PLoS ONE: Rationel design, syntese og biologisk evaluering af tredje generation α-noscapin analoger som Potent tubulin Binding Anti-Cancer Agents

Abstrakt

Systematisk screening baseret på strukturel lighed af lægemidler, såsom colchicin og podophyllotoxin førte til identifikation af noscapin, en mikrotubulus-targeted middel der dæmper den dynamiske ustabilitet af mikrotubuli uden at påvirke polymerens samlede masse af mikrotubuli. Vi rapporterer en ny generation af noscapin derivater som potentielle tubulin bindende anticancer-midler. Molekylære modellering eksperimenter af disse derivater 5a, 6a-j gav bedre docking score (-7,252 til -5,402 kcal /mol) end den oprindelige forbindelse, noscapin (-5,505 kcal /mol) og dets eksisterende derivater (-5,563 til -6,412 Kcal /mol). Gratis energi (Δ

G

binde

) beregninger baseret på den lineære interaktion energi (LIE) empirisk ligning udnytte Surface Generaliseret Born (SGB) kontinuum model opløsningsmiddel forudsagde tubulinbindende tilhørsforhold for derivater 5a, 6a-j (til lige fra -4,923 -6.189 kcal /mol). Forbindelse 6f viste højeste bindingsaffinitet til tubulin (-6,189 kcal /mol). Den eksperimentelle evaluering af disse forbindelser blevet bekræftet med teoretiske studier. N- (3-brormobenzyl) noscapin (6f) binder tubulin med højeste bindingsaffinitet (K

D, 38 ± 4,0 uM), hvilket er ~ 4,0 gange højere end for den oprindelige forbindelse, noscapin (K

D , 144 ± 1,0 uM) og er også mere potent end den første generation kliniske kandidat EM011, 9-bromonoscapine (K

D, 54 ± 9,1 uM). Alle disse forbindelser udviste betydelig cytotoksicitet mod cancerceller, med IC

50 værdier i området fra 6,7 ​​pM til 72,9 pM; sammensatte 6f viste fremtrædende anti-cancer effekt med IC

50 værdier fra 6,7 ​​pM til 26,9 uM i cancerceller af forskellige væv af oprindelse. Disse forbindelser forstyrret DNA-syntese, forsinkede cellecyklusprogression ved G2 /M-fasen, og induceret apoptotisk celledød i cancerceller. Kollektivt, rapporterede undersøgelsen her identificerede potente, tredje generation noscapinoids som nye anti-cancer.

Henvisning: Manchukonda NK, Naik PK, Santoshi S, Lopus M, Joseph S, Sridhar B, et al. (2013) Rationel design, syntese og biologisk evaluering af tredje generation α-noscapin analoger som Potent tubulin Binding anticancer-midler. PLoS ONE 8 (10): e77970. doi: 10,1371 /journal.pone.0077970

Redaktør: Chandra Verma, Bioinformatics Institute, Singapore

Modtaget: Februar 23, 2013; Accepteret: September 6, 2013; Udgivet 21. oktober, 2013 |

Copyright: © 2013 Manchukonda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiel bistand gennem MLP 0002 CSIR 12. fem årige projekter (CSC0108-OPRINDELSE CSC0205 – DENOVA). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i modsætning til den nuværende tubulin bindende kemoterapeutiske stoffer som paclitaxel og Vincaalkaloider, der er forstyrret af komplikationer med uønskede bivirkninger såsom systemisk toksicitet, noscapin [1-3], en over-the-counter hostestillende alkaloid [4 , 5], er udstyret med bedre anti-cancer profil [6-8] og sikrere toksicitetsprofil [9-11]. Mekanistisk, noscapin binder tubulin med en støkiometri på én (0,95 ± 0,02) noscapin molekyle pr tubulin dimer, ændrer tubulin konformation efter binding [12] Endnu tillader polymeriseringen af ​​tubulin til mikrotubuli (MTS) [13,14]. Noscapin imidlertid inducerer mindre suppression af den dynamiske ustabilitet af mikrotubuli [13,14]. Som et resultat, noscapin blokke mitose ved prometafasen, og måske på grund af de kompromitterede checkpoints, cancerceller selektivt gå forpligtet til apoptotisk celledød forlader normale celler uskadt [6-14]. Fra et farmakologisk synspunkt, noscapin har mange fordele som et mikrotubulus-bindende middel [1]. Det er effektivt mod multiresistente cancercellelinier, påvirker cancerceller anderledes end de normale delende celler [15,16], har bedre farmakokinetiske profil [17,18], og skader ikke normale væv (således uden toksiske bivirkninger) [ ,,,0],19,20]. Selvom noscapin har vist sig at være cytotoksisk over for en bred vifte af cancerceller i det offentlige bibliotek af National Cancer Institute, USA (NCI screen 60-celle), IC forbliver

50 værdier i de høje mikro molære intervaller ( ~ 21,1 til 100 uM) [12]. Som følge heraf har forskellige noscapin-baserede tubulin-målrettede midler blevet udviklet ved modifikationer hovedsagelig på A, B og C sites (figur 1A) i noscapin stillads [21-28]. Disse forbindelser omtales som noscapinoids (figur 2). De første generation analoger syntetiseret ved den kemiske manipulation på diversitet punkt A på isoquinolin ringsystem med noscapin (figur 1A) inkluderet nitro [21], azido [22], amino [23,24] og halogenerede [25-27] ( fluor, chlor, brom og iod) a-noscapin analoger, og de udviste overlegen anticanceraktivitet. Baseret på disse indsigter, blev lactonringen af ​​benzofuranon (mangfoldighed punkt B, figur 1A) reduceret til sin cykliske ether analog [28] (f.eks 4a) og undersøgt for dets styrke som tubulin bindemidler [29]. Yderligere spredning ved punkt C (figur 1A) på benzofuranon ringsystem med noscapin er blevet rapporteret at give den anden generation O-alkylerede [30] /acyleret [31] noscapinoids, herunder hydroxy-derivat, som er mere potent end den forælder noscapin. Disse rapporter tyder på, at kemisk manøvrering af indeholdt funktionelle grupper noscapin har betydelig indvirkning på den biologiske aktivitet. I forlængelse af vores indsats på design af nye noscapin derivater, besluttede vi at indføre ændringer på mangfoldighed punkt D (figur 1B) ved funktionalisering af ‘N’ i isoquinolin enhed af naturlig α-noscapin (vi kalder dem tredje generation α-noscapin analoger ), der kan forventes at øge den biologiske aktivitet. De er beskrevet på funktionalisering på ‘N’ rapporter er gennem urea bindinger [32] og meget er ikke blevet udforsket for sin biologiske effekt. Vi mener, at urea typen kobling ikke kan være den rigtige løsning, da det vil forstyrre elektronen massefylde ved isoquinolin N gennem udflytning. Derfor vil der i den foreliggende undersøgelse har vi vedtaget at indføre funktionelle grupper holde det elektroniske miljø på N meste intakt (dvs. at holde effekten af ​​methyl gruppe intakt). Derfor “H” på N-CH

3 er målet for ændringen. Alle de beskrevne og syntetiserede derivater er i overensstemmelse med denne designstrategi (figur 3).

(A) Forskellige mangfoldighed point for derivatisering af α-noscapin og (B) design strategi for nye a-noscapin analoger (grundlæggende skelet og stereokemi er den samme som i den naturlige α-noscapin)

Reaction betingelser: (i) en:.

m

CPBA, DCM; b: 2N HCI; c: FeSO

4.7H

2O; (Ii) R-Br, KI, K

2CO

3, Acetone.

Her rapporterer vi den tredje generation noscapin kongenere 6a-j, der adskiller sig i substituent koblet til isoquinolin ‘ N ‘af naturlig α-noscapin.

I silico

molekylære modellering beregninger af disse analoger med tubulin kompleks var ansat til at undersøge deres bindingsaffinitet baseret på rimelige prædiktiv model. De nye analoger, nornoscapine 5a og 6a-j blev kemisk syntetiseret og undersøgt for deres tubulin bindende egenskaber, og for deres virkninger på cellecyklusprogression og anti-proliferativ aktivitet i hurtigt delende kræftceller ved hjælp af repræsentative humane cancer cellelinier af lunge, myelom, bryst og livmoderhalsen.

Materialer og metoder

A:. Computational metodologi

ligand forberedelse

Molekylære strukturer af nye derivater af noscapin 5a, 6a-j (figur 3) sammen med de rapporterede noscapinoids 1, blev 2a-f (figur 2) bygget ved hjælp af molekylær bygherre af Maestro (version 9.2, Schrödinger). Alle disse strukturer var energi minimeres ved hjælp makromodel (version 9.9, Schrödinger) og OPLS 2005 kraftfelt med PRCG algoritme (1000 trin minimering og energi gradient på 0,001). Passende bond ordre for hver struktur blev tildelt ved hjælp Ligprep (version 2.5, Schrödinger). Komplet geometrisk optimering af disse strukturer blev udført ved hjælp af hybrid tæthedsfunktionalteori med Becke tre-parameter udveksling potentiale og Lee-Yang-Parr korrelation funktionelle (B3LYP) [33,34] med basis sæt 3-21G * [35-37] . Jaguar (version 7.7, Schrödinger, LLC) blev anvendt til den geometriske optimering af liganderne.

Protein forberedelse

co-krystalliseret colchicin-tubulin kompleks struktur (FBF ID: 1SA0, opløsning 3.58Å). [38] blev anvendt til molekylær docking og rescoring. Multi-trin Schrödingers proteinpræparat guiden (PPrep) blev anvendt til den endelige fremstilling af protein. Manglende hydrogenatomer blev tilsat til strukturen ved hjælp Maestro grænseflade (version 9.2, Schrödinger). Alle vandmolekylerne blev fjernet fra komplekset og optimeret brint bond netværk ved hjælp PPrep guiden. De manglende aminosyrer fra 37 til 47 (A-kæde) og 275 til 284 (B-kæde) i co-krystalliseret struktur blev fyldt ved anvendelse af homologi-modellering teknik baseret på forskellige skabeloner som PDB ID: 3DU7 (C-kæde ) og PDB ID: 3RYC (D-kæde) henholdsvis under anvendelse af Prime (version 3.0, Schrödinger). Den opnåede struktur var energi minimeres ved anvendelse OPLS 2005 kraftfelt med Polak-Ribiere konjugat Gradient (PRCG) algoritme. Minimering blev standset enten efter 5.000 trin eller efter Energigradienten konvergerede under 0,001 kcal /mol. Alle atom molekylær dynamik (MD) simulering af proteinstruktur i eksplicit vand blev udført under anvendelse af GROMACS 4.5.4 software [39] og GROMOS96 kraftfeltet for en tidsskala på 10 ns. blev indført Tre-dimensionelle periodiske randbetingelser, omslutter molekyle i en dodekaeder solvatiseret med SPC216 vand modellen i den GROMACS pakke og energi minimeres ved hjælp 1000 trin stejleste afstamning. Systemet blev neutraliseret med 32 Na

+ modion og var lokalt minimeret ved anvendelse af 100 trinnene stejleste afstamning. Den elektrostatiske sigt blev beskrevet ved hjælp af Particle Mesh Ewald algoritme [40]. De LINCS [41] algoritme blev brugt til at begrænse alle obligations- længder og cut-off afstande for beregning af coulombiske og van der Waals interaktioner ved 1,0 nm. Systemet blev i ligevægt med 100 ps af MD kører med position begrænsninger på proteinet for at tillade en lempelse af opløsningsmidlet molekyler ved 300 K og normalt tryk. Systemet blev koblet til den eksterne bad af Berendsen termostat med en koblingstid på 0,1 ps med standardindstillingen. De endelige MD Beregningerne blev udført for 10,0 ns på samme vilkår med et tidsskridt på 2 fs. Den overordnede kvalitet af modellen opnås, stereokemiske værdier og ikke-bundne interaktioner blev testet ved hjælp PROCHECK [42], ERRAT [43] og VERIFY3D [44]. De ProCheck Resultaterne viste 94,8% af backbone vinkler er i tilladte regioner med G-faktorer – 0,12. Ramachandran plot [45] analyse viste kun 1,6% rester i den underkendt region og 2,3% rester i generøst tilladte regioner. ERRAT er en “samlet kvalitetsfaktor” regnemaskine program for ikke-bundne atomare interaktioner. Det accepterede område i ERRAT er 50 og højere score angiver præcisionen af ​​modellen. I tilfælde af tubulin, den ERRAT nu var 88,402, der er inden for området af kvalitet model høj. Tilsvarende VERIFY 3D score på 95,25% indikerer en god kvalitet model.

Molekylær docking af ligander og beregning af bindende gratis energier.

receptor-grid-fil blev genereret ved det geometriske tyngdepunkt af de noscapinoid bindingssted [46] ved hjælp af Glide (version 5.7, Schrödinger). En afgrænsningsramme størrelse 12A x 12A x 12A blev defineret i tubulin og centreret på massen centrum af bindingssted for at begrænse masse midten af ​​den kuperet ligand. Den større omsluttende kasse med størrelse 12A x 12A x 12A som besatte alle atomerne i de forankret rejser blev også defineret. Skaleringsfaktor på 0,4 for van der Waals radier blev påført atomer af protein med absolut delvis debitering mindre end eller lig med 0,25. Alle ligander blev derefter docket i bindingsstedet hjælp Glide XP (ekstra præcision) og vurderes ved hjælp af en Glide XP

Score-funktionen [47,48]. Endvidere forankret komplekser af disse ligander var energiminimeredes baseret på hybrid Monte Carlo simulering og deres bindende fri energi (Δ

G

binde

) på tubulin blev forudsagt ved lineær interaktion energi metode (LIE) med en overflade generaliseret Born (SGB) kontinuum solvatering model. Den LØGN-SGB model estimerer bindingsaffiniteterne for et sæt af nye forbindelser udnytte de eksperimentelle bindende affinitet data for et sæt af træningssæt. I denne undersøgelse har vi anvendt den oprindelige formulering af SGB-LIE (ligning 1) foreslået af Jørgensen [49] og gennemføres i Liaison pakke (version 5.6, Schrödinger, LLC) ved hjælp af OPLS-2005 kraft field.

Δ

G

b

i

n

d

=

α

(

〈

U

v

d

w

b

〉

−

〈

U

v

d

w

f

〉

)

+

β

(

〈

U

e

l

e

c

b

〉

−

〈

U

e

l

e

c

f

〉

)

+

γ

(

〈

U

c

a

v

b

〉

−

〈

U

c

a

v

f

〉

)

(1)

Here ⟨⟩ Repræsentere ensemblet gennemsnit

b

repræsenterer bundet form af liganden,

f

repræsenterer den frie form af liganden, og α, β, og γ er koefficienterne.

U

VDW

,

U

el

, og

U

cav

er van der Waals, elektrostatiske, og hulrum energimæssigt i SGB kontinuum solvent model. Hulrummet energi sigt

U

CAV

, er proportional med den blotlagte overfladeareal af liganden. Forskellige energi parametre, der indgår i ligning 1 blev beregnet ud fra forankret kompleks svarende til hver analog hjælp Liaison pakke som tidligere [24] beskrevne. De gennemsnitlige LIE energimæssigt blev brugt til at bygge bindingsaffiniteten model og vurdering af bindende gratis energier af noscapin derivater. Den α

,

β, og γ LIE montering parametre blev bestemt ved anvendelse Minitab statistisk pakke (version 16.0, Minitab Inc.) ved at montere de eksperimentelle bindingsaffiniteter træning sæt molekyler. Et datasæt bestående af 7 noscapin derivater (forbindelser: 1, 2a-f; figur 2) med kendte eksperimentelle bindingsaffiniteter blev anvendt som et træningssæt.

B:. Eksperimentel metode

Kemisk syntese af noscapin derivater

Reagenser og alle opløsningsmidler var analytisk rent og blev anvendt uden yderligere rensning. Alle reaktioner blev udført i ovntørret kolber med magnetisk omrøring. Alle forsøgene blev overvåget ved analytisk tyndtlagskromatografi (TLC) udføres på silicagel GF254 pre-coatede plader. Efter eluering blev pladerne visualiseret under UV-belysning ved 254 nm for UV aktive materialer. Farvning med PMA og forkulning på en varmeplade gjort yderligere visualisering. Opløsningsmidler blev fjernet

i vakuum

og opvarmet på et vandbad ved 35 ° C. Silicagel finere end 200 mesh blev anvendt til søjlekromatografi. Søjler blev pakket som opslæmning af silicagel i hexan og ækvilibreret med det passende opløsningsmiddel /opløsningsmiddelblanding før brug. Forbindelserne blev indlæst ublandet eller som en koncentreret opløsning anvendelse af den passende opløsningsmiddelsystem. Anvendelse pres med en luftpumpe bistået eluering. Udbytter refererer til chromatografisk og spektroskopisk homogene materialer, medmindre andet er angivet. Passende navne for alle de nye forbindelser blev givet ved hjælp af ChemBioOffice 2010. Smeltepunkter blev målt med et Fischer-Johns smeltepunktsapparat og er ukorrigerede. Renhed af alle forbindelser ( 96%), der anvendes til biologisk screening blev bestemt ved analytisk HPLC (SPD-M20A, gøre: Shimadzu) ved hjælp af ODS-kolonne elueres med gradient blanding af acetonitril-vand. Infrarød spektroskopi (IR) spektre blev registreret som pæne væsker eller KBr pellets og absorptioner er rapporteret i cm

-1. Kernemagnetisk resonans (NMR) spektre blev registreret på 300 (Bruker) og 500 MHz (Varian) spektrometre i passende opløsningsmidler under anvendelse af tetramethylsilan (TMS) som en intern standard eller opløsningsmidlet signaler som sekundære standarder og de kemiske skift er vist i o skalaer. Mangfoldigheder af NMR-signaler er betegnet som s (singlet), d (dublet), t (triplet), q (kvartet), br (bred), m (multiplet, for uløste linjer), etc.

13C NMR-spektre var optaget på 75 MHz spektrometer. Højopløsningsmassespektrum spektre (HRMS) blev opnået ved anvendelse ESI-QTOF massespektrometri. Optiske rotationer blev målt med et Roudolph Digipol 781 polarimeter ved 25 ° C. Kommercielt tilgængeligt opløsningsmidler hexan, CH

2Cl

2, og EtOAc blev anvendt som sådan uden yderligere rensning. Naturlig α-noscapin blev købt fra Sigma-Aldrich og anvendes som sådan. Den syntetiske fremgangsmåde til fremstilling af noscapin derivater, 6a-j afbildet i figur 3. Alle disse derivater blev syntetiseret ud fra nornoscapine 5a som udgangsmateriale, som igen blev syntetiseret fra noscapine.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-

g

]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (5a): Til en opløsning af naturlig α- noscapin (2,0 g, 4,84 mmol) i dichlormethan (15 ml) blev tilsat mCPBA (1,66 g, 9,7 mmol) portionsvis ved 0 ° C. Reaktionsblandingen blev omrørt i 1 time ved stuetemperatur, fortyndet med dichlormethan (20 ml), overskydende peroxid blev standset med 1M aq. opløsning NaHSO

3 (15 ml), det organiske lag derefter separeret, tørret med vandfrit Na

2SO

4 og koncentreret. Den rå remanens blev opløst i methanol (20 ml), forsuret til pH 1,0 ved anvendelse af 2 N HCI, omrørt i 5 minutter og filtreres. Filtratet blev koncentreret under reduceret tryk, genopløst i dichlormethan (20 ml), tørret med vandfrit Na

2SO

4, filtreret og koncentreret. således opnåede Det bleggule faste stof α- noscapin N-oxide.HCl salt blev opløst i methanol (20 ml), blev FeSO

4.7H

2O (2,69 g, 9,68 mmol) tilsat. Efter omrøring af blandingen ved stuetemperatur i 12 timer blev reaktionsblandingen koncentreret og behandlet med 25% vandig ammoniak til at få pH 10, ekstraheret med dichlormethan (3 x 10 ml), tørret med vandfrit Na

2SO

4 og inddampet under reduceret tryk. Den rå remanens blev underkastet triethylamin behandlet silicagelsøjlekromatografi og elueret med 3: 7 ethylacetat: hexan (2: 3) gave(S)-6,7-dimethoxy-3-((

R

)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-

g

]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (5a) (0,92 g, 48%) som et hvidt fast stof. smp 170 ° C; [Α]

D

25 = -105,6 (c = 1, methanol), udbytte: 48% IR ν

max (cm

1): 3360, 2942, 1759 1624 1501 , 1280, 1119, 1074, 1042, 1023, 932, 796, 679

1.HNMR (300 MHz, CDC

3): δ 6,94 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,33 (s, 1H), 5,99-5,89 (m, 4H), 4,85 (d, J = 4,53 Hz, 1H), 4,09 (s, 3H), 4,07 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 2,69-2,58 (m , 1 H), 2,54-2,42 (m, 1H), 2,36-2,23 (m, 1H), 2,22-2,09 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDC

3) δ 168,5, 152,1 , 148.3,147.8, 141,0, 140,4, 134,1, 131,9, 119,6, 118,3, 117,5, 116,9, 103,1, 100,7, 20,6, 62,2, 59,4, 56,6, 52,7, 39,5, 29,7 MS (ESI)

m

/

z

400 [M + H]

+; HRMS (ESI) beregnet for C

21H

22NO

7: 400,1396, fundet:.. 400,1401

Generel procedure for udarbejdelse af 6a-j

Til opløsning af (

S

)-6,7-dimethoxy-3-((

R

)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-

g

]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one 5a (200 mg, 0,50 mmol) i acetone (5 ml), blev der tilsat kaliumcarbonat (1,10 mmol), kaliumiodid (0,5 mmol) og alkylbromid (0,55 mmol) og omrørt ved stuetemperatur (RT) i 1 time. Rå reaktionsblanding blev filtreret, filtratet blev inddampet under vakuum, vand (5 ml) og dichlormethan (2 X 10 ml) blev tilsat, organiske lag skilt fra, vasket med H

2O, tørret over vandfrit Na

2SO

4 og filtreret. Den således opnåede remanens blev kromatograferet over triethylamin behandlet silicagelsøjle under eluering med hexan /ethylacetat (70:30), hvilket gav 6a-j som faste produkter

(S) -3 -. ((

R

) -6-benzyl-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro- [1,3] dioxolo [4,5

g

] isoquinolin-5-yl) – 6,7-dimethoxyisobenzofuran-1 (3H) -on (6a): Udbytte: 93%; smp 64 ° C; [Α]

D

25 = 1,3 (c = 1, dichlormethan); IR ν

max (cm

-1): 3503, 2490, 2837, 1759, 1621, 1595, 1569, 1498, 1271, 1212, 1039, 891, 785, 695

1.HNMR (300 MHz, CDC

3) 7,33-7,15 (m, 5H), 6,98 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,33 (s, 1 H), 6,17 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,94 ( s, 2H), 5,66 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,62 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,15-4,06 (m, 4H), 4,02 (s, 3H), 3,86 (s, 3H ), 3,66 (d, J = 13,21 Hz, 1H), 2,51-2,36 (m, 2H), 2,35-2,15 (m, 1H), 2,06-1,91 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDC

3) δ 168,1, 152,2, 148,4, 147,8, 141,3, 140,5, 139,0, 133,9, 131,9, 128,7, 126,9, 119,8, 118,2, 117,7, 116,9, 102,4, 100,7, 81,7, 61,5, 59,6, 56,7, 59,6 , 62,3, 45,1, 26,5. MS (ESI)

m

/

z

490 [M+H]

+

5(S)-3-((R)-6-(4-bromobenzyl)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (6b): Udbytte: 95%; smp 76 ° C; [Α]

D

25 = -146,0 (c = 1, dichlormethan); IR ν

max (cm

-1): 3493, 2939, 2837, 1759, 1622, 1596, 1497, 1479, 1271, 1213, 1115, 1079, 971, 789, 711, 644, 479, 811 , 746

1.HNMR (300 MHz, CDC

3) δ 7,37 (d, J = 8,30 Hz, 2H), 7,12 (d, J = 8,30 Hz, 2H), 6,92 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,28 (s, 1H), 6,04 (bs, 1H), 5,94 (s, 2H), 5,59 (bs, 1H), 4,57 (d, J = 3,77 Hz, 1H,), 4,14-3,89 ( m, 7H), 3,85 (s, 3H), 3,57 (d, 1 H), 2,46-2,09 (m, 3H), 2,00-1,84 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDC

3) o 168,1, 152,2, 148,5, 147,8, 141,0, 140,4, 138,0, 133,9, 131,8, 131,2, 130,4, 120,6, 119,8, 118,1, 117,7, 116,6, 102,4, 100,7, 81,5, 62,3, 61,0, 59,4, 59,3, 56,7 , 45,3, 26.6.MS (ESI)

m

/

z

568 [m + H]

+. HRMS (ESI) beregnet for C

28H

27NO

7: 568,0970, fundet: 568.0946.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(4-nitrobenzyl)-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (6c): Udbytte: 94%; smp 154 ​​° C; [Α]

D

25 = 68.0 (c = 1, dichlormethan); IR ν

max (cm

-1): 3490, 3078, 2931, 2901, 2837, 1751, 1620, 1520, 1499, 1389, 1343, 1274, 1213, 1080, 972, 852, 733, 610

1.HNMR (300 MHz, CDC

3) o 8,13 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 7,40 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 6,93 (d, J = 8,30Hz, 1H), 6,30 (s, 1 H), 6,01-5,92 (m, 3H), 5,62 (d, J = 3,77 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 3.77Hz, 1H), 4,27 (d, J = 14.35 Hz, 1H), 4,10 (s, 3H), 4,09 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,74 (d, J = 14,35 Hz, 1H), 2,44-2,28 (m, 2H), 2,23-2,13 (m, 1 H), 2,00-1,85 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDC

3) δ 168,1, 152,3, 148,6, 147,8, 147,1, 147,0, 140,6, 140,3, 134,0, 131,7 , 129,0, 123,4, 119,9, 118,1, 117,7, 116,3, 102,4, 100,8, 81,4, 62,3, 61,4, 59,5, 59,4, 56,6, 46,0, 27,0. MS (ESI)

m

/

z

557 [M + H]

+; HRMS (ESI) beregnet for C

28H

26N

2O

9Na: 557,1536, fundet: 557.1557.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(4-methoxybenzyl)-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (6d): Udbytte: 92%; smp 66 ° C; [Α]

D

25 = 6,66 (c = 1, dichlormethan); IR ν

max (cm

-1): 3492, 2936, 2836, 1759, 1613, 1511, 1269, 1115, 1013, 970, 821, 713, 517 cm

-1 1.HNMR ( 300 MHz, CDC

3) 7,15 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 6,92 (d, J = 8,12 Hz, 1H), 6,76 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 6,28 (s, 1 H ), 6,12 (d, J = 8,12 Hz, 1H), 5,93 (s, 2H), 5,58 (d, J = 3,58 Hz, 1H), 4,55 (d, J = 3,55 Hz, 1H), 4,10 (s, 3H ), 4,03 (m, 4H), 3,85 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,55 (d, J = 12,84 Hz, 1H), 2,50-2,13 (m, 3H), 2,04-1,83 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDC

3) δ 168,1, 158,5, 152,1, 148,4, 147,7, 141,2, 140,5, 133,9, 131,7, 130,0, 119,7, 118,1, 117,8, 113,4, 116,6, 102,4 , 100,6, 81,5, 62,3, 60,7, 59,3, 59,2, 56,7, 55,1, 44,8, 26.2.MS (ESI)

m

/

z

520 [m + H]

+ ; HRMS (ESI) beregnet for C

29H

29 NO

8NA: 542,1790, fundet: 542.1817.

(S)-3-((R)-6-(3-chlorobenzyl)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (6e): Udbytte: 92%; smp 62 ° C; [Α]

D

25 = 36,0 (c = 1, dichlormethan); IR ν

max (cm

-1): 3395, 3022, 2925, 2849, 1728, 1603, 1486, 1302, 1261, 1186, 1058, 811, 747

1.HNMR (300 MHz, CDC

3) o 7,29-7,12 (m, 4H), 6,99 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,34 (s, 1 H), 6,14 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (s , 2H), 5,67 (d, J = 3,77 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 3,77 Hz, 1H), 4,17-4,08 (m, 4H), 4,05 (s, 3H), 3,87 (s, 3H) , 3,63 (d, J = 13,59 Hz, 1H), 2,49-2,37 (m, 2H), 2,31-2,16 (m, 1H), 2,06-1,93 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDC

3) δ 168,1, 152,2, 148,5, 141,2, 140,9, 140,4, 133,9, 131,8, 129,4, 128,4, 127,0, 126,7, 119,7, 118,1, 117,7, 116,6, 102,3, 100,7, 81,7, 64,3, 62,4, 61,2, 59,5, 59,3, 56,6, 45,5, 26,8. MS (ESI)

m

/

z

524 [M+H]

+.

(S)-3-((

R

)-6-(3-bromobenzyl)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (6f): Udbytte: 97%; smp 65 ° C; [Α]

D

25 = 52,0 (c = 1, dichlormethan); IR ν

max (cm

-1): 3503, 2940, 2837, 1759, 1621, 1498, 1387, 1271, 1212, 1039, 891, 785, 695

1.HNMR: (300 MHz , CDC

3) o 7,40-7,30 (m, 2H), 7,24-7,09 (m, 2H), 6,99 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,34 (s, 1 H), 6,15 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (s, 2H), 5,66 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,60 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,17-4,06 (m, 4H), 4,04 (s , 3H) 3,87, (s, 3H), 3,63 (d, J = 13,78 Hz, 1H), 2,50-2,37 (m, 2H), 2,32-2,19 (m, 1H), 2,07-1,92 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDC

3) 168,1, 152,2, 148,5, 147,9, 141,5, 140,4, 134,0, 131,8, 131,4, 130,0, 129,7, 127,3, 122,2, 118,1, 117,7, 116,6, 102,4, 100,7 , 81,6, 81,1, 62,5, 61,1, 59,5, 59,3, 56,7, 45,4, 26,8. MS (ESI) m /z 568 [M+H]

+.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(3-methoxybenzyl)-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g] isoquinolin-5-yl) isobenzofuran-1 (3H) -on (6 g): Udbytte: 94%; smp 60 ° C; [Α]

D

25 = -144,01 (c = 1, dichlormethan); IR ν

max (cm

-1): 3501, 2941, 2836, 1760, 1620, 1598, 1497, 1387, 1268, 1212, 1012, 933, 786, 693

1.HNMR (300 MHz, CDC

3) o 7,21-7,11 (t, 1H), 7,00-6,89 (m, 2H), 6,84-6,72 (m, 2H), 6,33 (s, 1 H), 6,14 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (s, 2H), 5,67 (d, 4,53, 1H), 4,62 (d, J = 4,53 Hz, 1H), 4,10 (s, 3H), 4,03 (s, 3H), 3,88-3,80 (m, 7H), 3,63 (d, J = 12,84 Hz, 1H), 2,51-2,33 (m, 2H), 2,33-2,16 (m, 1H), 2,03-1,87 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDC

3) δ 168,1, 159,6, 152,2, 148,4, 147,8, 141,2, 140,7, 140,5, 133,9, 131,9, 128,8, 120,9, 119,9, 118,2, 117,7, 116,8, 113,6, 113,0, 102,4, 100,7 , 81,5, 62,3, 61,6, 59,4, 59,3, 56,7, 55,2, 45,2, 26,4. MS (ESI) m /z 520 [M+H]

+.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(2-oxopropyl)-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g] isoquinolin-5-yl) isobenzofuran-1 (3H) -on (6h): Udbytte: 98%; smp 179 ° C; [Α]

D

25 = -34,0 (c = 1, dichlormethan); IR ν

max (cm

-1): 3393, 2957, 2904, 2840, 1764, 1706, 1624, 1500, 1482, 1387, 1364, 1275, 1223, 1041, 1010, 941, 897, 828 , 710, 693, 538.cm

-1 1.HNMR (300 MHz, CDC

3) 6,90 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,28 (s, 1 H), 6,00-5,88 (m , 3H), 5,51 (d, J = 3,58 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 3,58 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H), 4,01 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 3,64 (d, J = 4,15 Hz, 2H), 2,50-2,39 (m, 2H), 2,37-2,29 (m, 1 H), 2,09 (s, 3H), 1,91-1,76 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDC

3) δ 167,7, 153,2, 148,5, 140,3, 140,2, 131,8, 120,2, 118,0, 117,7, 116,8, 102,4, 100,7, 96,0, 81,8, 67,6, 62,1, 59,4, 59,0, 56,6, 47,3 , 29,6, 28,2, 27,2. MS (ESI)

m

/

z

456 [M + H]

+; HRMS (ESI) beregnet for C

24H

25NO

8NA: 478,1477, fundet: 478,1470

Methyl. 2-((R)-5-((S)-4,5-dimethoxy-3-oxo-1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl)-4-methoxy-7,8-dihydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-6(5H)-yl)acetate (6i): Udbytte: 97%; smp 155 ° C; [Α]

D

25 = -66,6 (c = 1, dichlormethan); IR ν

max (cm

-1): 3488, 3006, 2947, 2919, 2851, 1755, 1627, 1590, 1484, 1387, 1265, 1214, 1085, 1017, 894, 789, 735, 696 , 546

1.HNMR (300 MHz, CDC

3) δ 6,96 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,31 (s, 1 H), 6,03 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 3,21 Hz, 2H), 5,52 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,86 ​​(d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,10 (s, 3H), 4,04 (s, 3H), 3,86 (s, 3H), 3,80 (d, J = 15,86 Hz, 1H), 3,65 (s, 3H), 3,54 (d, J = 15,86 Hz, 1H), 2,81-2,53 (m, 2H), 2,40-2,23 (m, 1 H), 1,94-1,74 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDC

3) δ 171,7, 167,8, 152,1, 148,3, 147,5, 140,2, 140,1, 134,2, 131,8, 120,1 , 117,9, 117,7, 117,3, 102,3, 100,7, 82,2, 62,1, 59,4, 58,2, 58,1, 56,6, 51,1, 47,3, 28.9.MS (ESI) m /z 494 [m + H]

+.

Ethyl 2-((R)-5-((S)-4,5-dimethoxy-3-oxo-1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl)-4-methoxy-7,8-dihydro-[1,3]dioxolo[4,5-

g

]isoquinolin-6(5H)-yl)acetate (6j): Udbytte: 98%; smp 92 ° C; [Α]

D

25 = -174,68 (c = 1, dichlormethan); IR ν

max (cm

-1): 3511, 2945, 2921, 2839, 1763, 1727, 1625, 1481, 1389, 1270, 1203, 1111, 1032, 931, 817, 790, 703, 614

1.HNMR (300 MHz, CDC

3) δ 6,90 (d, J = 8,12 Hz, 1H), 6,27 (s, 1 H), 6,01-5,82 (m, 3H), 5,44 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,84 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,19-4,00 (m, 8H), 3,85 (s, 3H), 3,83 (d, 1 H), 3,49 (d, J = 17,56 Hz , 1 H), 2,75-2,54 (m, 2H), 2,38-2,20 (m, 1H), 1,91-1,71 (m, 1 H), 1,24 (t, 3H)

13.CNMR (75 MHz, CDC

3) o 171,2, 167,7, 152,1, 148,3, 147,5, 140,3, 140,1, 134,2, 131,9, 120,2, 117,8, 117,7, 117,4, 102,3, 100,7, 96,0, 82,2, 62,2, 60,1, 59,4, 58,1, 56,6, 47,3, 29,0, 14,1. MS (ESI) m /z 486 [M + H]

+; HRMS (ESI) beregnet for C

25H

27 NO

9Na: 508,1583, fundet:.. 508,1578

X-ray krystallografiske analyse

X-ray data for forbindelserne 6h og 6i blev opsamlet ved stuetemperatur under anvendelse af et Bruker Smart Apex CCD diffraktometer med grafit monochromated MoKα stråling (λ = 0.71073Å) under anvendelse ω-scan metode [50]. Indledende lattice parametre og orientering matricer blev opnået fra fire sæt rammer. Integration og skalering af intensitet data blev opnået under anvendelse SAINT program. Strukturerne af 6h og 6i blev løst ved direkte metoder bruger SHELXS97 og raffinement blev udført af fuld matrix mindste kvadraters teknik ved hjælp SHELXL97 [50]. Anisotrope forskydning parametre blev inkluderet for alle ikke-hydrogen-atomer. Alle H-atomer bundet til C og N blev placeret i forskel Fourier kort og blev geometrisk optimeret og tilladt for som ridning atomer, med CH = 0,93-0,97 Å, NH = 0,86 Å, med U

iso (H) = 1.5U

eq (C) for methyl-H eller 1.2U

eq (C, N). De methylgrupper fik lov til at rotere, men ikke at tippe

Crystal data for 6h:. C

24H

25NO

8,

M

= 455,45, farveløs plade, 0,17 x 0,15 x 0,07 mm

3, orthorhombiske, plads gruppe

P

2

12

12

1 (nr 19),

en

= 8,7173 (12),

b

= 12,8144 (17),

c

= 19,436 (3) Å,

V

= 2171,2 (5) Å

3

Z

= 4,

D

c = 1,393 g /cm

3, F

000 = 960, CCD Area Detector, MoKα stråling, λ = 0,71073 Å,

T

= 294 (2) K, 2

θ

max = 50,0 °, 21015 refleksioner indsamlet, 2200 unik (R

int = 0,0227). Final Mule = 1,045,

R1

= 0,0279,

WR2

= 0,0774,

R

indeks baseret på 2086 reflektioner med I 2σ (I) (raffinement på F

2), 302 parametre, 0 begrænsninger, μ

= 0,105 mm

-1. CCDC 914.991 indeholder supplerende Krystallografiske data for strukturen. Den detaljerede belysning af krystalstruktur og analyse vil blive offentliggjort andetsteds

Crystal data for 6i:. C

24H

25NO

9,

M

= 471,45, farveløs nål , 0,18 0,12 0,08 mm

3, tetragonal, plads gruppe

P

4

32

12 (nr 96),

en

=

b

= 11,6748 (4),

c

= 32,753 (2) Å,

V

= 4464,3 (4) Å

3,

Z

= 8,

D

c = 1,403 g /cm

3, F

000 = 1984, CCD Area Detector, MoKα stråling, λ = 0,71073 Å,

T

= 294 ( 2) K, 2

θ

max = 50,0 °, 43048 refleksioner indsamlet, 2346 unik (R

int = 0,0252). Final Mule = 1,051,

R1

= 0,0396,

WR2

= 0,1095,

R

indeks baseret på 2198 reflektioner med I 2σ (I) (raffinement på F

2), 311 parametre, 0 begrænsninger,

μ

= 0,108 mm

-1. CCDC 914.990 indeholder supplerende Krystallografiske data for strukturen. Den detaljerede belysning af krystalstruktur og analyse vil blive offentliggjort andetsteds.

tubulin rensning.

tubulin blottet for mikrotubuli-associerede proteiner (kort) blev oprenset fra bovin hjerne ved cyklusser af temperaturafhængige polymerisering 0.072⟨

U

vdw

⟩−0.006⟨

U

elec

⟩−0.951⟨

U

cav

⟩. 0.7-5.6916a-5.997-62.8167.520.820-5.707–6b-6.918-60.2557.270.988-5.622–6c-6.087-63.6841.560.846-5.63991 8.0-5.5186d-6.882-64.8535.950.865-5.708–6e-6.907-61.8579.0910.972-5.852–6f-7.252-62.6276.071.287-6.18938 4.0-6.0366g-5.767-61.3464.560.445-5.227–6h-7.196-65.0855.791.033-6.003–6i-5.712-62.1241.140.723-5.40779 0.072⟨

U

vdw

⟩−0.006⟨

U

elec

⟩−0.951⟨

U

cav

⟩. hours

Sub-G

1

G

0/G

1

S

G

2/M

Sub-G

1

G

0/G

1

S

G

2/M

Sub-G

1

G

0/G

1

S

G

2/M

Noscapine0.2958.8510.2424.297.2419.484.1962.3830.6219.058.5337.365a0.2763.3712.9319.458.4613.474.0866.3741.5710.747.0839.256a1.4467.069.5320.178.1216.284.9463.1844.829.067.3937.726b0.7455.3912.1728.797.3719.424.1664.4243.1811.387.5335.846c0.8260.6611.4924.298.0820.724.8563.4936.7315.388.2738.416d0.5256.8212.2828.397.2722.734.6259.4145.388.297.8336.186e0.8762.5711.9323.158.1712.844.5768.4245.427.026.8338.526f1.0464.269.5122.479.4711.826.2967.4850.446.384.7237.296g0.6263.3212.9221.3710.8620.944.0862.2840.2912.768.0737.936h0.3561.1612.2925.0911.3712.255.9268.5848.737.196.2836.186i0.4657.4111.0827.1412.2519.574.6263.3840.1814.376.4337.156j0.3959.159.4724.358.2925.713.0966.1727.2422.168.6339.48Table