PLoS ONE: Anti-proliferative effekt af Cytohesin Hæmning i Gefitinib-Resistant Lung Cancer Cells

Abstrakt

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) tyrosinkinasehæmmere (TKI), såsom gefitinib, har vist sig at effektivt inhibere proliferation af en delmængde af ikke småcellet lungecancer (NSCLC). Desværre har de fleste af NSCLC udtrykker vildtype EGFR primært modstandsdygtig over for EGFR-TKI behandling. Her viser vi, at udbredelsen af ​​gefitinib-resistente NSCLC cellelinier H460 og A549 reduceres med den lille molekyle SecinH3 som indirekte dæmper EGFR aktivering ved hæmning af cytohesins, en klasse af nylig opdaget cytoplasmatiske EGFR aktivatorer. SecinH3 og gefitinib viste en synergistisk antiproliferativ virkning, hvilket korrelerede med en dyb hæmning af Akt aktivering og survivin ekspression. Behandling mus med H460 xenografter med SecinH3 viste den antiproliferative og pro-apoptotiske effekt af SecinH3 in vivo. Vores data tyder på, at målrette EGFR indirekte ved at hæmme dets cytoplasmatiske aktivatorer, de cytohesins, har potentiale til at forbedre behandlingen af ​​primært EGFR-TKI resistente lungekræft

Henvisning:. Bill A, Schmitz A, König K, Heukamp LC, Hannam JS, Famulok M (2012) Anti-proliferative effekt af Cytohesin Hæmning i Gefitinib-Resistant Lung Cancer Cells. PLoS ONE 7 (7): e41179. doi: 10,1371 /journal.pone.0041179

Redaktør: Anna Maria Delprato, BioScience Project, USA

Modtaget: 15. maj 2012; Accepteret: 18 juni 2012; Udgivet: 18 Juli 2012

Copyright: © 2012 Bill et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft og Collaborative Research center-645 (SFB 645). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Schmitz og Dr. Famulok er medejere af et patent på lille molekyle cytohesin hæmmere titlen “Anvendelse af cytohesin hæmmere for kemisk overtalelse levetid” (WO2008058995, US 20100048594). Dr. Famulok er medopfinder på en patentansøgning med titlen “Cytohesin hæmmere” (europæisk patentansøgning EP2286808 (WO2006053903). Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Indledning

indførelsen af ​​epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) tyrosinkinaseinhibitorer (TKI) ind i terapien af ​​ikke småcellet lungecancer (NSCLC), der bærer aktiverende mutationer af EGFR har flyttet behandlingen paradigme fra en kemoterapeutiske til en målrettet tilgang. desværre kun 20 procent af adenokarcinomer i lungerne bjørnen aktiverende mutationer af EGFR og er lydhøre over for EGFR-målrettet terapi. Desuden patienter under EGFR-målrettet TKI-terapi udvikle sekundær resistens under behandling. mutationer i EGFR spil en afgørende rolle i svar fra tumoren til EGFR-målrettet terapi. Aktivering mutationer, navnlig i exon 19 og 21, er prædiktiv for en gunstig første svar på EGFR-TKI’er [1], [2], [3]. Tværtimod mutation af den såkaldte gatekeeper position i ATP-binding lomme af EGFR-kinase domæne, dvs. substitution af threonin 790 af methionin, gør cellerne resistente [4], [5], [6]. Gatekeeper-mutationen er den mest almindelige årsag til udvikling af sekundær resistens af responsive tumorer. Størstedelen af ​​NSCLCs udtrykker vildtype EGFR og er derfor primært modstandsdygtig over for EGFR-TKI’er [7]. Ca. 25% af disse NSCLCs bærer en muteret form af Ras protoonkogen, KRAS G61H eller G12V, og tilstedeværelsen af ​​denne mutation er en næsten umiskendelig indikator for resistens over for EGFR-målrettet terapi [8]. Ikke desto mindre, in vitro-undersøgelser med anvendelse af siRNA-medieret knock-down af EGFR indikerer, at spredning af NSCLC celler, der udtrykker vildtype EGFR og pejling muteret KRAS er fortsat afhængig til en vis grad på EGFR [9], [10], [11 ], [12] tyder på, at EGFR-TKI resistente celler ikke er fuldstændig uafhængig af EGFR og at det derfor rettet mod EGFR af andre end TKI’er kan føre til reduceret proliferation selv i EGFR-TKI resistente celler midler. Her viser vi, at behandling med SecinH3 af NSCLC cellelinier, der udtrykker vildtype-EGFR dæmper EGFR aktivering og signalering, reducerer proliferation af cellerne in vitro og in vivo, og gør dem reagerer på EGFR-TKI gefitinib. Som SecinH3 hæmmer cytoplasmatiske EGFR aktivatorer af cytohesin familien [13] vores data tyder på, at målrette EGFR indirekte ved hæmning af sine aktivatorer kan repræsentere en lovende tilgang til udvikling af EGFR-målrettede behandlinger for de fleste NSCLCs som ikke udtrykker mutant EGFR.

Materialer og metoder

Materialer

SecinH3, Secin16 og XH1009 blev syntetiseret som beskrevet [14], [15], gefitinib blev købt fra Biaffin. H460 og A549-celler var fra ATCC og dyrket i RPMI1640 (PAA) med 10% føtalt kalveserum (Lonza). Identiteten af ​​cellelinjer blev verificeret ved slutningen af ​​forsøgsperioden baseret på mikrosatellit genotypning af ECACC Cell Line Identity Verification service. STR profiler matchede profiler af cellelinierne som deponeret i ATCC og ECACC STR databaser.

proliferationsassav

3 × 10

3 celler pr 96 brønd blev podet i en klar, flad bund 96 brønd plade (TPP). Efter 24 timer blev cellerne behandlet med de angivne koncentrationer af inhibitorerne eller opløsningsmiddel (DMSO-slutkoncentration 0,4%) i RPMI indeholdende 50 ng /ml EGF eller IGF-1 (Peprotech), hhv. Medium blev ændret dagligt i 3 dage og celleproliferation blev analyseret med en 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay (Promega) som beskrevet i producentens protokol under anvendelse af en Varioscan mikropladelæser (Thermo Scientific). Alle assays blev udført mindst tredobbelt. Til beregning af den relative proliferationshastighed, den gennemsnitlige absorbans i DMSO-behandlede celler blev fastsat som 1.

kolonidannelse Assay

Klonogene vækst-assays blev udført som beskrevet [16]. Kort fortalt, 3000 celler /brønd blev podet i seks-brønds plader, fik lov til at klæbe over natten og behandlet med de angivne koncentrationer af forbindelse eller DMSO i 72 timer. Celler blev løsnet, genudpladet i seks-brønds plader og dyrket i 7 til 10 dage i normal vækst medier. Kolonier blev farvet med 0,1% Coomassie, 10% eddikesyre, 30% methanol i PBS og analyseret under anvendelse af en Odyssey nær-infrarød scanner (LI-COR Biosciences).

Tumor xenograft

Alle dyr procedurer var i overensstemmelse med de tyske love for dyrebeskyttelse og blev godkendt af den lokale dyrebeskyttelse udvalg og de lokale myndigheder (Bezirksregierung Köln, Tyskland). Tumorer blev genereret af s. c. injektioner af 5 × 10

6 H460 celler i nu /nu athymiske hanmus. Efter tumoretablering mus blev randomiseret i to grupper, kontrol (vehikel) og SecinH3-behandlede mus. Mus blev behandlet ved daglig i. s. injektioner (100 pi 2,5 mM SecinH3 i 50% DMSO /50% isotonisk glucoseopløsning eller kun vehikel). Tumor volumen blev målt dagligt og beregnes ved hjælp af formlen:

D

L

= større diameter;

D

S

= mindre diameter.

TUNEL-analysen blev udført i overensstemmelse med producentens manual (ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptose Kit, Merck Millipore).

spaltet caspase 3-ekspression blev bestemt ved immunhistokemi på formalinfikseret og paraffin vævssnit under anvendelse af et antistof specifikt for kløvede caspase 3 (1:750, Cell Signaling Technology) efter antigen-genvinding ved pH 6 som beskrevet [17].

A, strukturer af inhibitorerne anvendt i denne undersøgelse. B – C, proliferation af A549 (B) og H460 (C) celler blev bestemt ved MTT-assay i nærvær af de angivne inhibitorer. ***, P. 0,001 i forhold til DMSO-behandlede celler

Immunoblots

Celler var serum-udsultet natten over i nærværelse af den angivne inhibitor eller DMSO (endelig DMSO-koncentration 0,4 %). Mediet og inhibitorer blev genopfrisket 1 time før stimulering. Stimulering var i 5 minutter med 50 ng /ml EGF eller IGF-1 hhv. Celler blev lyseret i lysisbuffer (20 mM Tris-CI, pH 7,5 /150 mM NaCl /1 mM EDTA /1 mM EGTA /2,5 mM natriumpyrophosphat /1 mM β-glycerophosphat /1 mM natriumvanadat /1% Triton X-100 ) suppleret med protease-inhibitor-mix HP (Serva). Normaliserede mængder protein blev separeret ved 6% SDS-PAGE og overført til nitrocellulose. Følgende antistoffer blev anvendt: Pakt (Thr473) (Cell Signaling Technology), pEGFR (Tyr1086) (Epitomics), pIRS1 (Tyr612) (Life Technologies), EGFR, survivin, p27 (SantaCruz Biotechnology), Hsc70 (Enzo Life Sciences). Påvisning blev udført på en Odyssey scanneren med DyLight800-mærkede sekundære antistoffer (Thermo Scientific)

A -. B, proliferation af H460-celler i nærværelse af gefitinib eller SecinH3 alene eller i kombination blev bestemt ved MTT-assay ( A) eller ved kolonidannelse assay (B). In A tallene giver den relative værdi af proliferation med ubehandlede celler indstillet som 1. spredning antager en additiv effekt af SecinH3 og gefitinib (forventet) sammenholdes med den værdi, der findes i forsøgene (observeret). Observerede værdier under de forventede værdier indikerer synergisme

A -. C, H460 celler blev behandlet natten over med en uM gefitinib, 15 uM SecinH3 eller deres kombination. A, ekspressionen af ​​p27Kip og survivin blev analyseret ved western blot. B, C, Statistisk vurdering af western blot data vist i A. ** i B indikerer p 0,01 i forhold til DMSO-behandlede kontroller samt af gefitinib-behandlede celler. *** I C angiver p 0,001 i forhold til DMSO-behandlede kontroller. n = 3.

A – D, serum-udsultede celler blev stimuleret med EGF i 5 minutter og undersøgt ved Western-blot for aktiveringen af ​​de angivne proteiner. A, repræsentativt Western blot. B – D, statistisk vurdering af phosphorylering af EGFR (B), IRS1 (C), og Akt (D) i EGF-stimuleret H460 celler i nærvær af gefitinib, SecinH3, eller en kombination af begge-inhibitorer. p angiver den phosphorylerede, dvs. aktiveret, form af proteinet. Signalerne blev normaliseret til lastning kontrol Hsc70. Fejlsøjlerne giver standardfejlen. *, P 0,05, **, p 0,01, ***, s 0,001 i forhold til EGF-behandlede celler med undtagelse af de sammenligninger, der er specificeret af beslag

Statistik

Resultaterne er angivet som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien (SEM). Statistiske analyser blev udført med Prism (GraphPad Software) anvende envejs ANOVA med Tukeýs post-test for in vitro-forsøg og t-test for xenotransplantaterne. Forskelle af midler blev betragtet signifikant ved et signifikansniveau på 0,05.

Resultater

NSCLC celler, der udtrykker vildtype EGFR Reager på SecinH3

Selvom NSCLC celler, der udtrykker vildtype EGFR ikke reagerer på klinisk relevante koncentrationer af EGFR-TKI’er deres proliferation synes at afhænge i nogen grad på EGFR-signalering som er blevet vist ved EGFR knockdown eksperimenter [9], [10], [11], [12]. Vi spurgte derfor, om proliferation af NSCLC A549, som udtrykker vildtype EGFR og KRAS med aktiverende mutation G12S blev påvirket ved behandling af cellerne med SecinH3 (fig. 1A). SecinH3 er en cytohesin inhibitor [14], [15] og ikke inhiberer tyrosinkinaseaktiviteten af ​​EGFR direkte [13]. Cytohesins har længe været kendt som guaninnukleotid exchange faktorer for små G-proteiner af ARF familien [18], men har for nylig vist sig at bidrage til EGFR aktivering [17]. Mekanismen for cytohesin-medieret EGFR aktivering, hvilket er endnu ukendt i detaljer, involverer direkte interaktion af cytohesins med EGFR, er ARF-uafhængig, og kan hæmmes af SecinH3. Når A549-celler blev behandlet med SecinH3 eller det tilknyttede cytohesin inhibitoren Secin16 [19] en koncentrationsafhængig reduktion i proliferation blev observeret (fig. 1B). Sammenlignet med de stærkt EGFR-afhængige PC9 celler, som udtrykker en EGFR bærer en deletion i exon 19 [20], spredning af som blev fuldstændig inhiberet ved 15 uM SecinH3 [17], reduktionen i proliferation var mindre markant i A549-celler, som er i overensstemmelse med den mindre afhængighed af A549-celler på EGFR-signalering. Inhibering blev ikke set i celler behandlet med kontrolforbindelsen XH1009 som er strukturelt beslægtet med SecinH3 men inhiberer ikke cytohesins [14]. Gefitinib anvendes ved den terapeutiske koncentration på 1 uM kun marginalt inhiberede proliferation af A549-celler. Aktiviteten af ​​det anvendte gefitinib blev verificeret ved behandling af gefitinib-sensitive cellelinie PC9 [20], hvor 100 nM gefitinib inhiberede celleproliferation næsten fuldstændigt (data ikke vist). At udelukke, at virkningen af ​​SecinH3 var begrænset til A549-celler forsøgene blev gentaget i H460 celler, en NSCLC cellelinie udtrykker også vildtype-EGFR, men en anden KRAS mutant, nemlig G61H (fig. 1C). Som i A549-celler, 15 uM SecinH3 resulterede i ca. 50% reduktion af proliferation. Denne værdi passer rimeligt godt til den halve maksimale hæmmende koncentration af SecinH3 for den katalytiske aktivitet af oprensede cytohesins hvilket er 10-12 uM [14].

SecinH3 og Gefitinib er Synergistisk

Efter at have vist at SecinH3 svækket spredning af gefitinib-resistente NSCLC celler vi spurgte, om behandling med SecinH3 kunne gengive cellerne reagerer på gefitinib og dermed virker synergistisk med denne EGFR-TKI. Derfor blev proliferationen af ​​H460-celler bestemt ved en 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) assay i nærvær af 1 uM gefitinib og stigende koncentrationer af SecinH3 (Fig . 2A). For hver kombination af forventet for Bliss uafhængighed af de to forbindelser inhibering blev beregnet ved fraktioneret produkt metoden [21] og sammenlignet med den observerede grad af inhibering [22]. For alle tre kombinationer testet, blev fundet en synergistisk effekt af gefitinib og SecinH3. MTT assay bestemmer proliferation indirekte ved at måle den metaboliske aktivitet af cellepopulationen. For at opnå yderligere og mere direkte bevis for inhibering af proliferation en kolonidannelse assayet blev udført (fig. 2B). Også i dette assay, kombinationen af ​​SecinH3 med gefitinib var mere effektiv end hver inhibitor alene.

A, H460 celler blev serumudsultet og behandlet natten over med 0,5 uM AG1024, 15 uM SecinH3 eller deres kombination. Efter stimulering med IGF1 i 5 min phosphoryleringstilstanden af ​​de angivne proteiner blev analyseret ved western blot. Graferne opsummere 3 eksperimenter, fejlsøjlerne giver standardafvigelsen. *, P 0,05, **, p 0,01, ***, s 0,001 i forhold til IGF1-behandlede celler med undtagelse af de sammenligninger, der er angivet af konsoller. B, blev proliferation af H460-celler i nærvær af de angivne inhibitorer bestemmes ved MTT-assayet. Tallene giver den relative værdi af proliferation med ubehandlede celler indstillet som 1. spredning, hvis antages en additiv effekt af SecinH3 og gefitinib (forventet) sammenholdes med den værdi, der findes i forsøgene (observerede). Observerede værdier under de forventede værdier indikerer synergisme. ***, P. 0,001

Inhibering af EGFR signalering i EGFR-afhængige celler er kendt for at resultere i standsning af cellecyklus og føre til induktion af apoptose. Som surrogatmarkører for cellecyklus og apoptose, bestemte vi ekspressionen af ​​cellecyklusprogression inhibitor p27KIP1 og apoptoseinhibitoren survivin (fig. 3A). Behandling af cellerne med SecinH3 eller gefitinib resulterede i et fald i survivin (fig. 3B) og en stigning i p27KIP1 (fig. 3C), hhv. Denne effekt var mere udtalt i celler behandlet med begge inhibitorer.

Som ekspression af begge proteiner, p27KIP1 og survivin, reguleres af Akt signalering phosphoryleringen af ​​Akt blev analyseret som reaktion på EGF-stimulering af cellerne (fig. 4A). Hvorimod EGF-induceret phosphorylering af EGFR og adapteren protein insulin-receptor substrat 1 (IRS1) blev drastisk reduceret med gefitinib (fig. 4B, C) phosphorylering af Akt blev ikke (fig. 4D), hvilket indikerer, at Akt signalering var uændret i gefitinib-behandlede H460 celler. I modsætning hertil SecinH3 havde en mindre inhibitorisk virkning på EGFR og IRS1 phosphorylering men viste væsentlig inhibering på Akt aktivering. Følgelig er kombinationen af ​​SecinH3 og gefitinib resulterede i næsten fuldstændig inhibering af phosphoryleringen af ​​alle tre proteiner. Disse data indikerer, at den antiproliferative virkning af kombineret SecinH3 /gefitinib behandling skyldes effektiv hæmning af EGFR -. Akt signalering akse

Mus der bar subkutane H460 xenotransplantater behandledes med SecinH3 ved daglige intraperitoneale injektioner. A, tumorvolumen blev bestemt hver dag. På dag 9 havde eksperimentet skal stoppes, fordi tumoren volumen i kontroldyr oversteg 1 cm

3. B, distribution af tumor volumen på dag 9. C – D, blev graden af ​​apoptose analyseres i afsnit af tumorer på dag 9. C, blev antallet af fragmenterede kerner bestemt af TUNEL farvning. D, spaltes, dvs. aktiveret caspase-3 blev detekteret ved imunohistochemistry. Repræsentative tumorsektioner er vist. 5 × og 40 × angiver forstørrelsen af ​​målet. For alle grafer, midler og standardfejl er vist (n = 14). *, P 0,05, **, p 0,01, ***, s. 0,001

SecinH3 Reducerer IGF1R-afhængige Signaling og spredning

Ud over EGFR, insulin-lignende vækstfaktor-1 receptor (IGF1R) er en vigtig regulator af Akt aktivering og krydstale mellem IGF1R og EGFR eller EGFR familiemedlemmer såsom Her2 er blevet rapporteret som en mekanisme af resistens over for lægemidler rettet mod EGFR eller Her2 i flere typer af kræft [16], [23], [24], [25], [26]. Som SecinH3 inhiberer signalering nedstrøms for insulinreceptoren [15], [27], som deler vigtige funktioner med IGF1R signaling testede vi, om behandling af H460 celler med SecinH3 resulterede i reduceret aktivering af IGF1R – Akt signalvej (. Figur 5A). Efter aftale med resultater opnået med insulinreceptoren blev autophosphorylering af IGF1R ikke reduceret ved SecinH3 behandling, men steg. Ikke desto mindre blev aktiveringen af ​​IRS1 og Akt væsentligt reduceret. Hæmning af Akt aktivering blev ikke set på gefitinibs behandling. Stigningen i IGF1R phosphorylering ved behandling med gefitinib og SecinH3 er i overensstemmelse med tidligere observationer, at hæmning af EGFR resulterer i øget aktivering af IGF1R [16], [22], [25], [26]. Vi spurgte, om SecinH3 reduceret spredning i overværelse af IGF1 (fig. 5B). Faktisk blev spredning reduceret på SecinH3 behandling og reduktionen var synergistisk med IGF1R inhibitor AG1024. Kombinationen af ​​gefitinib og AG1024 viste også en synergistisk antiproliferativ effekt omend mindre udtalt end kombinationen af ​​SecinH3 og gefitinib.

SecinH3 forsinker Vækst af H460 Xenografter in vivo

Efter at have vist, at SecinH3 reducerer spredning af EGFR-vildtype NSCLC celler in vitro vi spurgt, om tumorvækst også ville blive hæmmet in vivo. Derfor blev nøgne mus der bar subkutane H460 xenotransplantater behandlet ved daglige intraperitoneale injektioner af SecinH3. Behandling med SecinH3 signifikant forsinket tumorvækst (fig. 6A). Når musene blev aflivet efter 9 dages behandling signifikant mindre tumorer blev observeret i SecinH3-behandlede gruppe sammenlignet med opløsningsmiddel-behandlede gruppe (fig. 6B). I histologiske sektioner af tumorerne viste TUNEL-farvning en forøget apoptose i de behandlede dyr (fig. 6C), hvilket også var tydeligt ved caspase-3-farvning (fig. 6D). Sammenfattende vores data viser, at SecinH3 in vitro og in vivo reducerer spredning af NSCLC celler, der udtrykker vildtype EGFR.

Diskussion

I denne rapport, viser vi, at NSCLC celler viser primære modstand mod EGFR-TKI gefitinib reagerer på behandling med SecinH3, som hæmmer EGFR indirekte ved at målrette dens cytoplasmatiske aktivatorer af cytohesin familien. Dette resultat kan synes uventet, fordi modstanden mod gefitinib kan tolkes som uafhængighed af EGFR-signalering. Dette er imidlertid ikke tilfældet. Behandling med EGFR-specifikke siRNA’er af forskellige EGFR-TKI resistente NSCLC cellelinier, der udtrykker vildtype-EGFR resulterede i reduceret proliferation af cellerne [9], [10], [11], [12], som angiver, at EGFR-TKI modstand og EGFR uafhængighed er i hvert fald ikke altid tilsvarende. Følgelig er det blevet vist, at EGFR bidrager til overlevelsen af ​​cancerceller uafhængigt af dens kinaseaktivitet [28]. Disse data viser, at kinase-inhiberet EGFR er stadig i stand til at aktivere signalveje, der stimulerer proliferation eller inhiberer celledød. Til støtte for denne antagelse er den iagttagelse, at inhibering af EGFR ved erlotinib inducerer heterodimerisering af EGFR med IGF1R som aktiverer IGF1R og dens signalering til nedstrøms kinaser herunder Akt [16]. Cytohesins er blevet vist at direkte interagere med EGFR og derved påvirke dens konformation [17]. Som en særlig konformation af EGFR, den asymmetriske dimer, er en forudsætning for kinaseaktivering [29] har modulation af EGFR konformation været impliceret i aktiveringen af ​​EGFR ved cytohesins, en proces, der inhiberes af SecinH3. Da behandlingen af ​​H460-celler med SecinH3 medført øget phosphorylering af IGF1R en lignende funktion af cytohesins under aktiveringen af ​​IGF1R af EGFR kan udelukkes. Tilsyneladende SecinH3 inhiberer signalering med EGFR-aktiverede IGF1R nedstrøms for receptoren. Dette fund er i fuld overensstemmelse med tidligere observationer, at SecinH3 ikke påvirker insulin receptor-aktivering, men inhiberede signalering nedstrøms af receptoren på niveau med adapteren protein insulin receptor substrat-1 resulterer i reduceret Akt aktivering [15], [27], [ ,,,0],30]. Således kan anti-proliferative aktivitet af SecinH3 i EGFR-TKI resistent NSCLC celler forklares med dens dobbelte hæmmende effekt på både, EGFR og IGF1R signalering, hvilket kan forhindre cellerne i at omgå EGFR inhibering med øget IGF1R signalering. Vi vil gerne påpege, at vores data ikke udelukker muligheden for, at den synergistiske anti-proliferative effekt af SecinH3 med gefitinib kan skyldes SecinH3 påvirker signalering ved RTK’er i tillæg til IGF1R. Især amplifikation af hepatocytvækstfaktor-faktor receptor c-MET [31] og tilstedeværelsen af ​​EML4-Alk-fusionsprotein [32] har været relateret til EGFR-TKI resistens. Aktiveringen af ​​disse RTK ved cytohesins er dog endnu ikke blevet undersøgt, og dermed vi i øjeblikket ikke, om signalering af disse RTK kan påvirkes af SecinH3.

Øget aktivering af IGF1R er blevet anerkendt som en vigtig årsag til modstand mod EGFR-målrettede behandlinger i kræftceller af forskellig oprindelse. Følgelig in vitro eksperimenter viste kombineret hæmning af IGF1R og EGFR aktivitet for at reducere tumorcelleproliferation synergistisk [16], [23], [24], [25], [26]. Desværre blev disse resultater ikke oversat til kliniske forsøg, hvor indtil nu, kombinationsbehandlinger anvender EGFR og IGF1R målrette behandlinger har undladt at vise betydelige forbedringer i forhold enkelt terapi [33], [34]. Årsagerne til disse skuffende resultater er i øjeblikket ukendt, men kan ligge i den ufuldstændige forståelse for de molekylære detaljer af krydstale mellem EGFR og IGF1R signalering, der udelukker rationel udvælgelse af patienter, der kan have gavn af kombinationsbehandling. Mutationer, som kan forudsige respons på målrettet terapi, som for EGFR, er ikke blevet rapporteret for IGF1R [35], og kan således ikke anvendes til at udvælge patienter. I et klinisk studie, der søger efter biomarkører forudsiger gavn af kombineret EGFR /IGF1R hæmning mutant Kras blev identificeret [36]. In vitro-undersøgelser viste imidlertid, modstridende data om den antiproliferative virkning af kombineret inhibering af EGFR og IGF1R i KRAS-muterede H460 celler. Betragtninger en undersøgelse ikke fandt synergisme [25] en anden undersøgelse gjorde [16]. I vores undersøgelse blev fundet en svag synergisme af gefitinib og AG1024 mens stærkere synergi blev fundet for kombinationer af en af ​​disse forbindelser med SecinH3. Disse uoverensstemmelser fremhæve den opfattelse, at hæmme identiske mål ved forskellige inhibitorer eller hæmning strategier kan føre til forskellige biologiske resultater. Derfor kan fremgangsmåder, som ikke er afhængige af direkte inhibering af EGFR og IGF1R kinaseaktiviteter men målretter disse receptorer indirekte via deres aktivator eller adaptormolekyler tilvejebringe mere fuldstændig forståelse af disse signalveje og derved tilvejebringe endnu ikke erkendte mål for nye terapeutiske fremgangsmåder.

tak

Vi takker Y. Aschenbach-Paul, A. Florin og U. Rommerscheidt-Fuss til teknisk bistand.