PLoS ONE: Komplekse Virkningerne af PI3K /AKT Inhibitors til Androgen receptor genekspression i prostatacancerceller

Abstrakt

Baggrund

Androgen afsavn terapi (ADT) er den første linje behandling til metastatisk prostatacancer (PSA). Imidlertid vedvarende ekspression og funktion af androgen receptor (AR) -genet bidrage til udviklingen af ​​kastrationsresistent prostatakræft (CRPC). Derudover kan tumorer tilpasse PI3K /AKT overlevelse vej at flygte ADT. Co-targeting AR og PI3K /AKT-signalering er blevet foreslået at være et mere effektive terapeutiske midler til CRPC patienter. Mange kliniske forsøg i gang for at teste, om PI3K /AKT-hæmmere er til gavn for PCA patienter. Men om disse inhibitorer har nogen indvirkning på de udtryk for fuld længde AR (AR-FL) og dens splejsningsvariant (AR-V7) er fortsat uklar.

Metoder

Fire humane prostatakræft-cellelinier (LNCaP, LNCaP95, VCAP og 22Rv1) med forskellige genetiske baggrunde blev behandlet med fem PI3K /AKT-hæmmere (LY294002, wortmannin, BKM120, Akti og AZD5363) og eller AKT siRNA. AR og AR-V7 protein og mRNA-niveauer blev målt ved immunoblotting og real-time PCR assays. AR gen transkriptionsinitiering, alternativ RNA splejsning og AR mRNA nedbrydning satser blev også bestemt.

Resultater

PI3K /AKT-hæmmere havde forskellige konsekvenser for AR protein udtryk primært gennem ændringer af AR gentranskription initiering og RNA-splejsning. Men forblev uændret i tilstedeværelse RNA silencing af AKT gener disse effekter.

Konklusion

PI3K /AKT-hæmmere har off-target effekter på AR genekspression i prostata kræftceller, som skal være betragtning, når anvendelsen af ​​disse inhibitorer til PCA patienter, især patienter under ADT behandling

Henvisning:. Liu L, Dong X (2014) Komplekse Virkninger af PI3K /AKT Inhibitors til Androgen receptor genekspression i prostatacancerceller. PLoS ONE 9 (10): e108780. doi: 10,1371 /journal.pone.0108780

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: Juli 18, 2014 Accepteret: 3. september 2014 Udgivet 31. oktober, 2014

Copyright: © 2014 Liu, Dong. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde modtog et driftstilskud fra canadiske Institutes of Health Research (MOP-137.007) og en Rising Star Award fra prostatakræft Canada (RS2013- 58) til Xuesen Dong. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Androgen afsavn terapi (ADT) er den standard behandling for metastatisk prostatacancer (PSA). Men progression til kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) forekommer at størstedelen af ​​patienterne [1]. CRPC tumorer opretholde ekspressionen af ​​AR og dens regulerede gener, hvilket indikerer, at AR signalering fortsat fungerer [2] – [5]. er blevet foreslået adskillige mekanismer til afvigende AR genaktivering indlæg ADT herunder: i) AR genamplifikation og få-of-funktion mutationer [4], [6] – [9]; ii) ændringer i ekspression og funktion af centrale AR co-regulerende [10] – [12]; og iii) vigtigere, generering af ligandbindingsdomæne trunkerede AR splejsningsvarianter (AR-Vs) [13] – [16] som konstitutivt aktiverer AR signalering. Blandt disse varianter, AR-V7 (også kaldet AR3) er den mest rigeligt udtrykte AR-V i PCa [13], [14], [17]. AR-V7 protein niveauer er signifikant forhøjet i CRPC tumorer og tæt forbundet med kortere patient overlevelse [13], [14], [18]. Disse resultater understreger, at blokering af AR genekspression og funktion er fortsat en vigtig terapi.

Derudover phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT /pattedyr mål for rapamycin (mTOR) signalering ofte aktiveres i PCa og har været påvist at spille vigtige roller for CRPC progression og resistens over for behandling celledød [19], [20]. Genetiske ændringer af komponenter af PI3K /AKT /mTOR pathway forekom hos 42% af de primære prostatatumorer og 100% af metastatiske tumorer [19]. Mere vigtigt var reciprok feedback-aktivering af AR og PI3K /AKT pathways blevet påvist, som tillader kræftceller at tilpasse enten pathway for overlevelse, når den anden er farmakologisk inhiberede [21], [22]. Disse resultater giver et rationale, der co-targeting begge veje kan opnå bedre resultater for CRPC patienter.

Der er flere hæmmere målrettet forskellige centrale elementer i PI3K /AKT-vejen, herunder PI3K, AKT og mTOR. Men PI3K hæmmere såsom LY294002 er også blevet påvist, at binde og hæmme andre kinaser, der ikke hører til PI3K /AKT signalering [23], [24]. Desuden har undersøgelser vist, at når mTOR aktivitet inhiberes af visse AKT inhibitorer, kan det udløse en feedback-mekanisme resulterer i re-aktivering af AKT eller mitogenaktiverede proteiner [25], [26]. Tilsammen udgør disse resultater viste, at ud over at undertrykke AKT nedstrømseffektorer, kunne off-target effekter af AKT-hæmmere producere dybtgående konsekvenser for kræftceller. Spørgsmålet er stadig skal besvares, er, om PI3K /AKT-hæmmere kan ændre udtryk for fuld længde AR (AR-FL) og AR-V7 i PCA celler, hvilket muligvis kunne modvirke virkningen af ​​ADT.

I denne undersøgelse blev fire PC cellelinier behandlet med fem PI3K /AKT-inhibitorer. Vi målte både AR mRNA og proteinniveauer og bestemt AR gen transkriptionsinitiering, RNA-splejsning og AR mRNA nedbrydningshastigheder. Vi rapporterede der eksisterede komplekse virkninger af PI3K /AKT-hæmmere til AR genekspression, der er uafhængige for AKT knockdown. Disse off-target effekter på AR genekspression skal overvejes, når de anvender PI3K /AKT-hæmmere til PCA patienter.

Materialer og Metoder

prostatakræft-cellelinier, PI3K /AKT-hæmmere og siRNA transfektion

LNCaP, VCap og 22Rv1 human prostatacancer-cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). LNCaP-celler var mellem 42-50 passager. LNCaP95 cellelinje blev leveret af Dr. Plymate (University of Washington) og blev rapporteret i tidligere undersøgelser [14], [27], [28]. Det er afledt af LNCaP-og har opnået resistens over for androgen udtynding betingelser. Både LNCaP og LNCaP95 udtrykke mutant AR (T877A), der kan aktivere AR af en bred vifte af steroider eller steroid analoger. De udtrykker også mutant phosphatase og tensin homolog (PTEN) -gen, som konstitutivt aktiverer AKT. VCap celler udtrykker vildtype AR og PTEN. Men de besidder AR genamplifikation resulterer i højere niveauer af AR-FL og AR-V7 udtryk. 22Rv1 celler udtrykker vildtype PTEN, men har gen omlejring af AR-genet resulterende høje niveauer af AR-V7 ekspression. Disse fire PCA cellelinjer repræsenterer en bred vifte af genetiske ændringer af PCA-celler. LY294002 og Wortmannin blev indkøbt fra Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). NVP-BKM120 og AZD5363 var fra Selleck kemikalier (Houston, TX). Akti (CAT # 124.005) var fra EMD Millipore (Billerica, MA). Kontrol og AKT siRNA’er (CAT #: J-003 tusind, J-003.001 og J-003.002 for AKT 1-3 isoformer henholdsvis) var fra Dharmacon (Ottawa, Ontario). SiRNA’er blev transficeret ind PCA celler ved hjælp siLentFect Lipid Reagent fra Bio-Rad (Mississauga, ON) ifølge producentens protokol.

Immunoblotting assays

Proteinlysater blev opsamlet med lyseringsbuffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% natriumdeoxycholat og 0,1% SDS) suppleret med protease og phosphataseinhibitorer fra Roche (Laval, QC) som vi beskrevet [29]. Proteinkoncentrationen af ​​hver prøve blev bestemt under anvendelse af BCA-kit fra Pierce (Rockford, IL) ifølge producentens instruktioner. Proteinprøver blev adskilt ved SDS-PAGE-geler, overført til polyvinyldifluorid (PVDF) -membraner og blottet med viste antistoffer. Forsøg blev gentaget mindst tre gange, og et sæt af de repræsentative blots blev vist. Antistof oplysninger er angivet i tabel S1.

Real-time PCR

Real-time PCR-analyser blev udført som vi beskrevet [30], [31]. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse Purelink RNA mini kit fra Invitrogen (Burlington, ON) ifølge producentens instruktioner. Real-time PCR blev udført i triplikater under anvendelse Applied Biosystems7900HT med 5 ng cDNA, 1 uM af hver primer par og SYBR Green PCR Master Mix fra Roche (Laval, QC). Alle real-time PCR assays blev udført under anvendelse af tre tekniske replikater og tre uafhængige cDNA synteser. Primer oplysninger er angivet i tabel S1.

Nuklear run-on assay

Nuclear køre-on analyser blev udført som beskrevet [32] med mindre modifikationer. LNCaP og LNCaP95 celler blev behandlet i 18 timer med bil, LY294002, AZD5363 eller siRNA mod AKT1-3 isoformer. Fuldstændig 6 × 10

6 cellerne blev vasket med kold PBS, høstet og lyseret på is i 0,5% Nonidet P-40 lysisbuffer [10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCI2] og centrifugeret ved 500 x g i 10 min. Supernatanter blev fjernet, og kerner blev inkuberet i reaktionspuffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl2, 0,3 mM KCI] indeholdende 2,5 mM NTP plus Biotin-16-UTP mix fra Roche (Laval, QC) i 45 minutter ved 30 ° C. Biotinylerede nascente RNA-transkripter blev udfældet ved streptavidinkugler fra Gold Biotechnology (St. Louis, MO) og vasket med saltvand natriumcitratbuffer plus 15% formaldehyd. Udfældet RNA blev elueret fra streptavidinkugler og anvendt som skabeloner til real-time PCR-analyser med primere amplifikation mRNA’er af total Ar eller 18S rRNA (18rS) som beskrevet i tabel S1. Resultater blev afbildet som gennemsnit ± standardfejl fra tre uafhængige gentagelser af hver eksperimentel betingelse.

RNA-splejsning assayet AR-genet

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse Purelink RNA mini kit fra Invitrogen (Burlington, ON ). Real-time PCR blev udført for at måle AR-genet RNA-splejsning. Den relative AR-FL og AR-V7 splejsningseffektivitet blev bestemt ved normalisering med en intern PCR-produkt inden AR exon 2 og 3. Primer oplysninger blev anført i tabel S1. Alle real-time PCR assays blev udført under anvendelse af tre tekniske replikater og tre uafhængige cDNA synteser.

Statistik Salg

Resultater udtrykkes som middelværdi ± SEM. For at bestemme forskellene mellem forsøgsgrupper, envejs ANOVA efterfulgt af studerende

t

-test blev udført under anvendelse af GraphPad Prism (version 4) med signifikansniveau sat til P 0,05 som *, P 0,01 som ** og P. 0,001 som ***

Resultater

Virkninger af PI3K /AKT-hæmmere til AR protein niveauer i PCA celler

LY294002 er en stærk kompetitiv inhibitor til PI3K og forhindrer PI3K fra at phosphorylere og aktivere nedstrømseffektorer af AKT [33]. Wortmannin er en covalent inhibitor af PI3K, som irreversibelt undertrykker AKT phosphorylering [34]. LY294002 undertrykt AR-FL proteinniveauer i LNCaP-celler (fig. 1A), hæmmede både AR-FL og AR-V7 proteinniveauer i LNCaP95 celler (Fig. 1B). Både LNCaP og LNCaP95 celler er PTEN deficiente celler, hvori AKT konstitutivt aktiv i sin phosphorylering formen (p-AKT). Både LY294002 og Wortmannin inhiberes stærkt p-AKT niveauer i begge cellelinier. Densitometri analyser af protein udtryk for AR-FL, AR-V7 og p-AKT blev målt (Fig. 1C). Interessant, både LY294002 og Wortmannin undertrykte AR-FL og AR-V7 protein udtryk i VCap celler (Fig. 2A). Imidlertid LY294002 steg AR-FL, men faldt AR-V7 proteinniveauer i 22Rv1 celler (fig. 2B). Wortmannin hæmmede både AR-FL og AR-V7 protein udtryk i VCAP og 22Rv1 celler. Densitometri analyser på protein udtryk for AR-FL og AR-V7 blev analyseret (fig. 2C). Da VCAP og 22Rv1 celler er PTEN tilstrækkelige celler, hvor p-AKT er ved meget lave /ikke-detekterbare niveauer medmindre dens upstream tyrosinkinasereceptorer aktiveres, virkningerne af LY294002 til AR proteinekspression i VCAP og 22Rv1 celler blev ikke sandsynligt relateret til AKT aktivering . BKM120 er en pan-PI3K-inhibitor, men ikke til mTOR [35]. BKM120 effektivt undertrykt p-AKT niveauer i både LNCaP og LNCaP95 celler. Men BKM120 havde nogen effekter til AR-FL og AR-V7 protein niveauer i alle fire PCA cellelinjer (fig. 1-2). AKTI er en konkurrencedygtig phosphatidylinositol ether analog, dokker ind i pleckstrin homolgy (PH) domæne af AKT, forhindrer AKT translokation til PI3K på plasmamembranen dermed hæmmer AKT phosphorylering og aktivering [36]. AKTI viste ingen undertrykkende effekter til AR-FL eller AR-V7 protein niveauer (fig. 1-2). AZD5363 er en ATP-kompetitiv inhibitor af AKT [37], [38]. Det steg både AR-FL og AR-V7 protein niveauer og inducerede p-AKT niveauer i LNCaP og LNCaP95 celler (Fig. 1). Men det faldt AR-FL og AR-V7 proteinniveauer i PTEN tilstrækkelig VCap og 22Rv1 celler (Fig. 2).

(A) LNCaP og (B) LNCaP95 celler blev behandlet med stigende doser af PI3K /AKT inhibitorer LY294002 (0, 25, 50 uM), wortmannin (0, 0,5 og 1 uM), BKM120 (0, 0,5 og 1 uM), Akti (0, 5 og 10 uM) eller AZD5363 (0, 2,5 og 5 uM ) i 18 timer. Proteinlysater blev immunblottet med AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, fosfor-AKT (Ser473) og p-actin-antistoffer. (C) Resultater blev gentaget mindst tre uafhængige forsøg. Densitometrianalyse af proteinbånd blev målt ved Image J software og plottet som middelværdi + SEM. En-vejs ANOVA efterfulgt af student t-test blev udført med * som P 0,05, ** som P 0,01 og *** som P . 0.001

(A) VCAP og (B ) 22Rv1 celler blev behandlet med stigende doser af PI3K /AKT inhibitorer LY294002 (0, 25, 50 uM), wortmannin (0, 0,5 og 1 uM), BKM120 (0, 0,5 og 1 uM), Akti (0, 5 og 10 uM) eller AZD5363 (0, 2,5 og 5 uM) i 18 timer. Proteinlysater blev immunblottet med AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, fosfor-AKT (Ser473) og p-actin-antistoffer. (C) Resultater blev gentaget mindst tre uafhængige forsøg. Densitometrianalyse af proteinbånd blev målt ved Image J software og plottet som middelværdi + SEM. En-vejs ANOVA efterfulgt af student t-test blev udført med * som P 0,05, ** som P 0,01 og *** som P . 0.001

Virkninger af PI3K /AKT-hæmmere til AR mRNA-niveauer i PCA celler

AR mRNA-niveauer blev også målt i PCA cellelinjer under behandlinger af PI3K /AKT-hæmmere. Ændringerne af AR-FL og AR-V7 mRNA-niveauer (fig. 3) var i overensstemmelse med, hvad der blev observeret i AR proteinniveauer som vist i figur 1 og 2. LY294002 og Wortmannin faldt både AR-FL og AV-7 mRNA-niveauer i alle PCA cellelinier, bortset fra at LY294002 øget AR-FL-mRNA-niveauer i 22Rv1 celler. BKM120 og AKTI havde ingen væsentlige påvirkninger i AR mRNA-niveauer. AZD5363 øgede AR-FL og AR-V7 mRNA-niveauer i LNCaP og LNCaP95 celler, men faldt deres mRNA-niveauer i VCAP og 22Rv1 celler med statistisk signifikans. Disse resultater antydede, at PI3K /AKT inhibitorer påvirket AR-genekspression primært på mRNA-niveau.

LNCaP, LNCaP95, VCap og 22Rv1 celler blev behandlet med stigende doser af PI3K /AKT inhibitorer LY294002 (0, 25, 50 uM) , Wortmanin (0, 0,5 og 1 uM), BKM120 (0, 0,5 og 1 uM), Akti (0, 5 og 10 uM) eller AZD5363 (0, 2,5 og 5 uM) i 18 timer. AR-FL (A) og AR-V7 (B) mRNA ekspressionsniveauer i forhold til 18rS blev bestemt ved real-time PCR. Resultaterne var fra tre uafhængige RNA-ekstraktioner med tredobbelte real-time PCR assays på hver RNA-prøve. Dataene blev afbildet som gennemsnit + SEM. En-vejs ANOVA efterfulgt af student t-test blev udført med * som P 0,05, ** som P 0,01 og *** som P . 0.001

Virkninger af AKT knockdown at AR gen udtryk

for yderligere at undersøge, om virkningerne af LY294002 og AZD5363 om AR protein og mRNA niveauer blev medieret gennem AKT, vi udførte AKT knockdown assays under anvendelse puljet siRNA mod alle tre AKT1-3 isoformer. Effektivitet af AKT siRNA blev vist ved Western blotting (Fig. 4A-B). Vi observerede, at uanset tilstedeværelsen af ​​AKT knockdown, LY294002 kan stadig dramatisk reducere AR-FL og AR-V7-protein (fig. 4A) og mRNA (fig. 4C) niveauer i LNCaP, LNCaP95 og VCap celler. LY294002 opreguleres AR-FL-ekspression, men faldt AR-V7 ekspression i 22Rv1 celler. Derudover observerede vi, at AZD5363 signifikant forøget AR-FL udtryk i LNCaP og LNCaP95 celler og nedsat AR-FL og AR-V7 i VCap og 22Rv1 celler, hvilke effekter forblev uændret, selv i nærvær af en effektiv AKT knockdown (Fig. 4B og 4D). Tilsammen udgør disse resultater viste, at virkningerne af LY294002 og AZD5363 til AR udtryk var uafhængige til AKT og dens downstream effektorer.

LNCaP, LNCaP95, VCAP og 22Rv1 celler blev transficeret med kontrol eller samlet siRNA for AKT 1-3 isoformer i 36 timer. Celler blev derefter yderligere behandlet med 50 pM LY294002 (A) eller 5 uM AZD5363 (B) i yderligere 18 timer. Proteinlysater blev immunblottet med AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, p-AKT (Ser473) og p-actin-antistoffer. Resultater blev gentaget i mere end tre uafhængige forsøg. Densitometrianalyse af proteinbånd blev målt ved Image J software og plottet som middelværdi + SEM. (C) AR-FL og (D) AR-V7 mRNA ekspressionsniveauer i forhold til 18rS blev bestemt ved real-time PCR. Resultaterne var fra tre uafhængige RNA-ekstraktioner med tredobbelte real-time PCR assays på hver RNA-prøve og plottet som middeltal + SEM. Students t-test blev udført sammenligning mellem køretøj og LY294002 /AZD5363 behandlinger med * som P 0,05; ** Som P 0,01 og *** som P . 0.001

LY294002 og AZD5363 påvirker AR gen transkriptionsinitiering, RNA splejsning og AR mRNA stabilitet

Virkningerne af LY294002 og AZD5363 på AR mRNA-niveauer kan være på flere mulige niveauer, herunder AR gen transkriptionsinitiering, præ-mRNA splejsning og AR mRNA nedbrydning. Brug nukleare run-on assay målte vi både AR og 18rS gen transskription initiation satser i tilstedeværelse af køretøj eller PI3K /AKT-hæmmere (fig. 5A). Den 18rS genet blev anvendt som en intern kontrol, som dens mRNA-niveauer ikke var påvirket af PI3K /AKT-hæmmere. Vi viste, at LY294002 inhiberes, mens AZD5363 forbedret AR gen transkriptionsinitiering satser i forhold til 18rS i både LNCaP og LNCaP95 celler. Desuden banker ned AKT ændrede ikke AR gen transskription satser.

(A) LNCaP og LNCaP95 celler blev behandlet med køretøjet, 50 uM LY294002 eller 5 uM AZD5363 i 18 timer (til venstre). LNCaP og LNCaP95 celler blev også transficeret med kontrol eller AKT1-3 siRNAs i 48 timer (til højre). Nukleare run-on blev udført som beskrevet i Materiale og metode sektion. (B) LNCaP og LNCaP95 celler blev transficeret med kontrol eller puljet siRNA for AKT 1-3 isoformer i 36 timer. Cell blev derefter yderligere behandlet med 50 uM LY294002 eller 5 uM AZD5363 i yderligere 18 timer. RNA-splejsning assays for AR-FL og AR-V7 blev målt som beskrevet i Materiale og metode sektion. (C) LNCaP og LNCaP95 celler blev forbehandlet med 2 uM actinomycin D i 2 timer. Celler blev derefter behandlet med vehikel, 50 uM LY294002 eller 5 uM AZD5363 i 0, 2, 4, 6, 8, og 16 timer. AR-FL og AR-V7 mRNA ekspressionsniveauer i forhold til 18rS blev bestemt ved real-time PCR. (D) LNCaP og LNCaP95 celler blev transficeret med kontrol eller puljet siRNA for AKT 1-3 isoformer i 36 timer. Celle blev forbehandlet med 2 uM Actinomycin D i 2 timer og derefter behandlet med vehikel, 50 uM LY294002 eller 5 uM AZD5363 i 6 timer. AR-FL og AR-V7 mRNA ekspressionsniveauer i forhold til 18rS blev bestemt ved real-time PCR. Resultaterne var fra tre uafhængige RNA-ekstraktioner med tredobbelte real-time PCR assays på hver RNA-prøve. En-vejs ANOVA efterfulgt af student t-test blev udført med * som P 0,05, ** som P 0,01 og *** som P . 0.001

For at måle

bona fide

effekter af LY294002 og AZD5363 på AR-FL og AR-V7 RNA splejsning, men udelukker deres indvirkning på AR gen transkriptionsinitiering, vi designet tre sæt primere til at måle de relative splejsning satser for AR-FL og AR-V7 . Da AR-V7 RNA-splejsning er en gensidigt udelukkende RNA-splejsning processen med exon 3b og exon 4 i AR præ-mRNA, et sæt primere dækker exon 3 og 4 krydset af AR-genet til måling AR-FL mRNA-niveauer, en sæt primere omfatter exon 3 og 3b for AR-V7 mRNA-niveauer, og det andet sæt primere er inden exon 2 og 3 for de samlede AR mRNA-niveauer. Vi viste, at AR-FL RNA splejsning ikke var påvirket af LY294002, AZD5363 eller AKT knockdown. Imidlertid LY294002 dramatisk hæmmet, mens AZD5363 steg AR-V7 splejsning i LNCaP95 celler (Fig. 5B). Ændringerne af AR-V7 splejsning fremkaldt af LY294002 eller AZD5363 blev ikke ændret i tilstedeværelse af AKT knockdown.

AR-FL og AR-V7 mRNA stabiliteter blev også undersøgt i LNCaP og LNCaP95 celler forbehandlet med actinomycin D (fig. 5C). LY294002 forbedret AR-FL og AR-V7 mRNA nedbrydning i LNCaP95 celler inden for 16 timer. AZD5363 forbedret AR-FL og eller AR-V7 mRNA nedbrydning i både LNCaP og LNCaP95 celler. Imidlertid blev konsekvenserne af LY294002 og AZD5363 på AR mRNA stabiliteter ikke påvirket af AKT knockdown (fig. 5D). Da de samlede mRNA-niveauer af AR-FL og AR-V7 i LNCaP og LNCaP95 celler blev forøget med AZD5363 (fig. 3), disse resultater viste, at virkningerne af AZD5363 på AR gentranskription initiering og RNA splejsning overvægtet dens virkninger til AR mRNA nedbrydning.

LY294002 og AZD5363 påvirker AR-FL og AR-V7 transkriptionel aktivitet

for yderligere at undersøge, om ændringer af AR-FL og AR-V7 protein niveauer ved LY294002 og AZD5363 ville påvirke AR transkriptionelle aktiviteter målte vi udtrykkene for to AR-FL regulerede gener (PSA og OPRK1) og en AR-V7 reguleret gen (UGT2b17). I begge LNCaP og VCap celler, AR-FL agonist R1881 stimuleret PSA-ekspression, hvilke handlinger blev undertrykt af LY294002 (fig. 6A-B). Derimod AZD5363 styrket R1881 effekt i opregulering PSA udtryk i LNCaP celler, men reducerede R1881 handling i VCap celler. Disse ændringer var konsekvent over for virkningerne af LY294002 og AZD5363 på AR-FL protein niveauer i disse celler. Ekspressionen af ​​OPRK1 genet blev undertrykt af ligand aktiverede AR-FL [39]. Behandling af LY294002 faldt AR-FL medieret inhibering at OPRK1 ekspression i begge LNCaP-celler (69% suppression reduceret til 35%) og VCAP celler (94% suppression reduceret til 42%). AZD5363 styrket AR-FL til undertrykkelse OPRK1 ekspression i LNCaP-celler (69% suppression steg til 79%), men reducerede AR-FL medieret hæmning af OPRK1 ekspression i VCap celler (94% suppression reduceret til 86%). Imidlertid blev begge virkninger af LY294002 og AZD5363 på PSA og OPRK1 udtryk ikke signifikant ændret af AKT knockdown. For at undersøge AR-V7 transkriptionel aktivitet, målt vi ekspressionen af ​​UGT2b17 i VCap og LNCaP95 celler, som blev behandlet med MDV3100 at blokere AR-FL-aktivitet. Både VCap og LNCaP95 celler udtrykker både AR-FL og AR-V7. Vi har tidligere påvist, at i nærvær af AR-FL funktionelle blokade blev opregulering af ekspression af UGT2b17 bestemt ved AR-V7 [27]. LY294002 inhiberede UGT2b17 ekspression i både LNCaP95 og VCAP celler (fig. 6C-D). AZD5363 stimuleret UGT2b17 udtryk i LNCaP celler, men reducerede dets ekspression i VCap celler. Disse ændringer i UGT2b17 genekspression var i overensstemmelse med AR-V7 protein niveauer under LY294002 og AZD5363 behandlinger. Imidlertid blev disse påvirkninger ikke ændret af AKT knockdown.

(A) LNCaP- og (B) VCAP celler blev transficeret med kontrol eller AKT1-3 siRNAs i 48 timer og behandles med køretøj eller en nM R1881. Celler blev også co-behandlet med vehikel, 50 uM LY294002 eller 5 uM AZD5363 i 18 timer. Real-time PCR-analyser målt PSA og OPRK1 mRNA-niveauer. (C) LNCaP95 og (D) VCAP celler blev transficeret med kontrol eller AKT1-3 siRNAs i 48 timer og behandlet med vehikel, 50 uM LY294002 eller 5 uM AZD5363 i nærvær af 5 pM MDV3100 i 18 timer. Real-time PCR-analyser målt UGT2b17 mRNA-niveauer. Resultaterne var fra tre uafhængige RNA-ekstraktioner med tredobbelte real-time PCR assays på hver RNA-prøve. Students t-test blev udført sammenligning mellem køretøj og LY294002 /AZD5363 behandlinger med * som P 0,05; ** Som P 0,01 og *** som P . 0.001

Diskussion

Aberrant aktivering af PI3K /AKT-vejen gennem enten genetiske eller epigenetiske mekanismer hyppigt forekommer i tumorer, rendering denne vej et attraktivt terapeutisk mål for et bredt spektrum af cancerformer. Mange inhibitorer er til rådighed til at blokere PI3K /AKT signalering og nogle er under tidlige kliniske forsøg. Men heterogenitet prostatakræft er en særlig funktion, som gør det svært at forudse, om hæmning af PI3K /AKT signalering ville gavne PCA patienter. Derudover kan mange mulige biologiske følgetilstande af PI3K /AKT hæmning yderligere underminere den potentielle terapeutiske gevinst. Denne undersøgelse har til formål at undersøge, om PI3K /AKT-hæmmere har nogen off-target effekter til AR genekspression i et panel af PCA cellelinier, der repræsenterer prostata tumorceller med en bred vifte af genetiske variationer. Det er vigtigt at dokumentere ekspressionsprofilen af ​​AR-FL og AR splejsningsvarianter under behandlinger af PI3K /AKT-inhibitorer, eftersom vedvarende AR ekspression og funktion er en af ​​de kritiske molekylære mekanismer, hvormed prostatatumorer fremskridt i CRPC. Vi rapporterede, at PI3K /AKT-hæmmere havde komplekse indvirkninger på AR genekspression, der var uafhængig til AKT, hvilket tyder på, at disse PI3K /AKT-hæmmere kan påvirke signalering ud over PI3K /AKT-vejen i PCA celler verserende på deres genetiske baggrunde. Disse off-target effekter advarede potentielle anvendelse af PI3K /AKT-hæmmere til visse, hvis ikke alle, PCA patientgrupper.

Off-target effekter af PI3K /AKT-hæmmere blevet veldokumenteret og gentagne gange observeret i denne undersøgelse. LY294002 og Wortmannin blev påvist at binde mange andre kinaser, som ikke var relateret til PI3K /AKT signalering [23], [24]. Det er derfor ikke overraskende, at LY294002 og Wortmannin havde vist dominerende negative effekter til AR genekspression selv under AKT knockdown tilstand. Selv om både BKM120 og AKTI dramatisk undertrykt AKT phosphorylering og aktivering, de ikke viser nogen konsekvenser for AR gen udtryk i alle fire PCA cellelinjer. Disse resultater udelukkede muligheden for, at aktiveringen af ​​AKT var direkte ansvarlig for ændringer af AR gen udtryk. De fungerede som negative kontroller for yderligere at støtte de off-target effekter af LY294002, Wortmannin og AZD5363 på AR gen udtryk. Interessant nok kan AZD5363 ændre AR-FL og AR-V7 udtryk verserende på den genetiske baggrund af PCA cellelinier. Men flere beviser allestedsnærværende angivet off-target effekter af AZD5363 til AR genekspression. Først selvom LNCaP og LNCaP95 celler udtrykker mutant PTEN og konstitutivt aktiv AKT, AZD5363 steget både AR-FL og AR-V7 udtryk, selv når endogene AKT blev væsentligt forarmet ved RNA silencing (fig. 4). Disse resultater viste, at den feedback aktiveringen af ​​AKT af AZD5363 ikke bidrog til ændringerne i AR udtryk. For det andet, VCAP og 22Rv1 celler udtrykker vildtype PTEN med lave /ikke-detekterbare niveauer af p-AKT i fravær af aktivering af de opstrøms tyrosinkinasereceptorer (fig. 1-2). Virkningerne af AZD5363 at reducere AR-FL og AR-V7 i VCAP og 22Rv1 linjer blev således ikke relateret til AKT aktivering. Sidst, kan AZD5363 forbedre AR gen transkriptionsinitiering (fig. 5A), RNA-splejsning af AR-V7 (fig. 5B), AR-FL og AR-V7 mRNA nedbrydning uafhængig til AKT knockdown (Fig. 5C-D).

Både AR og PI3K /AKT-signalering havde vist sig at være vigtigt for PCA celler til at udvikle terapi modstand. Udvikling af inhibitorer til disse signalering giver nye muligheder for PCA patienter. Den modvægt af disse muligheder er udfordringen for Intraindividuel PCa celle heterogenitet [40]. Flere kloner af kræftceller med forskellig genetisk baggrund kunne sameksistere i den samme patient [41]. Derfor en PI3K /AKT-inhibitor kunne være effektive til en population af kræftceller, men muligvis give væksten privilegium for andre gennem klonselektion proces. Co-targeting AR og PI3K /AKT veje kan være endnu mere udfordrende. Gensidig aktivering af AR og PI3K /AKT-signalering i prostatakræft kunne komplicere resultatet af PCA patienter, der modtager kombinatoriske behandlinger af AR og PI3K /AKT hæmning. Anti-androgener kan muligvis underminere effektiviteten af ​​PI3K /AKT-hæmmere. Omvendt kan PI3K /AKT-hæmmere modvirke effektiviteten af ​​anti-androgener. Nylige undersøgelser under anvendelse af PTEN knockout-musemodeller yderligere viste, at selv kastration følsomme tumorer svarede den AR og PI3K /AKT signalering, de afledte kastrationsresistent tumorer undergår fænotypisk plasticitet fører til øget intratumoral heterogenitet og tab af tumor uafhængighed til PI3K signalering [42]. Vores tidligere undersøgelser havde vist, at kastration betingelser inducerer AR gentransskription og RNA splejsning af AR-V7 [27]. Vi viste desuden her, at inhibitorer såsom AZD5363 kan øge AR gentranskription initiering og AR-V7 RNA splejsning. Co-behandling af anti-androgen og AZD5363 vil muligvis resultere i forøget AR-V7 udtryk og fremme AR-V7 drevne tumorer i en undergruppe af PCA patienter.

Sammenfattende vores undersøgelser vist PI3K /AKT-hæmmere har forskellige off-target effekter på AR gen udtryk i PCA celler med forskellige genetiske baggrunde. Denne information bør overvejes, når behandling PCA patienter med disse inhibitorer.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Information af antistoffer og primere anvendt i denne undersøgelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0108780.s001

(DOCX)