og kun de 7mers, der ikke er indeholdt i en 8mer tælles som 7mers. Logaritmisk fold-ændringer var 0,36, 0,02 og -0,40 for op, ned og ingen forandring sæt hhv. De p-værdier beregnes teste nulhypotesen, at andelen af ​​gener med frø sites er det samme for nedreguleret og up-regulerede gener (dn vs. op) eller ned-regulerede gener sammenlignet med no-ændring gener (dn vs. nc). P-værdier for 7mer frø websted berigelse var 1,7 · 10

-33 (dn vs. op) og 2,9 · 10

-11 (dn vs. nc). P-værdier for 7mer-1A frø websted berigelse var 3,7 · 10

-18 (dn vs. op) og 7,8 · 10

-7 (dn vs. nc). B, Uvildige ord analyse, der viser den løbende sum af overrepræsentation score for miR-145 7mer frø site i prioriteret liste over 3’UTR sekvenser (sort linje) sammenlignet med permutationer af den rangeret gen listen (røde linjer). Ned- og op-regulerede gener (defineret som gener med FC -1,1 eller FC 1.1) i den rangeret gen listen er angivet i grafen. C, Kvantitativ RT-PCR validering af microarray data. Celler blev transficeret med 50 nM MIR-145 duplex eller mock transficeret og totalt RNA høstet 24 timer efter transfektion. De 3’UTRs af

IQGAP1

STAT1

ikke indeholder miR-145 frø kampe, men begge gener indeholder en 7mer frø match i deres kodende region. Alle andre miR-145 responsive gener indeholder mindst ét ​​7mer frø websted i deres 3’UTR. Ekspressionsniveauet af hvert transkript er vist i forhold til niveauet i mock-transficerede celler. Data er vist som middelværdi ± S.D. af tre gentagelser.

Uvildige ord analyser af 3’UTR sekvenser identificeret den 7mer frø site af miR-145 som den mest markant beriget 7mer ord i 3’UTRs af ned-regulerede udskrifter (TABEL 2). Flere af de andre meget beriget ord var variationer af miR-145 frø stedet og den fjerde mest beriget ord var 7mer-1A frø match (tabel 2). En tilsvarende 6mer ord analyse identificerede også miR-145 frø kampe som den mest betydeligt beriget ord (FDR 0,005) (figur S6). Plotning kører summen af ​​overrepræsentation scoringer af 7mer frø websted i udskrifter rangeret efter deres logFC viste klart, at de 3’UTRs af ned-regulerede udskrifter havde en høj berigelse af MIR-145 7mer frø (sort linje), som ikke blev observeret for permutationer af den rangeret gen listen (røde linjer) (figur 2B).

Potentielle miR-145 Mål

Siden miR-145 er nedreguleret eller tabt i kræft, re -Indførelse af mIR-145 ville forventes at forårsage en direkte nedregulering af onkogene mål. Faktisk en række gener med onkogen funktion var nedreguleret på miR-145 overekspression herunder Src familiemedlem

YES

og actin krydsbinding protein

FSCN1

, som findes i celle overfladefremspring impliceret i cellemotilitet [32]. Den metalloproteinase

ADAM17

og medlem af inhibitor af apoptose (IAP) familie

BIRC2

(også kendt som

cIAP1

), som begge indeholder 8mer miR-145 frø sites i deres 3’UTRs, blev også observeret som nedreguleres upon mIR-145 overekspression. Desuden

VANGL1

som er involveret i sårheling reaktion af intestinale epiteliale cellelinjer ved fremme af cellemigration blev også identificeret som en formodet MIR-145 target [33].

Nogle af de ned-regulerede gener ikke har et mIR-145 frø websted i deres 3’UTR, men i stedet havde en eller flere et frø steder i den kodende region. STAT1, en velkendt transkriptionsfaktor [34], [35] og IQGAP1 en negativ regulator af celle-celle adhæsioner og stimulator af cellemotilitet og invasion [36], begge havde MIR-145 frø steder i de kodende regioner af transskriptioner. I tilfælde af

STAT1

er MIR-145 frø lokaliseret i den næstsidste exon af transkriptet. Da

STAT1

var blandt de mest ned-regulerede udskrifter i microarray analyse blev det også betragtes som et potentielt mål og indgår i de efterfølgende undersøgelser. De tidligere identificerede miR-145 mål

OCT4

,

SOX2

KLF4

i humane embryonale stamceller blev ikke udtrykt i DLD-1 celler (data ikke vist).

MYC

,

ISR-1

og

IGF-1R

, foreslået af andre som miR-145 mål [16], [25], [27], viste ingen ændring i ekspressionsniveau upon mIR-145 overekspression i vores datasæt (data ikke vist). Den fulde liste over identificerede potentielle miR-145 mål, der indeholder frø steder i deres 3’UTR præsenteres i tabel S1.

Target Validering

Vi næste bekræftede microarray data ved kvantitativ RT-PCR for syv udvalgte udskrifter, der blev fundet nedreguleret i microarray analyse (figur 2C). Især

STAT1

YES

, som har miR-145 frø steder i den kodende region og 3’UTR henholdsvis viste en klar nedregulering på udskrift niveau på miR-145 overekspression. For at bestemme om miR-145 direkte regulerer

YES

STAT1

, luciferase reporter konstruktioner blev klonet. Baseparringen mellem miRNA frø sites og de potentielle mRNA-mål er afbildet i figur 3A. I begge tilfælde, overekspression af miR-145 resulterede i nedsat luciferaseaktivitet, hvilket indikerer, at miRNA kan binde både den

YES

3’UTR og

STAT1

cDNA og direkte mægle undertrykkelse (figur 3B ). Dette var ikke tilfældet med reporterkonstruktioner hvor frøene sites var blevet muteret (figur 3B). For yderligere at bekræfte miRNA medieret nedregulering af STAT1 og YES på proteinniveau blev western blot-analyser udført i begge DLD-1-celler og HCT116 colon cancerceller. Den overekspression effektivitet miR-145 i HCT116 målt ved luciferasereporteren konstruktioner svarede til observeret i DLD-1 celler (figur S2B). En markant fald i YES proteinniveau medieret af MIR-145 blev observeret 48 timer efter transfektion i begge DLD-1 og HCT116-celler (figur 3C). En mere subtile, men stadig klar nedregulering af STAT1 medieret af MIR-145 blev også observeret (figur 3D). Især graden af ​​STAT1 undertrykkelse varierede mellem DLD-1 og HCT116-celler, med den stærkeste undertrykkelse af STAT1 observeret i DLD-1-celler.

A, Sekvensalignment på MIR-145 frø region og mRNA-mål. De position koordinater er angivet til udskrift isoformer er angivet nedenfor.

Ja1

3’UTR: ENSG00000176105: ENST0000035983

STAT1

cDNA: ENSG00000115415: ENST00000361099. B, Firefly luciferaseanalyse med pGL3 + konstruktioner holder et 3’UTR fragment af

YES

eller et cDNA fragment af

STAT1

, nedstrøms til den ildflueluciferase genet. Celler blev co-transficeret med ildflueluciferase reportere sammen med en

Renilla

luciferase transfektionskontrol plasmid enten alene eller med 50 nM MIR-145 duplex og 50 nM AllStar duplex som en negativ kontrol. I pGL3 + mut vektorer to basepar i miR-145 frø websted er blevet muteret. Luminescens blev målt 24 timer efter transfektion, og forholdet mellem ildflue til

Renilla

aktivitet er vist i forhold til transfektion uden RNA duplex og den tomme vektor. Data er vist som middelværdi ± S.D. af fire replikater. *, P 0,05 under anvendelse af en to-halet t-test, ***, p 0,01 under anvendelse af en to-halet t-test. C og D, Western blot-analyse af DLD-1 og HCT116-celler transficeret med MIR-145 duplexer eller mock-transficerede celler blottet for JA (C) og STAT1 (D). Vinculin eller tubulin blev anvendt som indlæsning kontroller. Båndene blev kvantificeret i forhold til de relevante lastning kontrol ved hjælp af TotalLab software og er vist i forhold til proteinniveauet i mock-transficerede celler. De viste data er repræsentative for to eksperimenter.

Sekundære virkninger som følge af STAT1 Deregulering

STAT1 er en velkarakteriseret transskription faktor bedst anerkendt som en transkriptionel aktivator, men eksempler på negative transkriptionel regulering er også blevet beskrevet [34]. Den STAT1 bindende motiv som defineret af Jaspar CORE databasen [37] er vist i fig S7A. At bestemme, om MIR-145 medieret nedregulering af STAT1 også forårsaget en ændring af ekspressionsniveauet af STAT1 målgener i microarray analyse, en søgning efter STAT1 bindingssteder i promotorerne for nedreguleres, opreguleret og transkripter med ingen ændring i ekspressionsniveau blev udført. Ud af alle Jaspar core transkriptionsfaktorer, STAT1 var den mest markant beriget bindingssted både når nedreguleret (p-værdi = 4,18 · 10

-4) og up-regulerede gener (p-værdi = 1,34 · 10

-4) blev sammenlignet med generne uden nogen ændringer i ekspression (tabel 3). Dette var ikke tilfældet for en permuteret STAT1 bindende matrix, når man sammenligner opreguleret gener til generne uden ændring i udtrykket niveau (figur S7B). Men når man overvejer de ned-regulerede gener sammenlignet med ingen-change-gener, der var også en mindre berigelse af STAT1 permuteret bindingssteder, hvilket indikerer, at nogle af de observerede virkninger kan være ikke-specifik (FIG S7C).

diskussion

miRNA dukker op som vigtige gen regulatorer og intensiv forskning af deres funktioner og mål har afsløret en rolle miRNA i flere vigtige cellulære funktioner. Selvom vores forståelse af funktionelle roller miRNA i kræftsygdomme er støt stigende, viden om miR-145 og dens mål i tyktarmskræft er stadig stort set mangler. Vi dermed fokuseret på identifikation af miR-145 mål i tyktarmen kræftceller. Støtte tidligere resultater, at miR-145 er nedreguleret i tumorer [10] – [13], [15], [16], [18] – [21], [38] – [42], en profil af miR- 145 ekspression i etablerede cellelinjer viste, at ekspressionsniveauer af mIR-145 drastisk reduceret i cancercellelinier forhold til ikke-tumorigene cellelinjer. Efter aftale med rapporter, der viser en vækst hæmmende effekt af miR-145 [16], [17], [41], vi også observere en vækst reduktion af DLD-1 celler efter forbigående miR-145 transfektion, hvilket indebærer, at miR-145 besidder en tumor-suppressor funktionen

in vitro

.

Her brugte vi microarray profilering på miR-145 overekspression som en metode til identifikation af potentielle mål. Microarray udtryk profiler kombineret med frø websted berigelse analyse er en veletableret metode der anvendes til at identificere potentielle miRNA mål [31], [43], [44]. Det har den fordel i forhold strengt beregningsmæssige target forudsigelse om, at det ikke kun er baseret på tilstedeværelsen af ​​et frø websted og sekvens træk ved potentielt mål, men tager højde for, om målet er udtrykt i den betragtede cellelinje, og om målet er reguleret på udskriften niveau. Da denne tilgang udelukkende er baseret på ændringer observeret på udskrift niveau, mål udelukkende reguleret af translationel undertrykkelse, vil ikke blive identificeret.

Seed websted berigelse analyse og fordomsfri ord analyse viste en klar berigelse af miR-145 frø sites i 3’UTRs af down-regulerede udskrifter, bekræfter vores tilgang til at identificere miR-145 mål. Vi har ikke observere nogen berigelse af miR-145 frø steder i den kodende region af down-regulerede udskrifter. , Da nogle af de gener, der indeholder frø sites i den kodende region tidligere havde været impliceret i cancer, vi spekulerede dog, at disse mål-kandidater også kan spille en funktionel rolle nedstrøms MIR-145. Den unbiased Ordet analyse, anvendes her til at evaluere berigelse af ord i 3’UTRs ifølge logFC af transkriptet upon MIR-145 overekspression, præsenterer en yderst nyttig fremgangsmåde til visualisering af virkningerne af miRNA overekspression uden at foretage nogen forudindtaget antagelse om cutoff værdier. Formen af ​​den løbende sum kurven viser en skarp spids af miR-145 7mer frø sites for de mest ned-regulerede gener tyder på, at målet udskrift nedregulering til en stor del skyldes de direkte effekter af miR-145 målretning. Den fordomsfri Ordet analyse bekræftede tidligere rapporter, der viser, at et A ved position 1 af frøet site er gavnligt uanset dens potentiale til basepar med miRNA [2], [45].

Mange af målene er identificeret her er tidligere blevet impliceret i cancer. De berigede funktionelle kategorier af alle miRNA responsive mål understøttes yderligere konsekvenserne af miR-145 i kræft og antyde, at både de direkte effekter af miR-145 samt afledte effekter kan forklare betydningen af ​​miR-145 i kræft. En række gener med onkogen funktion, hvoraf mange har også været forbundet med coloncancer, blev identificeret som potentielle MIR-145 mål baseret på microarray analyse. Disse omfatter

ADAM17

,

BIRC2

VANGL1

. ADAM17 er rapporteret opreguleret i coloncarcinomer og har vist sig at fremme frigørelsen af ​​epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) ligander fra cellemembranen og dermed aktivere EGFR [46]. BIRC2 er blevet påvist at være afgørende for at opretholde endotelcelle overlevelse og vaskulær integritet i zebrafisk ved at aktivere dannelsen af ​​TNF-receptor-komplekset I såvel som fremme nedbrydningen af ​​IKB, hvorpå NF-KB er frigivet og translokerer ind i kernen, hvor det aktiverer pro-overlevelse gener i endotelceller [47]. Cellemembranen associeret del af VANGL1 stiger med differentiering og blev påvist at co-lokalisere med E-cadherin i human colon celler [33]. Desuden blev det påvist, at overekspression af

VANGL1

stimulerede sårlukning af intestinale epiteliale cellelinjer, mens siRNA rettet mod Vangl1 hæmmede vandrende respons [33]. Tidligere rapporterede MIR-145 mål, herunder

OCT4

,

SOX2

KLF4

involveret i fremme af stamceller proliferation blev ikke udtrykt i DLD-1 celler, hvilket indebærer, at vækstinhiberende virkning af mIR-145 overekspression i DLD-1-celler ikke skyldes nedregulering af disse gener. Et andet centralt regulator af celleproliferation,

MYC

, tidligere rapporteret som en miR-145 mål viste ingen ændring i udtrykket niveau på miR-145 overekspression i vores omgivelser.

Eksperimentel validering af

JA

og

STAT1

som mIR-145 mål demonstrerede en markant nedreguleret på mRNA og proteinniveauet, hvilket beviser den biologiske effekt af mIR-145 om de endogene mål. Nedregulering i 3’UTR /cDNA luciferaseassays validerer endvidere, at dette er resultatet af direkte interaktioner, da mutationer af MIR-145 frø sites afskaffe denne nedregulering. Grunden til de forskellige virkninger af miR-145 i de forskellige analyser er sandsynligvis på grund af mangel på direkte sammenlignelighed mellem disse analyser. Denne forskel kan også skyldes andre bindende faktorer involveret i reguleringen af ​​den endogene transkript, da disse bindingssteder ikke er til stede i 3’UTR eller cDNA-fragmenter anvendt i de klonede luciferase reporterkonstruktioner.

En række undersøgelser har knyttet forøget ekspression af JA i kræft med øget celle motilitet og tumor invasion [48], [49]. JA er en del af Scr kinase familien [50] og dets tyrosinkinaseaktivitet er blevet vist at være forhøjet i colon adenomer sammenlignet med dets aktivitet i det tilstødende normale slimhinde [51]. Endvidere JA aktivitet viste sig at korrelere med den forudsagte risiko cancer baseret på størrelse, histologi, og graden af ​​dysplasi [51]. Tilsammen Den foreliggende data tyder på, at opregulering af JA er vigtig for vækst og transformation af intestinale celler.

STAT proteiner fungerer nedstrøms Jaks og MAPK’er, der inducerer dimerisering af STAT proteiner, hvorved translokationen af ​​STAT proteiner ind i kernen [34], [35]. STAT1 er bedst kendt for sin pro-apoptotisk rolle som reaktion på interferoner, men STAT1 er også blevet rapporteret at have en pro-overlevelse rolle i visse cancere [35]. Vi observerede en nedregulering af

STAT1

på transkript niveau og proteinniveau upon MIR-145 overekspression. Endvidere viser vi, at denne nedregulering af STAT1 udslag i en virkning på ekspressionsniveauet af potentielle STAT1 mål. Dette er tilfældet for gener både positivt og negativt reguleret af STAT1, men virkningen er størst i gener reguleres negativt af STAT1. Selvom STAT1 er rapporteret både som en transkriptionel aktivator og repressor, den vigtigste mekanisme for STAT1 transkriptionel regulering er aktiveringen af ​​dens målgener [34]. Vores resultater antyder, at transkriptionel repression er mere udbredt end anerkendt tidligere. For at opsummere, transskription faktor analyser af initiativtagerne til liberaliserede gener giver et middel til at karakterisere sekundære effekter som tidligere publicerede for miR-34a [52]. Den identificerede berigelse af STAT1 bindingssteder i initiativtagere til regulerede gener viser, at sekundære virkninger af miRNA overekspression udtales allerede 24 timer efter transfektion. Derfor er det vigtigt at overveje sekundære virkninger, når man analyserer miRNA overekspression datasæt.

Afslutningsvis anvendelse af en mikroarray tilgang vi har identificeret yderligere mål for cancerassocieret miRNA MIR-145 i colon cancerceller. De miRNA targets identificeret i denne undersøgelse kan tjene til at præcisere, hvilken rolle miR-145 i tyktarmskræft samt andre kræftformer.

Materialer og Metoder

Cell Cultures

DLD-1 celler blev dyrket i DMEM GlutaMAX ™ -I høj glucose medium (31966, Gibco Invitrogen) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS, CH30160.03, Hyclone), 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin (P /S, 15140 Gibco Invitrogen) og inkuberet i 5% CO

2 plus 20% oxygen. HCT116-celler blev dyrket i McCoys 5A L-glutamin-medium (22330, Gibco Invitrogen) suppleret med 10% (vol /vol) FBS og P /S. Overekspression af MIR-145 blev opnået ved transfektion med en MIR-145 duplex, der efterligner det modne MIR-145 (PM11480; Ambion). Transfektion med

Caenorhabditis elegans

lin-4 duplex (PM10768, Ambion) eller AllStar negativ kontrol siRNA (1.027.281, Qiagen) blev anvendt som kontrol. Alle transfektioner blev udført under anvendelse af Lipofectamine ™ 2000 transfektionsreagens (11.668-019, Invitrogen) ifølge producentens protokol.