PLoS ONE: Heat-modificerede Citrus Pektin fremkalder apoptose-Ligesom celledød og Autophagy i HepG2 og A549 Cancer Cells

Abstrakte

Kræft er stadig en af ​​de førende dødsårsager på verdensplan, og finde nye behandlinger fortsat en stor udfordring. Tidligere undersøgelser har vist, at modificerede former af pektin, et komplekst polysaccharid stede i den primære plantecellevægge, besidder anticancer egenskaber. Ikke desto mindre er virkningsmekanismen af ​​modificeret pectin og de involverede veje er uklare. Her viser vi, at citruspectin modificeret ved varmebehandling induceret celledød i HepG2 og A549-celler. Den inducerede celledød afviger fra klassisk apoptose fordi ingen DNA-spaltning blev observeret. Desuden Z-VAD-fmk, en pan-caspaseinhibitor, påvirkede ikke den observerede celledød i HepG2-celler, men syntes at være delvist beskyttende i A549-celler, hvilket indikerer, at varme-modificeret citrus pektin kan inducere caspase-uafhængig celledød. En stigning i overflod af phosphatidylethanolamin-konjugeret Light Chain 3 (LC3) protein og et fald i P62 protein overflod blev observeret i begge celletyper, når de inkuberes i nærvær af varme-modificeret citrus pektin. Disse resultater indikerer aktiveringen af ​​autofagi. Så vidt vi ved, er dette den første gang, at autofagi er blevet åbenbaret i celler inkuberet i nærvær af en modificeret form af pektin. Denne autophagy aktivering synes at være beskyttende, i det mindste for A549-celler, fordi dets inhibering med 3-methyladenin forøgede den observerede modificerede pectin-induceret cytotoksicitet. Denne undersøgelse bekræfter potentialet af modificeret pectin at forbedre kemoterapeutiske kræftbehandling

Henvisning:. Leclere L, Fransolet M, Cote F, Cambier P, Arnould T, Van Cutsem P, et al. (2015) Heat-modificerede Citrus Pektin fremkalder apoptose-Ligesom celledød og Autophagy i HepG2 og A549 kræftceller. PLoS ONE 10 (3): e0115831. doi: 10,1371 /journal.pone.0115831

Academic Redaktør: Daolin Tang, University of Pittsburgh, UNITED STATES

Modtaget: August 11, 2014 Accepteret: December 2, 2014; Udgivet: 20 Marts 2015

Copyright: © 2015 Leclere et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. L. Leclere var modtageren af ​​en Fria fællesskab (Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Landbrug, Bruxelles, Belgien) . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Kræft er fortsat en af ​​de førende dødsårsager på verdensplan. På trods af en lang række terapeutiske fremgangsmåder, kræft ikke let kureres, og mange cancertyper stadig har en lav hærdehastighed. Selvom afgørende for behandling, kemoterapi og strålebehandling er også kilder til mange bivirkninger, og kirurgi kan undertiden glip metastaser. Disse er grundene til, at udviklingen af ​​nye behandlingsformer til at forbedre eksisterende behandlinger er en stor udfordring. Naturlige forbindelser og fytokemikalier har for nylig opnået stor interesse for deres evne til at modulere de signalveje, der er involveret i kræft spredning og metastaser eller for deres beskyttende potentiale i strålebehandling, som revideret ved Hazra [1].

Pectiner er rigelige og komplekse komponenter af det primære plante cellevæggen og er velkendte som kostfibre. Pektin polysaccharider indbefatter homogalacturonan (HG), substituerede galacturonaner, rhamnogalacturonan-I (RG-I) og rhamnogalacturonan-II (RG-II). HG er en polymer af α-1,4-bundet-D-galacturonsyre, og HG-rester kan være methyl-esterificeret ved C-6 carboxyl eller acetyleret ved O-2 eller O-3, afhængigt af pectin kilde. Rygraden i HG er covalent tværbundet til RG-I og RG-II. RG-I er en forgrenet polymer med en rygrad af disaccharid (α-1,4-D-GalA- α-1,2-LRha) gentages ved hvilken rHA-rester kan være substitueret med β-1,4-galactan, forgrenet arabinan og /eller arabinogalactan sidekæder. Strukturen af ​​RG-II er meget kompleks: sidekæderne er bundet til en rygrad af HG, og disse komplekse sidekæder er sammensat af 12 typer af glycosylrester knyttet sammen af ​​mindst 22 forskellige glycosidbindinger [2,3]

Flere in vitro-undersøgelser har vist, at forskellige former for modificeret pektin har antitumor egenskaber (for en gennemgang, se [4]). RG-I-regionen i okra pectin reducerer proliferation og inducerer apoptose i melanomceller [5], og pektin oligosaccharider også inducere apoptose i myelomaceller [6]. Jackson

et al

viste, at forskellige fragmentering protokoller pektin kan føre til forskelle i pektin apoptose-inducerende aktivitet, og at fragmenterede pektin har en cytotoksisk effekt i androgen-afhængige og -uafhængige prostata kræftceller. Endvidere viste disse forfattere, at pH-modificeret citrus pektin havde ringe eller ingen apoptotisk aktivitet [7].

In vivo

, det har vist sig, at angelan, en pectin-afledt polysaccharid, kunne forhindre melanoma cellevækst og metastase, og angelan blev også rapporteret at være en immunmodulator, som øger immunsystemets funktion af B-celler, makrofager og naturlige dræberceller [8]. Oral indtagelse af opløselige pectin fragmenter hæmmer væksten og metastasen af ​​transplanterede tumorer i mus [9,10], og det har vist sig, at modificerede citruspectin hæmmer væksten af ​​tyktarmskræft og levermetastaser [11]. Men de mekanismer, som ændret, pektin udøver disse effekter er ikke kendt

Formålet med denne undersøgelse er at karakterisere de cytotoksiske virkninger af varme-fragmenteret citrus pektin (HFCP) på to tumorcellelinier:. HepG2 celler fra humane leverkarcinom og A549-celler fra humant lungecarcinom. Vi rapporterer, at varme-fragmenteret citrus pektin inducerer en apoptotisk-lignende celledød, der er delvis caspase-uafhængig og aktiverer autofagi i disse to cellelinjer.

Materialer og metoder

Fraktionering af citrus pektin ved varmebehandling

Heat-fragmenteret citruspectin (HFCP) blev opnået ifølge fremgangsmåden beskrevet af Jackson

metode et al

[7]. En opløsning af 0,1% af citruspectin (Sigma P9135, som består hovedsagelig af homopolygalacturonic syre) i dobbeltdestilleret vand blev opvarmet i 60 minutter ved 123 ° C og under et tryk på 17,2 til 21,7 psi. Opløsningen blev derefter nedfrosset ved -80 ° C og lyofiliseret. Det tørre materiale blev opbevaret ved 4 ° C. Friske opløsninger i dyrkningsmedium blev fremstillet lige før tilsætning til cellerne i inkubationerne.

Cellekultur og pektin inkubation

HepG2, A549, MCF-7 og MCF10A-celler blev opnået fra American Type Culture Collection HepG2-celler og MCF-7-celler blev dyrket i DMEM-medium (Gibco 31.825-023) og A549-celler i MEM-medium (Gibco 41.090-028). Til rutinemæssig dyrkning blev mediet suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco 10270), og cellerne blev holdt ved 37 ° C i en atmosfære af 95% luft og 5% CO

2. MCF10A celler blev dyrket i DMEM /F12-medium (Gibco 11.320-074) indeholdende 5% hesteserum (Gibco 16.050-122), 20 ug /ml EGF, 0,5 ug /ml hydrocortison, 10 ug /ml insulin og 100 ng /ml kolera toksin. Til behandling blev cellerne lodes adhærere i 24 timer efter podning. Mediet blev fjernet, og cellerne blev vasket to gange med PBS (Lonza BE17-516F) og anbragt i et medium uden serum indeholdende følgende: 3 mg /ml filtersteriliseret HFCP, 3 mg /ml filtersteriliseret citruspectin 3 mg /ml eller 50 pM etoposid, anvendt som en positiv kontrol. Negative kontroller var celler inkuberet i medium alene. I nogle eksperimenter, når indiceret, staurosporin (Sigma S4400), pan-caspaseinhibitor Z-VAD-fmk (BD Pharmingen 550.377), 3-methyladenin (Sigma M9281) eller bafilomycin (Sigma B1793) blev tilsat på samme tid som etoposid, HFCP eller pektin.

Cellelevedygtighed assay

HepG2-celler blev podet ved 50 000 celler /brønd og A549-celler ved 30 000 celler /brønd i plader med 24 brønde før behandlinger for 6, 24 eller 48 timer. MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazoliumbromid, Sigma M2128) opløsning blev fremstillet ved en koncentration på 2,5 mg /ml i phosphatbufret saltvand, og 500 pi blev tilsat per brønd . Efter 2 timer ved 37 ° C og 5% CO

2 atmosfære, mediet og MTT-opløsning blev fjernet før tilsætning af lysepuffer. Den optiske densitet blev målt 1 time senere ved 570 nm under anvendelse af en mikroplade-spektrofotometer (Bio-Rad x Mark Microplate spektrofotometer) og

Microplate Manager 6

software.

cellecytotoksicitetsassay

HepG2-celler blev podet ved 50 000 celler /brønd og A549-celler ved 30 000 celler /brønd i plader med 24 brønde før inkubation i 24 eller 48 timer. For hver brønd, blev laktat dehydrogenase aktivitet målt i supernatanten, i løsnede celler og i adhærente celler efter lysis i PBS indeholdende 10% Triton X-100 (Merck 9036-19-5). Lactat dehydrogenase-aktivitet blev detekteret ved et kolorimetrisk assay under anvendelse af en cytotoksicitet kit (Roche 11644 793 001) og en mikroplade-spektrofotometer. Cytotoksicitet procentdele blev beregnet som forholdet mellem mængden af ​​LDH til stede i supernatanten og i de løsnede celler i den samlede mængde LDH, som i den følgende formel: 100 * (a + b) /(a ​​+ b + c), hvor a = supernatant LDH; b = løsnede celler LDH; c = adhærerende celler LDH.

DNA fragmentation assay

HepG2-celler blev podet ved 50 000 celler /brønd og A549-celler ved 30 000 celler /brønd i plader med 24 brønde før inkubering i 6, 24 eller 48 timer. En celledød detektering ELISA (Roche 11 544 675 001) blev udført ifølge producentens anvisninger. Absorbansen blev målt ved anvendelse af et spektrofotometer ved 405 nm. Normalisering for proteinindholdet fra søskende plader bestemt under anvendelse af Pierce-reagenset blev udført.

Caspase-3 aktivitet

HepG2 og A549-celler blev podet ved 600 000 celler /brønd i 6-brønds plader før behandlinger af 24 eller 48 timer. Cellerne blev høstet på is i PBS og centrifugeret ved 4 ° C ved 1000 x g i 5 min. Cellepellets blev homogeniseret i lyseringspuffer i 15 minutter ved 4 ° C, og de opløselige proteiner blev opsamlet ved centrifugering ved 4 ° C. Prøver blev fremstillet til opnåelse af 20 ug af proteiner pr 100 pi destilleret vand, hvortil 50 pi reaktionsbuffer og 1 pi Ac-DEVD-AFC substrat blev tilsat. Prøverne blev inkuberet ved 37 ° C i 60 min, og fluorescens blev detekteret ved 505 nm efter excitation ved 400 nm under anvendelse af et Fluoroscan. Analysen for caspase-3-aktivitet blev udført ifølge Cosse

et al

[12].

Western blot-analyse

Cellelysater fremstilledes i lysepuffer (40 mM Tris ; pH 7,5, 150 mM KCI, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100) indeholdende en proteasehæmmer cocktail (Complete fra Roche Molecular Biochemicals; 1 tablet i 2 ml H

2O, tilsat ved en 1: 25-fortynding ) og phosphatase inhibitor puffer (25 mM Navo

3, 250 mM PNPP, 250 mM α-glycerophosphat og 125 mM NaF, ved en 1: 25-fortynding) ifølge Cosse

et al

[12]. Mediet blev centrifugeret, og pelleterede celler blev tilsat til cellelysater. Lysaterne blev derefter centrifugeret ved 12 000 x g i 5 minutter, og supernatanterne blev opsamlet. Proteinerne (15 ug) blev denatureret ved tilsætning af LDS prøvebuffer (Invitrogen NP0007) og opvarmet til 70 ° C i 10 minutter. Proteinerne blev opløst på en 4-12% NuPAGE (Invitrogen) gel og overført til en lav-fluorescens membran (Millipore IPFL00010). Membranerne blev holdt i 1 time i LiCor blokeringsopløsning og probet natten over med enten et anti-caspase-3 kaninantistof (Cell Signaling # 9662S), som genkender fuldlængde og spaltede former af caspase-3 ved en fortynding på 1/500 , et anti-PARP muse-antistof (BD Biosciences # 551.024) ved en fortynding på 1/1000, et anti-caspase-8 muse-antistof (Cell Signaling # 97465) ved en fortynding på 1/1000, et muse-anti-ubiquitin antistof ( LifeSensor VU101) ved en fortynding på 1/1000, et anti-LC3 muse-antistof (NanoTools 0260-100 /LC3-2G6) ved en fortynding på 1/600 eller et anti-P62 muse-antistof (AB Nova # H00008878-M03) ved en fortynding af 1/500. En anti-ß-actin museantistof (Sigma T5168) blev anvendt i en fortynding på 1/30 000 for ß-actin immundetektion som en loading kontrol. Alle antistoffer blev fortyndet i LiCor opløsning indeholdende 0,1% Tween 20 (Sigma P1379). Membranerne blev skyllet med PBS + 0,1% Tween 20 og inkuberet med fluorochrom-konjugeret anti-mus eller anti-kanin-antistoffer (BD Bioscience # 926 til 32.221) ved en fortynding på 1/10 000 i 1 time i mørke ved stuetemperatur . For anti-ubiquitin mærkning blev membranerne vasket i PBS efter overførsel, fikseret i PBS indeholdende 0,5% glutaraldehyd (pH 7) og skyllet tre gange i PBS før blokering. Membranerne blev skyllet en gang mere med PBS + 0,1% Tween 20 og tørres, inden de scannes og analyseres ved anvendelse Odyssey software.

Immunofluorescens mærkning

HepG2-celler blev podet ved 50 000 celler /brønd og A549 celler ved 30 000 celler /brønd i plader med 24 brønde 24 timer før inkubation med HFCP, pectin eller etoposid i 24 timer. Efter inkubation blev cellerne fikseret og permeabiliseret i 10 minutter med en kold opløsning af 80% methanol og 20% ​​acetone, skyllet tre gange med PBS-2% BSA og inkuberet i 2 timer med primære antistoffer. Det primære antistof til LC3-farvning var kanin-anti-LC3 (L7543 Sigma) (1/250 fortynding), og det primære antistof til LAMP1 farvning var muse-anti-LAMP1 (H4A3 modtaget fra August Hildreth, Baltimore [13]). Cellerne blev vasket tre gange med PBS-2% BSA og derefter inkuberet i 1 time med de sekundære antistoffer. Alexa Fluor-488-konjugeret anti-kanin IgG-antistof og Alexa Fluor-568-konjugeret anti-muse-IgG-antistof (Molecular Probes) blev anvendt ved 1/1000 fortynding. Efter 1 time inkubation blev cellerne skyllet tre gange med PBS. For nuklear mærkning blev cellerne inkuberet i 30 min med TOPRO-3 (Molecular Probes, dil. 1/80) i nærvær af 2 mg /ml RNAse og derefter skyllet tre gange med PBS. Endelig blev dækglas monteret under anvendelse af Mowiol (Sigma, St. Louis, USA), og cellerne blev iagttaget med et fluorescerende konfokalt mikroskop (Leica SP5). Salg

Resultater

Heat-fragmenteret citruspectin inducerer HepG2 og A549 celledød

at studere celledød-fremkaldende virkninger af HFCP, to cancer cellelinjer, HepG2 og A549 celler, blev udsat for forskellige tidsperioder til HFCP. Koncentrationen af ​​3 mg /ml blev valgt efter afprøvning flere koncentrationer af HFCP på begge celletyper i 24 timer (S1 Fig.). Etoposid i en koncentration på 50 uM blev anvendt som en positiv kontrol. Cellemorfologi analyseret under anvendelse fasekontrastmikroskopi viste, at etoposid inducerer en svag dødelighed i A549-celler, hvorimod HepG2-celler syntes at være mere følsomme over dette stof. Endvidere celledød øges med inkubationstiden. HFCP i en koncentration på 3 mg /ml inducerede også celledød i begge celletyper, men i langt højere grad end etoposid i en koncentration på 50 uM; dens virkning var også tidsafhængige. Omvendt umodificeret pectin ved en koncentration på 3 mg /ml ikke påvirkede cellemorfologi (S2 fig.).

MTT-assays blev udført efter 24 og 48 timer (fig. 1A og 1B). Resultaterne viste, at HFCP faldt levedygtighed HepG2 og A549-celler ved begge inkuberingstider, mens umodificeret citruspectin ikke gjorde. HFCP toksicitet øges med inkubationstiden og var mere alvorlig end induceret af etoposid, især for HepG2-celler. For at bekræfte disse data blev LDH-frigivelse analyseret efter 24 og 48 timer (fig. 1C og 1D), og resultaterne bekræftede den cytotoksiske virkning af HFCP på HepG2 og A549-celler, med en stærkere virkning på den tidligere.

HepG2-celler og A549-celler blev inkuberet med medium alene (Ctl-), 50 pM etoposid (Etop), 3 mg /ml varme-fragmenteret citruspectin (HFCP) eller 3 mg /ml citruspectin (pektin). (A) og (B) Cellelevedygtighed blev analyseret med MTT-assayet i HepG2-celler (A) og A549-celler (B) efter 24 og 48 timer. (C) og (D) Cytotoksicitet blev analyseret i HepG2-celler (C) og A549-celler (D) under anvendelse af en LDH cytotoksicitet afsløring kit efter 24 og 48 timers inkubation. Dataene er de hjælp af mindst 3 gentagelser fra uafhængige forsøg, hver udført i tre eksemplarer +/- SD (n = 3-8). De statistiske analyser udførte var Hartley test og ANOVAII test. P-værdier i forhold til den tilsvarende kontrol er *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***: P ≤ 0.001

For at undersøge om serum kunne være beskyttende mod denne HFCP-induceret cytotoksicitet, som observeret for nogle andre apoptose-inducere såsom etoposid blev HepG2-celler inkuberet 24 timer i. tilstedeværelse af HFCP i et medium suppleret med 10% føtalt kalveserum Staurosporin blev anvendt som positiv kontrol siden dens apoptotiske virkning ikke inhiberes af serum. Imidlertid var den cytotoksiske virkning af HFCP ikke inhiberes på alle ved serum under disse betingelser (S3 Fig.). Eksperimenter er også blevet udført med lavere koncentrationer i længere inkubationstid (72 h) ved anvendelse af HepG2-celler. Dette blev udført med og uden serum. Sammenlignet med 24 timers inkubation, 1 mg /ml HFCP inducerede en vigtigere fald i antallet af levedygtige celler efter 72 timers inkubation. Serum syntes at være lidt beskyttende efter 72 h inkubation, hvilket ikke var tilfældet efter 24 timers inkubation (S4 fig.).

Effekten af ​​HFCP er også blevet testet på normale celler. Dette blev udført med høje koncentrationer i en kort inkubationstid (24 timer) samt med lave koncentrationer i lang inkubationstid (72 timer), med og uden serum. MCF-10A-celler er blevet anvendt til disse eksperimenter. MCF10A celler er en immortaliseret, ikke-transformerede epithelial cellelinie afledt fra human fibrocystisk brystvæv. De er ofte betragtes som en normal kontrol for cancerceller. Resultaterne viste, at HFCP inducerede også en stærk cytotoksisk virkning i disse celler. Disse resultater indikerer, at HFCP er sandsynligvis ikke specifik for cancerceller (S5 Fig.). Det skal bemærkes, at etoposid og staurosporin var også som giftige for MCF10A celler som for HepG2-celler, mens etoposid anvendes for tiden i klinikker til behandling af flere typer af cancer.

Fragmenteret citruspectin inducerer ikke-kanoniske apoptose i HepG2 og A549

for at undersøge om pektin fragmenter inducere apoptose, analyserede vi aktiveringen af ​​caspase-3 ved en western blot analyse. Aktiveringen af ​​caspase-3 forekom gennem spaltning, hvilket resulterer i fragmenter på 14 kDa og 17 kDa, som observeret, når cellerne blev inkuberet med etoposid i 24 eller 48 timer (fig. 2A). HepG2-celler inkuberet i 24 eller 48 timer med HFCP vises forskellige former for spaltet caspase-3 end de celler inkuberet med etoposid. Efter 24 h, yderligere bånd med højere tilsyneladende molekylvægt, ca. 20 og 60 kDa, dukkede; ved 48 timer, de spaltede fragmenter af caspase-3 var mindre rigelige i celler inkuberet med HFCP, men den 60-kDa form af caspase-3 stadig var til stede (fig. 2A). Efter 48 timers inkubation, et fragment på 20 kDa dukkede op i celler udsat for medium alene, etoposid og fragmenteret pektin, sandsynligvis fordi disse celler blev inkuberet uden serum. Uanset, 60-kDa bånd var specifikke for de HFCP-inkuberet celler.

HepG2 og A549-celler blev inkuberet med medium alene (Ctl-), 50 pM etoposid (Etop), 3 mg /ml varme-fragmenteret citruspectin (HFCP) eller 3 mg /ml citruspectin (pektin) i 24 og 48 timer. (A) og (B) Påvisning af aktiveret caspase-3 og spaltes PARP i HepG2 (A) og A549-celler (B) ved western blot-analyse. Immunodetektion af α-tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (C) og (D) Caspase-3-aktivitet blev analyseret under anvendelse af et specifikt fluorogent substrat efter 6, 24 og 48 timers inkubation i HepG2-celler (C) og A549-celler (D). (E) og (F) DNA-fragmentering blev analyseret under anvendelse af et ELISA-kit detektion efter 6, 24 og 48 timers inkubation i HepG2-celler (E) og i A549-celler (F). Dataene er midlerne til tredobbelte +/- SD (n = 3). Dataene er midlerne til tredobbelte +/- SD (n = 3). De statistiske analyser udførte var Hartley test og ANOVAII test. P-værdier i forhold til den tilsvarende kontrol er *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***:. P ≤ 0,001

Caspase spaltning og yderligere bånd var også mærkbar i A549 celler efter 24 eller 48 timers HFCP behandling (Fig 2B.). Desuden caspase-3 spaltningsmønster i A549-celler inkuberet med HFCP vises en spændende smear fra 30 til 60 kDa (Fig. 2B). En Western blot-analyse for PARP-protein (fig. 2A og 2B), et substrat for caspase-3, viste spaltning af dette protein i begge celletyper inkuberet med HFCP eller etoposid for begge tidsperioder. PARP-spaltning blev også påvist i HepG2-celler inkuberet i 48 timer med medium alene eller umodificeret pectin, selvom spaltet PARP var mindre rigelige i disse celler end i HFCP-inkuberet celler. A549-celler inkuberet i 24 eller 48 timer med umodificeret pectin viste en knapt påviselig mængde af spaltet PARP, sandsynligvis fordi inkubationen var i serum-frit medium.

For at bestemme om den ikke-konventionelle kløvning af caspase-3 ført til enzymaktivering blev caspase-3-aktivitet analyseret i HepG2 og A549-celler inkuberet med 50 pM etoposid, 3 mg /ml HFCP eller 3 mg /ml pektin til 8, 24 og 48 timer (fig. 2C og 2D). Resultaterne viste, at efter 24 timers inkubation, etoposid stærkt forøget caspase-3-aktivitet i HepG2-celler sammenlignet med kontrolceller. HepG2 celler behandlet med HFCP viste også en højere caspase-3-aktivitet, at øget med inkubationstid. A549-celler behandlet med etoposid udviste en lille stigning i caspase-3-aktivitet i sammenligning med kontrolcellerne, men denne stigning i caspase-3-aktivitet var mindre vigtig end den observeret i HepG2-celler, men ikke desto mindre var statistisk signifikant. HFCP-eksponerede A549 celler vises også caspase-3-aktivering, at øget over tid.

For at bekræfte, at HFCP inducerer apoptose, DNA-fragmentering, en sen karakteristisk for apoptose, blev vurderet. En gratis nukleosom ELISA-kit blev anvendt til at måle frigivelsen af ​​frie nukleosomer fra DNA (fig. 2E og F), og resultaterne viste, at HepG2 og A549-celler behandlet med etoposid viste DNA fragmentering fører til nukleosom frigivelse. I modsætning til, hvad der blev observeret for etoposid blev DNA fragmentering ikke observeret i celler inkuberet med HFCP, hvilket indikerer, at HepG2 og A549-celler behandlet med fragmenteret pectin ikke viser klassiske apoptotiske funktioner. Dette er i overensstemmelse med den nukleare morfologi observeret efter DAPI-farvning, som ikke vises typiske apoptotiske fragmenterede funktioner, men syntes at være skrumpet.

En levedygtighed assay blev også udført i caspase-3-deficiente MCF7-celler (S6 Fig. ). Resultaterne viste et fald i levedygtighed af disse celler, når inkuberet i nærvær af HFCP i 24 eller 48 timer, hvilket antyder, at caspase-3-aktivering er ikke nødvendig for at inducere celledød som respons på HFCP eksponering.

rolle caspaser i HFCP celledød

for at undersøge om caspaser spiller en stor rolle i celledød induceret af HFCP blev celler inkuberet med HFCP i tilstedeværelse af en pan-caspaseinhibitor (Z-VAD-FMK) , og levedygtigheden af ​​og cytotoksicitet til HepG2 og A549 celler efter 24 timer blev analyseret. Caspaseinhibitoren førte til en lille stigning i levedygtighed i begge celletyper inkuberet med etoposid (fig. 3A og 3B), et mindre fald i cytotoksicitet i HepG2-celler inkuberet med etoposid og et markant fald i cytotoksicitet i A549-celler inkuberet med etoposid (Fig . 3C og 3D). Dette sæt af data tyder på, at Z-VAD-fmk kunne forhindre, i det mindste delvis, celledøden forbundet med caspaseaktivitet. Men HepG2-celler inkuberet med HFCP i nærvær af Z-VAD-fmk ikke nogen stigning i levedygtighed sammenlignet med celler inkuberet med HFCP alene. En cytotoksicitet assay bekræftede disse observationer (fig. 3A og 3C), hvilket viser, at caspaser ikke bidrog til HepG2 celledød induceret af HFCP. Imidlertid A549-celler inkuberet med HFCP og caspaseinhibitor viste en højere levedygtighed og meget mindre cytotoksicitet end A459 celler inkuberet med HFCP alene, hvilket antyder, at caspaser kan inddrages i død induceret af HFCP i A549-celler (fig. 3B og 3D).

HepG2 og A549-celler blev inkuberet med medium alene (Ctl-), 50 pM etoposid (Etop), 3 mg /ml varme-fragmenteret citruspectin (HFCP) eller 3 mg /ml citruspectin (pektin) i tilstedeværelsen eller fraværet af Z-VAD-fmk, en caspaseinhibitor, ved 20 uM. (A) og (B) Cellelevedygtighed af HepG2-celler (A) og A549-celler (B) blev målt med MTT-assayet efter 24 timer inkubation. (C) og (D) Cytotoksicitet blev analyseret i HepG2 (C) og i A549 (D) efter 24 timers inkubation under anvendelse af en LDH cytotoksicitet detektion kit. Dataene er midlerne til tredobbelte +/- SD (n = 3). De statistiske analyser udførte var Hartley test og ANOVAII test. P-værdier i forhold til den tilsvarende kontrol er *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***: P ≤ 0,001. (E) og (F) En Western blot-analyse af aktiveret caspase-3 og spaltes PARP blev udført på 15 ug protein fra HepG2-celler (E) og A549-celler (F) efter 24 timers inkubation. Immunodetektion af ß-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Resultaterne er repræsentative for to uafhængige forsøg.

I et forsøg på at forstå den differentielle virkning af caspase-inhibitoren på disse to celletyper, vi bekræftet, at Z-VAD-fmk inhiberede caspaseaktivitet på anvendte koncentration i dette arbejde (S1 tabel). Faktisk viste resultaterne, at Z-VAD-fmk havde fuldstændigt at inhibere etoposide- og HFCP-induceret caspaseaktivering. Vi analyserede næste caspase-3 spaltning og PARP-spaltning i fravær eller i nærvær af Z-VAD-fmk ved western blotting (fig. 3E og 3F). Fragmenteringen af ​​caspase-3, der blev observeret, når cellerne blev udsat for etoposid ikke længere iagttages, når Z-VAD-FMK blev tilføjet, et resultat, som er i overensstemmelse med de i litteraturen [14]. Den ikke-kanoniske fragmentering af caspase-3, der blev observeret, når HepG2 og A549-celler blev behandlet med HFCP også hæmmet, og mønstret af caspase-3-spaltning blev sammenlignelig med den observeret for celler eksponeret for etoposid i tilstedeværelsen af ​​Z-VAD -fmk, bortset fra 60-kDa band, der stadig blev detekteret i begge celletyper inkuberet med HFCP og Z-VAD-fmk.

Disse data hæve den mulighed, at den “ikke-konventionelle” caspase-3-spaltning vi observerede kunne skyldes andre caspaser eller proteaser og dermed kan ikke relateres til klassisk apoptose. Faktisk blev HFCP-induceret PARP protein spaltning kun delvist hæmmes af Z-VAD-FMK, hvilket indikerer, at der kan være andre end caspaseaktivering der kunne være involveret mekanisme. Desuden blev PARP protein spaltning induceret af etoposid ikke inhiberet af Z-VAD-fmk i A549-celler, hvorimod PARP protein spaltning induceret af HFCP behandling var fuldstændigt inhiberet.

Fordi effektor-caspaser aktiveres ved initiator-caspaser , caspase-8-spaltning blev analyseret i HepG2-celler ved en Western blot-analyse (fig. 4A). Resultatet viste, at inkubation af HepG2-celler i nærvær af etoposid eller HFCP gjorde generere spaltede fragmenter af caspase-8 med en molekylvægt på 43 og 41 kDa (fig. 4A). Spaltningen af ​​caspase-8 i celler udsat for etoposid er i overensstemmelse med litteraturen [15], og dette spaltning blev forhindret af tilstedeværelsen af ​​Z-VAD-fmk i både etoposide- og HFCP-eksponerede celler (fig. 4A). Desuden overflod af fuldlængde procaspase faldt i HepG2-celler inkuberet med HFCP og blev ikke forhindret ved tilsætning af Z-VAD-fmk. Derfor faldet i overflod af procaspase-8 skyldtes ikke spaltning forårsaget af andre caspaser fordi Z-VAD-fmk ikke forhindre det. Salg

HepG2-celler blev inkuberet med medium alene (Ctl-), 50 uM etoposid (Etop), 3 mg /ml varme-fragmenteret citruspectin (HFCP) eller 3 mg /ml citruspectin (pektin) (A) Z-VAD-fmk på 20 pM blev tilsat eller ikke til cellerne under inkubation. Påvisningen af ​​aktiveret caspase-8 i HepG2-celler ved Western blot-analyse blev udført på 15 ug protein efter 24 timer inkubation. Immunpåvisningen af ​​ß-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. (B) Teoretisk illustration af α-fodrin spaltning er resultatet af aktiveringen af ​​caspase (Casp), calpain (calp) eller kombinationen af ​​caspase og calpain (casp + calp). (C) og (D) HepG2 og A549-celler blev inkuberet med medium alene (Ctl-), 50 pM etoposid (Etop), 3 mg /ml varme-fragmenteret citruspectin (HFCP) eller 3 mg /ml citruspectin (Pektin) og 20 uM Z-VAD-fmk blev tilsat eller ikke til cellerne i 6 eller 24 timer inkubation. Påvisningen af ​​α-fodrin i HepG2 (C) og A549 (D) celler ved Western blot-analyse blev udført på 15 ug protein.

calpainer er proteaser, der også aktiveres som reaktion på stress og kan deltage i celledød. Som studiet af den α-fodrin spaltningsmønster kunne informere om caspase eller calpain-aktivering [16,17], blev fragmenteringen af ​​α-fodrin vurderet af en western blot-analyse i HepG2 og A549-celler efter 6 og 24 timers inkubation med eller med Z-VAD-fmk tilsætning at bestemme, om calpainer blev aktiveret under HFCP-induceret celledød (fig. 4 C, D). Den teoretiske spaltningsmønster af α-fodrin er vist i fig. 4B. Fuld-længde α-fodrin har en molekylvægt på 280 kDa; a-fodrin spaltet af caspase viser bånd på 150 og 120 kDa, og α-fodrin spaltet af calpain viser bånd på 150 og 145 kDa. I begge celletyper udsættes for etoposid eller HFCP (fig. 4C og D), fuld-længde form af proteinet blev detekteret, som var et fragment på 150 kDa. Dette fragment kunne repræsentere spaltningen af ​​α-fodrin på en allergisk sted ved lave niveauer af endogent aktive proteaser [18]. Efter 24 timers inkubation α-fodrin spaltningsmønster i HFCP-inkuberet celler svarede til spaltningsmønsteret i etoposid-inkuberet celler, og begge præsenterede et fragment på 120 kDa. Da 120-kDa α-fodrin produkt forbundet med caspase-3-aktivering [19] og dannelsen af ​​dette fragment blev inhiberet, når Z-VAD-fmk blev tilsat i begge tilfælde indikerer resultaterne, at HFCP inducerede aktivering af nogle caspaser i begge celletyper.

Caspase 8 aktivering, er blevet vist at blive induceret i en receptor-uafhængig måde på grund proteasomhæmning [20]. Fordi ingen receptor endnu ikke er rapporteret for HFCP og at undersøge, om HFCP kunne aktivere en sådan vej, blev protein ubiquitinering vurderet af en western blot analyse i HepG2 og A549 celler. blev der observeret en tidlig stigning i ubiquitinering, når cellerne blev inkuberet i nærvær af HFCP i 6 timer, men ikke i nærvær af medium alene, etoposid eller umodificeret pectin som var stadig påvises efter 24 timers inkubation (fig. 5A og B).