PLoS ONE: Den Side Befolkning i Human Lung Cancer Cell Linje NCI-H460 er beriget i Stem-Ligesom Cancer Cells

Abstrakt

Lungekræft er blandt de mest dødelige maligniteter med høj metastase og tilbagefald sats. Nylige undersøgelser viser, at tumorer indeholder en delmængde af stamceller-lignende cancerceller, der besidder visse stamcelle egenskaber. Heri anvendte vi Hoechst 33342 farvestof efflux assay og flowcytometri til at isolere og karakterisere den side befolkning (SP) celler fra human cellelinie lungecancer NCI-H460 (H460). Vi viser, at H460 SP celler huser stamceller-lignende celler som de let kan danne forankringsuafhængige flydende kugler, besidder stor proliferativ potentiale, og udvise forøget tumorigenicitet. Vigtigere, H460 SP-celler var i stand til at forny sig selv både in vitro og in vivo. Endelig viser vi, at H460 SP celler fortrinsvis udtrykker ABCG2 samt SMO, en kritisk mediator af Hedgehog (HH) signalering, som synes at spille en vigtig rolle i H460 lungekræft celler som sin blokering hjælp Cyclopamin høj grad hæmmer celle-cyklus progression. Kollektivt, vores resultater låne yderligere støtte til eksistensen af ​​lungekræft stamceller og også implicerer HH signalering i reguleringen store celle lungekræft (stængel) celler

Henvisning:. Shi Y, Fu X, Hua Y, Han Y, Lu Y, Wang J (2012) Den Side Befolkning i human Lung Cancer Cell Linje NCI-H460 er beriget i Stem-Ligesom cancerceller. PLoS ONE 7 (3): e33358. doi: 10,1371 /journal.pone.0033358

Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: September 8, 2011; Accepteret: 7 feb 2012; Udgivet: 13 Mar 2012

Copyright: © 2012 Shi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Key projekt fond af Shanghai Videnskab og Teknologi Association, Kina (Grant No.05119554). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Det har længe været klart, at de fleste tumorer er heterogene indeholdende et spektrum af fænotypisk forskellige celletyper. Arbejde i det seneste årti viser, at forskellige humane solide tumorer også indeholde funktionelt afvigende tumorceller med subpopulationer possesing høj tumorigent potentiale og at kunne rekonstruere fænotypiske og histologiske heterogenitet af moderselskabet tumor når transplanteret i immunsvækkede mus. Sådanne undergrupper af tumorceller, som har forbedret tumorigene kapacitet er blevet operationelt kaldt tumorfremkaldende celler eller cancer stamceller (CSC), som nu er blevet rapporteret i de fleste faste tumorer [1], [2]. De fleste CSCS er blevet identificeret, beriget og oprenset under anvendelse af enten celleoverflademarkør (s), blandt hvilke CD44 og CD133 er de mest populære, eller funktionelle assays, som omfatter side befolkning (SP) [3] – [6] og Aldeflour assays [7], [8]. SP strategi blev oprindeligt udviklet til at berige hæmatopoietiske stamceller [3], og er baseret på evnen af ​​stamceller, som overudtrykker afgiftende celleoverflade pumper ABCG2 og MDR1 (dvs. P-glycoprotein), for effektivt at udstrømning celle-permeable farvestof Hoechst 33342 og dermed på dobbelt bølgelængde FACS plot at præsentere som Hoechst-negativ population på “side” (eller på halen). The Aldeflour assay derimod, drager fordel af stamceller overudtrykker afgiftende enzymer aldehyddehydrogenaser (ALDH) [7], [8] og derfor CSC-berigede population kan mere effektivt metabolisere en eksperimentel ALDH substrat til at frigive mere fluorofor.

Lungekræft er den mest dødbringende malign verden. Arbejde i de sidste mange år viser, at både småcellet (SCLC) og ikke-småcellet (NSCLC) lungecancere indeholder stamceller-lignende cancerceller [9] – [29]. Som i de fleste andre tumorer, ‘lunge CSCS’ er blevet beriget og oprenset under anvendelse af celleoverflademarkører CD44 eller CD133 eller ved anvendelse af de to funktionelle assays nævnt ovenfor. Disse lung CSCS er blevet demonstreret at besidde høj klonale, klonogene og hyppigt, tumorigene potentiale og at være generelt modstandsdygtige over for terapeutiske behandlinger. De lungekræft stamceller er blevet rapporteret i langvarige kulturer samt i xenotransplantater og primære patient tumorer. Af interesse, en nylig undersøgelse anvende genetiske musemodeller for lungekræft viser, at lungetumorer med forskellige genetiske baggrunde har forskellige CSC fænotyper [30], øge muligheden at forskellige patientgrupper lungetumorer kan have forskellige CSC fænotyper. Selvom SP teknik har været ansat til at demonstrere CSCS i flere lungekræft-cellelinjer [10], [11], [13], [25], er det ikke vides, om alle patient tumorafledte lungekræft-cellelinjer i besiddelse af en SP, der er beriget i stamceller-lignende cancerceller. Her har vi en løsning af dette spørgsmål ved hjælp af humane store celle store carcinom line NCI-H460 (H460) og vores resultater viser, at H460 celler besidder en SP, der er beriget i tumor-initierende celler.

Resultater og Diskussion

dyrkede humane lungecancer-cellelinje NCI-H460 har en SP

Vi først farvet H460 celler med Hoechst 33342, som er aktivt ekstruderet af verapamil-følsomme ABC transportører i stamceller [3]. Når vi observerede de farvede celler under et fluorescensmikroskop, at størstedelen af ​​kerner, som forventet, forekom blå; imidlertid et lille antal kerner var negative for Hoechst-farvning (Fig 1, A og B,. pilene peger på en Hoechst-negativ celle). Vi kvantificeres derefter SP ved dobbelt bølgelængde flowcytometri [3] – [6], [10], [11], [13], [25]. Vi har registreret, i flere uafhængige H460 kulturer, en SP på 3,80 ± 0,5% (n = 9), som vist i fig. 1C. Vigtigt er det, blev SP fuldstændig elimineret i nærvær af verapamil (Fig. 1D), en calcium-kanal-blokker og en specifik hæmmer af ABCG2 og MDR1 anvendes i den kliniske behandling af lungecancer [31], hvilket indikerer specificiteten af ​​SP vi påvist i H460 celler.

A-B, Hoechst farvning af H460 celler. Bemærk, at selv om hovedparten af ​​cellerne blev farvet i kernen, nogle celler (angivet med pile) tilsyneladende manglede nukleart Hoechst-farvning. C-D, SP fænotyper i fravær (C) eller tilstedeværelse (D) af verapamil.

SP celler demonstrerer høj proliferativ potentiale og kan selv forny

Indtil nu mest stamceller-lignende celler har vist sig at have en evne til at danne frit flydende kugler i forankringsuafhængige vej [4] – [6], [10], [11], [13]. Endvidere er CSCS blevet rapporteret at besidde en høj proliferativ potentiale. At afgøre, om H460 SP-celler har lignende CSC-associerede egenskaber, vi først dyrket oprensede SP og ikke-SP-celler i serumfrit tilstand (se fremgangsmåder). Vi observerede, at H460 SP celler dannet typiske flydende kugler med en effektivitet på 4,8 ± 0,1% (fig. 2A), hvorimod de ikke-SP celler meste viste vedhængende vækstmønster (Fig. 2B) med meget lavere sfære-dannende kapacitet (0,8 ± 0,3%). CCK-8 proliferation eksperiment (se metode) viste også højere proliferativt potentiale i SP-celler sammenlignet med de ikke-SP-celler (fig. 2C). Når den primære SP celleafledte sfærer blev dissocieret og passeret, de let dannes sekundære kugler (data ikke vist). Når dissocierede primære SP sfærer blev dyrket i komplet medium indeholdende føtalt bovint serum (FBS) i en uge, blev nye SP-celler (6,2 ± 0,8%) detekteres med størstedelen celler er ikke-SP-celler (fig. 3A). Igen blev SP fænotype fuldstændigt blokeret i nærvær af verapamil (Fig. 3B). Disse resultater antyder, at SP-celler kan forny sig selv

in vitro

. Salg

A-B, renset SP og ikke-SP-celler blev dyrket i serumfrit medium i forankringsuafhængige betingelser. SP celler dannet typiske flydende kugler inden for 4 dage (A), mens ikke-SP celler stort set etablerede vedhængende vækst (B). C, SP celler viste højere proliferative evner end ikke-SP celler, som bestemt ved CCK-8 kit (

P

0,05 for alle tidspunkter, Student

t

-test).

A-B, SP fornyet analyse, når SP kugler var disaggregerede og dissocierede celler dyrket i normalt serum-holdigt medium i en uge. C-D, SP fornyet analyse i SP-celle-afledte tumorer. E-F, SP fornyet analyse i ikke-SP-celle-afledte tumorer. A, C, E, uden verapamil. B, D, F, med verapamil.

De H460 SP celler demonstrerer højere tumorigenicitet end tilsvarende ikke-SP celler

Den gyldne standard for analyse CSC ejendomme skal udføre begrænsende-fortynding tumor transplantationsforsøg [1], [2] og at sammenligne tumorgenicitet, almindeligvis målt ved tumorincidensen, latens (dvs. tiden mellem tumorcelleimplantation til, når tumorer kan først palperes), væksthastighed (dvs. tumorvolumen), og endpoint tumorvægt. Vi oprenset H460 SP og ikke-SP-celler og injiceres stigende antal celler i Matrigel subkutant (s.c.) i nonobese diabetic /svær kombineret immundefekt (NOD /SCID) mus (Fig. 4A). Vi fandt, at SP-celler udviste højere tumorigenicitet end ikke-SP-celler. For eksempel SP celler regenereret tumorer på det laveste celletal (dvs. 5000) implanteret mens de ikke-SP celler ikke regenerere nogen tumor på denne celle dosis (fig. 4A). SP celler regenereret 6/6 tumorer (dvs. 100%) hvorimod de ikke-SP celler gav anledning til 4/6 tumorer (67%;

P

= 0,039, Chi-Square test). Desuden SP-celler etablerede tumorer med en kortere latenstid end de tilsvarende ikke-SP-celler (figur 4A;.

P

= 0,007). Endvidere H460 SP-celle-afledte tumorer voksede hurtigere fører til langt større tumorer end ikke-SP celleafledt tumorer (Fig 4A-C;.

P

0,01). Histologisk de regenererede xenotransplantattumorer havde morfologiske karakteristika af store celle lungekræft. Især SP tumorer viste overflod af celler og mitotiske tal og viste tydeligt kapsulært invasion (fig. 4D, venstre). I modsætning hertil ikke-SP tumorer udviste mere nekrotiske områder (fig. 4D, højre).

A, tabel præsentation af tumorigene potentiale H460 SP og ikke-SP-celler. Tre parametre for tumorgenicitet, dvs. tumorincidensen, ventetid, og volumen (*

P

0,01) blev vist. Alle dyr blev afsluttet (term.) 28 dage efter implantation. B, SP-celler regenereret større tumorer end tilsvarende ikke-SP-celler ved hver celledosis. C, Gross tumor billeder, når tumorer blev høstet på dag 28 efter subkutan injektion af SP og ikke-SP celler i NOD /SCID-mus. D, repræsentant HE-farvede mikrofotografier af SP og ikke-SP tumorer.

Det var overraskende og potentielt interessant, at de ikke-SP-celler, ved 50.000 og 100.000, også regenereres tumorer selv tumorerne var mindre (fig. 4B-C). Da de ikke-SP celler ikke danne tumorer på 5.000 celler (fig. 4A), ville den nemmeste forklaring være, at den ikke-SP cellepopulation kan være kontamineret med et lille antal af SP-celler, hvilket ville give anledning til tumorer, når de store antal ikke-SP-celler blev implanteret. Alternativt kan ikke-SP-celler kunne “de-differentiere præcis til SP-celler ved en lav hastighed, at in vivo nogle ikke-SP-celler blev omdannet til SP-celler, som derefter førte til tumorer. Sidstnævnte scenario blev for nylig påvist af andre i flere dyrkede tumorcellelinier systemer [32]. At begynde at udforske disse forskellige muligheder, vi analyserede SP sammensætning i både SP og ikke-SP-celle afledt H460 tumorer. Vi observerede, at SP tumorer indeholdt 8,4 ± 0,6% SP-celler (fig. 3C-D), mens de ikke-SP tumorer indeholdt 1,4 ± 0,2% SP-celler (fig. 3E-F). Selv om disse resultater ikke helt kunne skelne forurening fra konvertering, de give en forklaring på, hvorfor de ikke-SP celler gav stadig anledning til tumorer – det var fordi de ikke-SP tumorer indeholdt SP celler

Den stamcelle. markører ABCG2 og SMO er højt udtrykt i SP celler

SP fænotype i bloddannende stamceller medieres primært af ABCG2 med nogle inddragelse af MDR1 eller multiresistens protein 1 [31]. Mange CSC-beriget SP overekspression ABCG2 [4], [6]. Vi analyserede derfor ABCG2 mRNA-niveauer og observeret, at, i forhold til almindelige FBS-dyrkede monolag H460 celler (fig. 5A, bane 1), begge kugler (fig. 5A, bane 2) og renset SP-celler (fig. 5A, bane 3) udtrykt markant forøgede ABCG2 mRNA niveauer mens oprensede ikke-SP H460 celler næsten manglede ABCG2 udtryk (fig. 5A, bane 4). Ligeledes SP tumorer (fig. 5A, bane 7) udtrykte også højere niveauer af ABCG2 end tilsvarende ikke-SP tumorer (fig. 5A, bane 8). En kvantitativ præsentation blev vist i fig. 5B.

A, repræsentant RT-PCR gel billeder. M, markør; bane 1, NCI H460-celler, der normalt dyrket i serumholdigt medium; bane 2, H460 sfærer; bane 3, oprenset SP-celler; bane 4, oprenset ikke-SP-celler; bane 5, den Tomatidine kontrolgruppen; bane 6, den Cyclopamin forsøgsgruppe; bane 7, SP tumorer; bane 8, ikke-SP tumorer. B, Kvantitativ præsentation af ABCG2 og SMO mRNA-niveauer som bestemt ved densitometri (

P

0,001, undtagen ABCG2 mRNA bane 6 vs. bane 8 og SMO mRNA bane 1 vs. bane 5 og bane 4 vs. vognbane 6).

Tumordannende lungecancerceller herunder SP-celler har vist sig fortrinsvis at udtrykke selvfornyelse molekyler, såsom Oct-4, Nanog, BMI-1, og c-Kit [14], [ ,,,0],16], [17], [22], [29], Notch signalering komponenter [18], [28] og Wnt /β-catenin [23]. Nye beviser tyder på, at Hedgehog (HH) signalvejen kan også være tæt involveret i lungekræft udvikling og progression [33], [34]. Aktivering af HH signalering kræver transmembrane protein Smoothened (SMO) som en kritisk mediator af HH signalering [35] og ABCG2 kan handle i den opstrøms regulering af Hh signalvejen for at beskytte stemness af SP rummet [36]. Vi bestemt derfor mRNA niveauerne af SMO i det samme sæt af prøver, der blev anvendt til ABCG2 analyse. Slående, meget ligesom ABCG2, de SMO mRNA niveauer blev signifikant forhøjet i H460 sfærer, SP-celler og SP-celle-afledte tumorer (fig. 5A-B). Til vores viden, kan dette fund repræsenterer den allerførste til at linke SMO overekspression til CSC-berigede lunge kræftceller.

Markedsobservatoriet inhibitor Cyclopamin hæmmer H460 celledeling

HH signalvej har været impliceret i opretholdelsen af ​​stam- eller progenitorceller i mange voksne væv. Denne vej regulerer celleproliferation, væv polaritet, og celledifferentiering under normal udvikling. Vigtigere, abnorm HH baneaktivering, såsom high-niveauer af SMO ekspression, kan spille en rolle i opretholdelsen af ​​kapaciteten af ​​tumor stamceller, begunstige selvfornyelse, og proliferation af deres afkom [36], [37]. For at bestemme om HH signalering spiller en rolle i H460 celler anvendte vi Cyclopamin, et steroidt alkaloid, der inhiberer SMO aktivitet. Som en kontrol for Cyclopamin, brugte vi et strukturelt beslægtet alkaloid, Tomatidine, der ikke påvirker SMO aktivitet og HH signalering. Sammenlignet med Tomatidine, Cyclopamin syntes at reducere de lave endogene niveauer af SMO mRNA (fig. 5A, bane 5 og 6). Sammenlignet med kontrollen køretøjet og Tomatidine gruppe, Cyclopamin dosis- og tidsafhængigt hæmmede væksten af ​​H460-celler, når de anvendes ved 2-40 pmol /L (fig. 6A-E). Celle-cyklus analyse viste, at Cyclopamin, ved 20 umol /L, tidsafhængigt forårsaget H460 celler til standsning i G1 /S-fasen af ​​cellens cyklus (fig. 6F). Konkret Cyclopamin behandling øgede G1 celler fra ~71% ved 24 timer til ~93% ved 96 timer mens faldt S-fase celler fra 18% ved 24 timer til 2% ved 96 h (fig. 6F). Efter 96 timer, let øget apoptose (dvs. ~ 2%) blev også observeret (Fig. 6F). Det skal bemærkes, at begge køretøjer og Tomatidine kontrolgrupper viste også tidsafhængige stigninger i G1-fase celler og tid-relateret fald i S-fase celler (fig. 6F), sandsynligvis på grund af det faktum, at alle celler blev dyrket i op til 96 timer uden påfyldning medier. Derfor konsumption af vækstfaktorer og næringsstoffer forårsaget delcelle-cellecyklusstandsnings i kontrolgrupperne. Sammen disse resultater viser, at HH-signalering er afgørende i H460 celler og blokade af HH signalering dramatisk forårsager celle-cyklus anholdelse. Da SMO fortrinsvis udtrykkes i CSC-beriget SP og kugler (fig. 5), vi formode, at HH signalering pålægger dens virkninger sandsynligvis på lunge CSCS.

A-C, Repræsentative mikrofotografier af H460 celler 72 timer efter behandling med vehikelkontrol (A), Tomatidine (B), eller Cyclopamin (C). Originale maginifications: × 200. D, Cyclopamin dosisafhængig hæmmede H460 celleproliferation (

P

0,05; envejs ANOVA). E, Tidsforløb for Cyclopamin hæmning af H460 celler (

P

0,05, envejs ANOVA). Cyclopamin blev anvendt ved 20 umol /L. F, Virkninger af Cyclopamin på cellens cyklus af H460-celler.

Sammenfattende i denne undersøgelse præsenterer vi beviser, at H460 humane stor-cellet lungecarcinom-cellelinje indeholder en detekterbar SP. Yderligere viser vi, at de H460 SP celler huser stamceller-lignende celler som de let kan danne forankringsuafhængige flydende kugler, besidder stor proliferativ potentiale, og udvise forøget tumor-regenererende kapacitet. Vigtigere, H460 SP-celler synes at være i stand til at forny sig selv in vitro (vist ved genudplade sphere celler i regulært dyrkningsmedium;. Figur 3A) og in vivo (fremgår af SP tumorer indeholdende en lille procentdel af SP-celler med flertallet er ikke-SP celler;. figur 3C). Endelig viser vi, at de H460 SP-celler fortrinsvis udtrykker ABCG2 samt SMO, en kritisk mediator af HH signalering, som synes at spille en vigtig rolle i H460 lungecancerceller som dens blokering hjælp Cyclopamin spænder inhiberer cellecyklusfremadskriden. Kollektivt vores resultater tilvejebringer yderligere støtte til tilstedeværelsen af ​​stamceller-lignende cancerceller i dyrkede lunge cancercellelinjer og også implicere HH signalering i reguleringen stor-cellet lungecancer (stamceller) celler.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle etiske retningslinjer. Alle dyrerelaterede studier blev godkendt af Tongji Universitet Institutional IACUC udvalg. NOD /SCID-mus (tilladelsen nummer: SYXK20070005) ved SPF niveau blev anvendt til tumorcelleimplantation eksperimenter i dette studie. Alle andre undersøgelser præsenteres heri, blev investigator-initieret og ikke kræver godkendelse fra andre tilsynsmyndigheder.

Cellelinjer og dyr

Menneskelig store celle lungekræft cellelinje NCI-H460 blev købt fra Shanghai Institutes for Biologisk Institut, CAS (Shanghai, Kina) og vedligeholdes i anbefalet af ATCC medium. Alle medier blev suppleret med 1% penicillin /streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen-Life Technologies). Celler blev inkuberet i en fugtig inkubator ved 37 ° C forsynet med 5% CO2. Celler blev rutinemæssigt opretholdt i 75-cm

2 vævskulturkolber (Corning Incorporated, USA) og høstet ved anvendelse af 0,25% trypsin, når de var i logaritmisk vækstfase for SP-analyse. Den nonobese diabetiske /svær kombineret immundefekt (NOD /SCID) mus blev købt fra Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd.

SP analyse

Den grundlæggende protokol var baseret på Goodell et al [3 ]. Kort fortalt blev NCI-H460 celler resuspenderet ved 1 x 10

6 /ml i forvarmet DMEM (Invitrogen-Life Technologies). Hoechst 33342 farvestof blev tilsat ved en endelig koncentration på 5 ug /ml i nærvær eller fravær af verepamil (50 pmol /l; Sigma), og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 90 min med intermitterende rystning. Ved slutningen af ​​inkubationen blev cellerne vasket med iskold HBSS (Invitrogen-Life Technologies), centrifugeret ned ved 4 ° C og resuspenderes i iskold HBSS. Propidiumiodid (Sigma) i en endelig koncentration på 2 ug /ml blev tilsat til cellerne til gate levedygtige celler. De cellepræparater blev filtreret gennem et 40 um cellefilter til opnåelse enkelt cellesuspension. Flowcytometrisk analyse og sortering blev udført på en Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS, Beckman Coulter Epics Altra).

tumorcelleimplantation eksperimenter

FACS-oprensede SP og ikke-SP H460 celler blev mixted med Matrigel (Becton Dickinson), og derefter subkutant (sc) injiceret i NOD /SCID-mus. Grupper af mus blev podet med SP-celler eller ikke-SP-celler ved 5 x 10

3, 5 × 10

4 og 1 x 10

5 hhv. Tumorvækst blev overvåget på ugebasis og individuelle tumorvolumener blev målt ved anvendelse af en digital skydelære og tilnærmes efter formlen V = 1 /2ab

2 (a er den lange diameter og b den korte diameter af tumoren). I slutningen af ​​eksperimenterne blev mus aflivet efter 4 uger og tumorer høstet, målt, og fotograferet. De indre organer såsom lunge og lever blev omhyggeligt observeret for metastase knuder og tumor sektioner blev gennemgået under mikroskopet. Endelig blev tumorer også fordøjet at lave enkelt-celle suspension til SP re-analyse.

Sphere dannelse analyser i serum-fri kulturer

SP og ikke-SP celler blev dyrket i serum- frit DMEM-F12 (Invitrogen-Life Technologies) suppleret med 20 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF), 10 ng /mL basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF), 5 ug /ml insulin (alle fra Sigma). Celler (1000 /brønd) blev udpladet i 96-brønds dyrkningsskåle i 200 pi vækstmedium og 20 pi medium per brønd blev tilsat hver 2 dage. Antallet af kugler (Φ 150 um) for hver brønd blev bedømt efter 5 dages dyrkning

RT-PCR-analyse

Celler blev høstet og totalt RNA blev ekstraheret og forberedt til RT-. PCR ved anvendelse af en PrimeScript ™ RT-PCR Kit (Takara, Kyoto, Japan). Cycle parametre for ABCG2, SMO, og GAPDH cDNA’er var 30 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 58 ° C (for ABCG2 og GAPDH) eller 55 ° C (for SMO), og 45 sekunder ved 72 ° C i 35 cykler, henholdsvis. Primerne til RT-PCR var som følger: ABCG2 (F) 5′-CACCTTATTGGCCTCAGGAA-3 ‘, ABCG2 (R) 5′-CCTGCTTGGAAGGCTCTATG-3′, SMO (F) 5’-TTACCTTCAGCTGCCACTTCTACG-3 ‘, SMO (R) 5’-GCCTTGGCAATCATCTTGCTCTTC-3 ‘, GAPDH (F) 5′-ACGACCACTTTGTCAAGCTC-3′, og GAPDH (R) 5’-GGTCTACATGGCAACTGTGA-3 ‘.

celleproliferationsassay

Celleproliferation assays blev udført ved anvendelse af Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan). Celler blev udpladet i 96-brønds plader med 5 × 10

4 celler per brønd og dyrkedes i vækstmediet. Cyclopamin og Tomatidine (alle fra Sigma) blev tilsat henholdsvis ved en koncentration på 20 pmol /L og passende vækstmedium blev tilsat i kontrolprøver. CCK-8 blev tilsat i hver brønd ved 24, 48, 72 og 96 timer, og efter yderligere 4-h kultur, Absorbansen af ​​hver brønd blev bestemt og vækstkurven blev plottet. De celle-cyklus-profiler blev analyseret ved flowcytometri.

Statistisk analyse

Data blev generelt præsenteret som middelværdien ± SD og statistiske forskelle mellem eksperimentelle grupper blev analyseret ved Students

t-

test, envejs ANOVA, eller lineær regression ved anvendelse statistisk software SPSS11.5 og efter arten af ​​data analyseres. En

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant i alle tilfælde

Tak

Vi er taknemmelige for Dr. Guoping Zhang (fra Institutes of Biomedicinsk Institut, Fudan University, Shanghai, Kina) som hjælp til flowcytometri målinger.