PLoS ONE: Modstand mod Paclitaxel i en Cisplatin-Resistant Kræft i æggestokkene cellelinje medieres af P-Glycoprotein

Abstrakt

IGROVCDDP cisplatin-resistente æggestokkræft cellelinje er også modstandsdygtige over for paclitaxel og modeller modstanden fænotype af recidiverende kræft i æggestokkene patienter efter første-line platin /taxan kemoterapi. En TaqMan lav massefylde array (TLDA) blev anvendt til at karakterisere ekspressionen af ​​380 gener associeret med kemoterapi modstand i IGROVCDDP celler. Paclitaxel resistens i IGROVCDDP medieres af gen og protein overekspression af P-glycoprotein, og proteinet er funktionelt aktivt. Cisplatin modstand var ikke vendes ved elacridar, der bekræfter, at cisplatin er ikke en P-glycoprotein substrat. Cisplatin-resistens i IGROVCDDP er multifaktoriel og medieres delvist af glutathion-vejen og nedsat akkumulering af lægemiddel. Totalt cellulære glutathion blev ikke øget. Imidlertid enzymaktiviteten af ​​GSR og GGT1 blev opreguleret. Den cellulære lokalisering af kobber transportør CTR1 ændret fra membran forbundet i IGROV-1 til cytoplasmatisk i IGROVCDDP. Dette kan mediere de tidligere rapporterede akkumulering defekt. Der blev nedsat ekspression af natrium kalium-pumpen (ATP1A), MRP1 og FBP, som alle har været tidligere var forbundet med platin ophobning defekter i platin-resistente cellelinier. Cellulær lokalisering af MRP1 blev også ændret i IGROVCDDP skiftende basolateralt, sammenlignet med IGROV-1. BRCA1 blev også opreguleret på gen- og proteinniveau. Overekspressionen af ​​P-glycoprotein i en resistent model udviklet med cisplatin er usædvanligt. Dette viser, at P-glycoprotein kan være opreguleret som en generaliseret stressrespons snarere end som et specifikt svar på et substrat. Mekanismer kendetegnet ved IGROVCDDP celler kan være gældende for tilbagefald æggestokkene kræftpatienter behandlet med frontline platin /taxan kemoterapi

Henvisning:. Stordal B, Hamon M, McEneaney V, Roche S, Gillet JP, O’Leary JJ, et al. (2012) Resistens over for paclitaxel i en Cisplatin æggestokke cancercellelinie medieres af P-glycoprotein. PLoS ONE 7 (7): e40717. doi: 10,1371 /journal.pone.0040717

Redaktør: Alexander James Roy Bishop, University of Texas Health Science Center på San Antonio, USA

Modtaget: Februar 23, 2012; Accepteret: 12 juni 2012; Udgivet: 11. juli 2012 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret af et Marie Curie International Incoming Fellowship fra EU 7. rammeprogram, og en irsk Cancer Society Postdoc Fellowship (BS) . Samarbejdet mellem Britta Stordal og National Cancer Institute blev understøttet af en Travel Fellowship fra den europæiske sammenslutning af Cancer Research. Denne forskning blev også støttet af Intramural Research Program for National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research (JPG, MG). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og ANALYSE, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

prognosen for kvinder med kræft i æggestokkene er meget dårlig. Størstedelen af ​​patienterne stede med fremskreden sygdom og overlevelsen hos disse patienter langsigtet er 10-30% [1]. Aktuel behandling af ovariecancer er kirurgi efterfulgt af platin /taxan kombinationskemoterapi [1]. Det kemoterapeutiske lægemidler cisplatin og paclitaxel anvendes i behandlingen af ​​mange faste tumorer, herunder ovariecarcinom. Cisplatin binder til DNA-strengen, kan hindre både DNA-replikation og RNA translation og til sidst udløser apoptose. Paclitaxel forårsager cytotoksicitet ved at binde til og stabilisere polymeriserede mikrotubuli. På grund af deres forskellige virkningsmekanismer, er Platinafstand og taxaner ofte kombineret i kræftbehandling. Initial lydhørhed over for kemoterapi i æggestokkræft er høj, men op til 80% af patienterne i sidste ende vil tilbagefald og blive platin /taxan resistent.

IGROVCDDP cisplatin-resistente æggestokkene cellelinie er en usædvanlig cisplatin-resistente model, som det er også krydsresistente over for paclitaxel. Når produceres erhvervet cisplatin resistens i cellelinier, kun 17% er også modstandsdygtige over for paclitaxel [2]. 41% af cisplatin resistente modeller er ikke modstandsdygtige over for paclitaxel og 28% af cellemodeller bliver overfølsomme over for paclitaxel [2]. Dette antyder, at størstedelen af ​​cancerpatienter ville drage fordel af modtager kemoterapi der veksler mellem cisplatin og paclitaxel, som udvikler resistens over for et lægemiddel er mindre tilbøjelige til at resultere i resistens over for den anden. Udfordringen er, hvordan man identificere, hvilke patienter vil reagere godt på vekslende terapi mellem cisplatin og paclitaxel. Dette skyldes, mens størstedelen af ​​kræftpatienter kan reagere godt på denne behandling strategi, korset resistente kohorte, ville reagere dårligt og har brug for at blive behandlet med alternativ behandling.

IGROVCDDP modeller modstanden fænotype af æggestokkene kræftpatienter, der har undladt standard frontline kombination platin /taxan kemoterapi. Kemoterapeutiske lægemidler som IGROVCDDP er påvirkelig kan være egnet til behandling af platin /taxan æggestokkræft. Undersøgelse af IGROVCDDP resistente model vil give os mulighed for at forstå mekanismerne i krydsresistens mellem Platinafstand og taxaner. Det er vores mål at omsætte molekylære markører for denne krydsresistens fænotyper til den kliniske behandling af recidiverende resistente ovariecancer.

Metoder

Cell Kultur og cytotoksicitet Analyser

human IGROV-1 ovarian cancer cellelinje og dets cisplatin-resistente variant IGROVCDDP blev opnået fra Prof. jan Schellens [3], [4]. Celler blev dyrket i antibiotikum og kemoterapi-frit RPMI (Sigma # R8758) med 10% FCS (Lonza, Belgien). Celler blev holdt i en fugtig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C, og var

mycoplasma-

gratis. At bestemme cytotoksicitet celler (1 x 10

4 celler /brønd) blev udpladet i fladbundede, 96-brønds plader og fik lov til at binde natten over. Brønde blev behandlet i tre eksemplarer med serielle fortyndinger af lægemiddel i et endeligt volumen på 200 pi. Stoffri kontroller blev indbefattet i hvert assay. Plader blev inkuberet i yderligere 5 dage og cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af en sur phosphatase assay [5].

TaqMan Low Density Array (TLDA)

Celler (1,25 × 10

6 celler /10 cm skål) blev udpladet og fik lov til at vedhæfte og vokse i 3 dage at nå 70-80% konfluens. Cellerne blev derefter trypsineret, vasket i 10 ml PBS, centrifugeres og supernatanten fjernes. Cellepellets blev opbevaret ved -80 ° C inden analyse. Total RNA blev fremstillet under anvendelse af en RNeasy Mini Kit (Qiagen, UK). Den TLDA vifte blev udført på biologiske tredobbelte prøver som beskrevet i Gillet

et al

. 2011 [6]. Medianen ekspression af hver prøve blev trukket fra alle genekspressioner for denne prøve. Dataene blev analyseret ved hjælp af

BRB ArrayTools

, en microarray-data statistisk analyse værktøj (https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) [7]. Gener udtrykkes af mindre end 50% af prøverne blev frafiltreret og en univariate to stikprøver T-test blev udført for at bestemme gener, der var signifikant forskellig mellem IGROV-1 og IGROVCDDP baseret på en p. 0,01 cutoff

Epirubicin Akkumulerende Assay

Celler blev udpladet ved en tæthed på 2,5 x 10

5 i en ikke-ventileret T25 kolbe. Den næste dag blev mediet fjernet, og cellerne blev behandlet med 1 pM epirubicin i 2 timer i nærvær eller fravær af 0,25 uM elacridar, 0,67 pM, 3,33 pM eller 33,3 pM cisplatin. Celler blev vasket med 4 ml kold PBS og trypsiniseret. Cellerne blev centrifugeret og resuspenderet i 1 ml PBS, og en celletælling udført (9 pi). De resterende celler blev centrifugeret, supernatanten fjernet, og pelleten opbevares ved -20 ° C inden analyse. Total epirubicin blev derefter kvantificeret ved LC-MS efter en væske-væske-præparat ekstraktion prøve, ifølge fremgangsmåden af ​​Wall

et al

. 2007 [8].

Total Cellular Glutathione Assay

Celler blev udpladet ved en densitet på 1,25 × 10

6 celler i en skål diameter 10 cm og lodes binde natten over. Cellerne blev lægemiddel behandlet i 24 timer, derefter trypsineret og en celletælling udført. Cellerne blev vasket i 10 ml PBS, centrifugeres og supernatanten fjernes. Cellepellets blev opbevaret ved -20 ° C inden analyse. Total glutathion blev bestemt ved anvendelse af en modifikation af Suzakake

et al

. [9]. Cellepellets blev lyseret i 150 pi vand og sonikeret, 12,5 pi af 30% sulfosalicyclic syre blev tilsat, og prøverne blev hvirvlet. Efter 30 minutter på is blev proteinfrie supernatanter opsamlet ved centrifugering (12000

g

i 5 minutter ved 4 ° C). Glutathion-koncentration blev bestemt under anvendelse af en reaktionsblanding indeholdende 20 pi lysat eller standard, 90 pi triethanolamin, pH 8,0 (0,2 M), 30 pi NADPH (4 mM) og 20 pi DTNB (6 mM). Efter 2 minutter ved 30 ° C blev reaktionen startet ved tilsætning af 0,3 enheder af glutathion reduktase per brønd. Pladerne blev aflæst ved 405 nm (forvarmning til 30 ° C) med kinetisk måling ved en pladelæser synergi HT, Bio-Tek® (MASON Technology). Hastigheden for ændring af den kinetiske assay blev derefter beregnet ved KC4 software

Glutathion reduktase (GSR) og Gamma glutamyltranspeptidase (GGT1) enzymassays

Cell kultur -. Celler (6,25 × 10

5 celler /10 cm skål) blev udpladet og fik lov til at binde natten over. Celler blev derefter behandlet med 0,67 uM cisplatin. Lægemiddelbehandlede celler og deres kontroller blev trypsineret og en celletælling udført. Cellerne blev derefter vasket i 10 ml PBS, centrifugeres og supernatanten fjernes. Pelleten blev resuspenderet i 400 pi kold enzymassay puffer (100 mM monobasisk kaliumphosphat, 100 mM EDTA, pH 7,5). 16 pi af 25 × Complete Protease Inhibitor (Roche, UK) blev tilsat, og prøven blev sonikeret. Efter centrifugering (13000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C) blev supernatanten opsamlet og nedfrosset ved -80 ° C inden analyse

GSR -. GSR (Sigma) standarder blev fremstillet i glutathionreduktase fortyndingspuffer ( 100 mM monobasisk kaliumphosphat; 100 mM EDTA; 1 mg /ml BSA; pH 7,5) i området fra 0.3-0.0037 enheder /ml. 40 pi af hver prøve og standard blev analyseret in duplo i 96 brønds plader. Reaktionsblandingen blev derefter tilsat 160 pi totalvolumen (2 mM oxideret glutathion (100 pi), 3 mM DNTB (50 pi), 2 mM NADPH (10 pi)).

GGT1- Denne metode blev tilpasset fra metoden til Silber

et al

. [10]. GGT1 (Patricell, UK) standarder blev fremstillet i vand i området fra 1000-1.6 enheder /L. 30 pi af hver prøve og standard blev analyseret i to eksemplarer på plader med 96 brønde. 100 pi reaktionsblanding blev derefter tilsat (60 mM gamma-glutamyl-p-nitroalinine (10 pi); 55,5 mM glyclglycine i 133,33 mM Tris Base, pH 8,5 (90 pi)).

Analyse – Pladerne blev læst ved 412 nM (forvarmning til 30 ° C) og 405 nM (forvarmning til 37 ° C) i GSR og GGT1 henholdsvis med kinetisk måling ved en pladelæser som beskrevet for glutathion-assayet.

Western Blots

celler (1,25 × 10

6 celler /10 cm skål) blev udpladet og fik lov at binde natten over. Cellerne blev derefter lægemiddel-behandlet med cisplatin og dyrket i 3 dage. Celler blev resuspenderet i 100 pi lysepuffer (0,01 M Tris /HCl, pH 7,4) og sonikeret. 20 ug protein blev fortyndet i Laemmli-prøvebuffer, kogt i 3 minutter, afkølet på is og sat på 12% Tris /glycin geler med en 4% stacking gel. Prøver og molekylvægtmarkører blev derefter electrophoresised i 90 minutter ved 100 V. Gelerne blev elektrooverført til 0,45 um nitrocellulose membraner (BioRad) i 90 minutter ved 100 V og med en våd overføringssystem (Biorad). Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri skummetmælk (Biorad) i PBS i 2 timer, derefter inkuberet med det primære antistof fremstillet i 3% skummetmælk /0,1% Tween /PBS (tabel 1) natten over ved 4 ° C [11 ]. Membranerne blev vasket i 0,3% Tween /PBS 3 x 10 minutter og derefter inkuberet i 1 time med et HRP-konjugeret sekundært antistof (tabel 1). Membraner blev igen vasket og eksponeret for luminol reagens (Santa Cruz) eller ECL avancerede western blotting-reagens (GE Healthcare). Membraner blev derefter eksponeret for autoradiografisk film. β-actin blots blev fremkaldt under anvendelse af et alkalisk phosphatase-antistof (tabel 1) og Sigma Fast BICP reagens. Densitometri på et minimum af n = 3 biologiske replikater blev udført ved hjælp Mængde One-software (Biorad), ved hjælp af lokale korrektion baggrund. Overflod af protein blev normaliseret til ponceau for hver prøve, og derefter hver biologisk serie blev normaliseret til IGROV-1.

konfokalmikroskopi

Celler (1,5 × 10

5 celler /brønd) blev udpladet i 8-brønds kammerobjektglas og lodes binde natten over. Alle vaske blev med PBS og alle inkubationer var ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Cellerne blev vasket to gange og fikseret med 4% paraformaldehyd (Sigma) i PBS i 30 minutter ved 37 ° C. Cellerne blev permabilised med 0,5% Triton-X-100 (Sigma) i 10 minutter og vasket to gange. Celler blev farvet med en 50 ug /ml fluorescerende TRITC opløsning i PBS i 40 minutter og derefter vasket to gange. Cellerne blev derefter inkuberet med blokeringsbuffer (0,02% BSA i PBS) i 30 minutter ved 37 ° C. Cellerne blev derefter inkuberet med primært antistof (tabel 1) i 2 timer i en fugtig atmosfære. Cellerne blev derefter vasket 3 gange i 5 minutter og inkuberet med sekundært antistof (tabel 1) i 1 time. Cellerne blev derefter vasket 3 gange i 5 minutter. Cellerne blev derefter dækglas under anvendelse monteringsmedie indeholdende DAPI (Sigma) og opbevaret ved 4 ° C før mikroskopi. Billeder blev taget til fange ved x63 forstørrelse og × 1 zoom. Scanninger blev udført ved 1 um interval dybder gennem fikserede celler, og enkelte eller flettede billeder præsenteres enten som XY enkelt planer gennem midtersektionen af ​​cellerne eller ortogonale visning.

Statistical Analysis

Alle eksperimenter blev udført ved minimum tre gange. To-prøve blev to tailed Students t-test, der anvendes til at bestemme signifikante forskelle ved hjælp af p . 0,05 som en afskåret

Resultater

Taxan Modstand i IGROVCDDP medieres af P-glycoprotein

IGROV-1 og IGROVCDDP celler blev analyseret for 380 gener associeret med kemoresistens af TLDA matrix for at karakterisere mekanismerne i platin og taxan modstand. 145 gener viste sig at være signifikant forskellig mellem IGROV-1 og IGROVCDDP baseret på en p 0,01 cutoff. Gener valgt til yderligere analyser var baseret på den mest betydningsfulde af p-værdi samt de veje, der tidligere er forbundet med platin og taxan modstand (tabel 2). Alle gener opført i tabel to blev valideret på proteinniveauet ved western blot.

genekspressionen af ​​P-glycoprotein (P-gp) øges i IGROVCDDP (tabel 2), og der er en tilsvarende stigning i proteinekspression (figur 1A). En 3-dages behandling med lav dosis cisplatin tendens til at øge P-gp-ekspression i både IGROV-1 og IGROVCDDP men dette var ikke signifikant (figur 1A). P-gp blev også bekræftet at være funktionelt aktiv i IGROVCDDP med en epirubicin ophobning assay (figur 1B). De IGROVCDDP celler har signifikant lavere niveauer af P-gp-substrat epirubicin efter en 2-timers eksponering i forhold til IGROV-1. Da IGROVCDDP blev behandlet med 0,25 uM af P-gp inhibitoren elacridar, som forhindrer virkningen af ​​lægemidlet pumpe [12] den akkumulerede masse af epirubicin steget og var signifikant højere end den af ​​de stiftende IGROV-1-celler. Stigningen over niveauet for IGROV-1 er en interessant observation, og kan skyldes de IGROVCDDP celler bliver så afhængige af P-glycoprotein for drug efflux; de lider mere akkumulering af stof, når det er hæmmet.

A) Western blot af P-glycoprotein, IGROV-1 (åbne søjler) og IGROVCDDP (grå søjler) med og uden behandling med 0,67 pM cisplatin i 72 timer (stribede søjler). Repræsentativt billede vist. Graf viser kvantificering af n = 6 biologiske gentagelser normaliseret til p-actin. * Angiver signifikant forskel fra IGROV-1 p 0,05 t-test. B) Ophobning af epirubicin bestemt ved LC-MS. IGROV-1 (åbne søjler) og IGROVCDDP (skraverede søjler). Celler blev behandlet med 1 pM epirubicin i 2 timer, 0,25 uM elacridar, 0,67 pM, 3,33 pM eller 33,3 pM cisplatin blev undersøgt som modulatorer af epirubicin akkumulering. Graf viser kvantificering af n = 3 biologiske gentagelser normaliseret til celle nummer. * Angiver en signifikant forskel mellem IGROV-1 og IGROV-CDDP, # Angiver en signifikant forskel på tilføjelsen af ​​en modulator (p 0,05 elever t-test). C) cytotoksicitet IGROV-1 og IGROVCDDP til P-glycoprotein og ikke P-glycoprotein substrater.

IGROVCDDP celler blev screenet for deres reaktion på en række kemoterapeutika (figur 1C). IGROVCDDP celler er signifikant modstå ikke-P-gp-substrater cisplatin og carboplatin [13]. IGROVCDDP er også betydeligt resistent over for P-gp-substrater [14]; taxaner, paclitaxel og taxotere, anthracyclin epirubicin og vincaalkaloid vinblastin. I modsætning hertil IGROVCDDP er overfølsomme over for behandling med ikke-P-gp-substrat 5-FU [15]. IGROVCDDP er resistent over for MRP1 substrat methotrexat [14], men ikke resistente over for BCRP substrat SN-38 (figur 1C) [16]. Behandling med 0,25 uM elacridar væsentligt vender modstanden i IGROVCDDP celler til alle de P-gp-substrater, men ikke modstanden mod cisplatin, carboplatin og methotrexat. IGROVCDDP celler er også mere følsomme over for elacridar behandling end IGROV-1 (tabel 3). IGROVCDDP celler er faldet mRNA-ekspression af BCRP (tabel 2) og det er ikke påviselig ved Western blot (data ikke vist). Dette antyder, at tilbageførslen effekter ses med elacridar behandling er specifikke for P-gp og ikke BCRP, der elacridar også hæmmer.

Virkningen af ​​co- eller forbehandling med cisplatin på paclitaxel cytotoksicitet blev undersøgt og ingen signifikant ændring blev observeret (data ikke vist). Tilsvarende havde co- eller forbehandling med paclitaxel ikke vende cisplatin modstand (data ikke vist).

platinmodstandstermometer er forbundet med en intracellulær skift af platin optagelse transporter CTR1 ikke resistens medieret af MRP2.

A) cytotoksicitet IGROV-1 og IGROVCDDP til CuSO

4. B) ATP7A western blot. Åbne barer er IGROV-1, skraverede søjler er IGROVCDDP og stribede søjler indikerer behandling med 0,67 pM cisplatin i 72 timer. Repræsentativt billede vist. Graf viser kvantificering af n = 4 biologiske gentagelser normaliseret til p-actin. C) CTR1 western blot. Repræsentativt billede vist. Graf viser kvantificering af n = 3 biologiske gentagelser normaliseret til p-actin. * Angiver signifikant forskel fra IGROV-1 p 0,05 t-test. CTR1 konfokalmikroskopi i D) IGROV-1 og E) IGROVCDDP celler. XY fly er vist for DAPI (blå), Golgi (rød) og CTR1 (grøn), en fusioneret billede er også vist.

MRP2, en transportør, der kan udstrømning cisplatin konjugater, var faldet genekspression i IGROVCDDP (tabel 2), men var ikke detekterbar ved Western blot i enten cellelinje (data ikke vist). Dette antyder, at der ikke er nogen rolle platin efflukstransporteren MRP2 i platinmodstandstermometer af IGROVCDDP. Kobber transportører kan også spille en rolle i platin optagelse (CTR1) og udstrømning (ATP7A og ATP7B) [17]. Et fald i CTR1 udtryk eller stigning i ATP7A eller ATP7B potentielt kunne mediere platin modstand. De IGROVCDDP celler er 2,26 gange resistent over for CuSO

4 (figur 2A) tyder på, at kobber metabolisme kan spille en vis rolle i mekanismen for resistens. Der var ingen signifikant ændring i mRNA-ekspression CTR1, ATP7A og ATP7B på TLDA array (data ikke vist). ATP7A proteinekspression tendens til at stige i IGROVCDDP som reaktion på cisplatin, men denne ændring er ikke signifikant (figur 2B). Men der var et signifikant fald i CTR1 ekspression som reaktion på cisplatin lægemiddelbehandling i IGROVCDDP celler (figur 2C). CTR1 er til stede i cellemembranen i IGROV-1 og forskyder intracellulært til cytoplasmaet i IGROVCDDP (figur 2D, E). Der er en vis sammenslutning af CTR1 med Golgi i IGROVCDDP men farvningen er konsekvent i hele cytoplasmaet.

Transporter som biomarkører for Platinum Ophobning Defekt

En af de fleste væsentlige differentielt udtrykte gener i IGROVCDDP blev et fald i ekspression af Na

+ /K

+ pumpe (ATP1A1) (tabel 2), som tidligere har været forbundet med platin ophobning defekter [18]. Cisplatin ikke transporteres af ATP1A1 og ændret membranpotentialet kan spille en rolle i den passive akkumulering af lægemidlet. Der var et tilsvarende fald i protein ekspression af ATP1A1 (figur 3A) og også en følsomhed over for behandling med ATP1A1 inhibitoren ouabain [19] (tabel 3). Men når 0,01 nM ouabain blev co-inkuberet i en cisplatin cytotoksicitetsassay snarere end at vende modstanden i IGROVCDDP det faldt IC

50 af både de IGROV-1 og IGROVCDDP celler ligeligt, folden modstand mellem de to cellelinier forblev konstant (tabel 3). IGROVCDDP var ikke resistent over for NaCl eller KCI som enkelte agenter og tilsætning af 40 mM af disse salte ikke signifikant ændrer cisplatin cytotoksicitet (data ikke vist).

Åbne barer er IGROV-1, skraverede søjler er IGROVCDDP og stribede bjælker angiver behandling med 0,67 pM cisplatin i 72 timer. A) ATP1A1 western blot. Repræsentativt billede vist. Graf viser kvantificering af n = 4 biologiske gentagelser normaliseret til p-actin. B) MRP1 western blot. Repræsentativt billede vist. Graf viser kvantificering af n = 3 biologiske gentagelser normaliseret til p-actin. * Angiver signifikant forskel fra IGROV-1 p 0,05 t-test. MRP1 konfokal mikroskopi i C) IGROV-1 og D) IGROVCDDP celler. Ortogonale billeder er vist for et flettet billede af DAPI (blå) og MRP1 (grøn), pile på den side søjler indikerer den apikale (IGROV-1) og basolaterale beliggenhed MRP1 (IGROVCDDP). FBP konfokalmikroskopi i E) IGROV-1 og F) IGROVCDDP celler. XY fly er vist for DAPI (blå), actin (rød) og FBP (grøn), en fusioneret billede er også vist.

Tidligere forskning har vist nedsat udtryk og en intracellulær skift af membranproteiner MRP1 og FBP at være forbundet med en defekt i platin akkumulering i cisplatin-resistente cellelinier [20]. Derfor undersøgte vi MRP1 og FBP som potentielle biomarkører for en defekt i platin ophobning i IGROVCDDP. De IGROVCDDP celler har et fald i mRNA-ekspression af MRP1 (tabel 2) samt et lille fald i MRP1 proteinekspression i respons på cisplatin-behandling (figur 3B). MRP1 fordeling blev undersøgt ved konfokal mikroskopi (figur 3C, D). Farvning i begge IGROV-1 og IGROVCDDP cellelinier er tydeligt i cytoplasmaet og perinukleære region med nogle ophobninger af MRP1 synlige. I IGROV-1 der er mere MRP1 ovenfor og gennem den blå linje på den ortogonale visning angiver det er i det apikale og midtersektionen i cellerne. Et flertal af farvning i IGROVCDDP er under den blå linie er det basolateralt placeret. FBP er lokaliseret hovedsageligt tilgrænsende til kernen inden diskrete sub-cellulære vesikler; lidt cytoplasmatisk farvning er tydelig (fig 3E, F). Der er ingen ændring i cellulær fordeling af FBP mellem IGROV-1 og IGROVCDDP, men et fald i ekspressionen af ​​FBP i IGROVCDDP fremgår af konfokale billeder.

Åbne barer er IGROV-1, skraverede søjler er IGROVCDDP og stribede bjælker angiver behandling med 0,67 pM cisplatin. A) Samlet intracellulær glutathion. Grafen viser n = 3 biologiske gentagelser normaliseret til celle nummer. B) γGCS western blot. Repræsentativt billede vist. Graf viser kvantificering af n = 4 biologiske gentagelser normaliseret til p-actin. C) GSR ​​western blot. Repræsentativt billede vist. Graf viser kvantificering af n = 3 biologiske gentagelser normaliseret til p-actin. D) GSR ​​enzymassay. Grafen viser n = 4 biologiske gentagelser normaliseret til celle nummer. E) GGT1 western blot. Repræsentant billede vist Graf viser kvantificering af n = 3 biologiske gentagelser normaliseret til p-actin. E) GGT1 enzymassay. Grafen viser n = 4 biologiske gentagelser normaliseret til celle nummer. * Angiver signifikant forskel fra IGROV-1 p 0,05 t-test. # Indikerer signifikant forskel fra IGROVCDDP om tilsætning af cisplatin. G) Modulation af cisplatin cytotoksicitet IGROV-1 og IGROVCDDP med BSO.

Platinum Resistance i IGROVCDDP er forbundet med en stigning i Glutathion Genbrug ikke Øget de novo syntese

mRNA-ekspression glutathion reduktase (GSR) og gamma-glutamyltranspeptidase (GGT1) blev begge signifikant forøget i IGROVCDDP (tabel 2). GSR funktioner til at genbruge oxideret glutathion i cellen [21], [22] og GGT1 genbruger glutathion udefra cellemembranen [21], [22]. Proteinet udtryk for GSR og GGT1 var ikke steget i de IGROVCDDP celler blev GSR signifikant nedsat i IGROVCDDP, og der var ingen ændring i GGT1. (Figur 4A og 4B). Imidlertid blev enzymaktiviteten af ​​både GSR og GGT1 signifikant forøget (figur 4C og figur 4D); tyder på, at glutathion er at blive genanvendt mere i og uden for cellen.

Åbne barer er IGROV-1, skraverede søjler er IGROVCDDP og stribede søjler indikerer behandling med 0,67 pM cisplatin i 72 timer. A) BRCA1 western blot. Repræsentativt billede vist. Graf viser kvantificering af n = 4 biologiske gentagelser normaliseret til p-actin. * Angiver signifikant forskel fra IGROV-1 p. 0,05 t-test

IGROVCDDP celler ikke har højere niveauer af glutathion, og niveauer er ikke steget med lavt niveau cisplatin behandling (figur 4E) . Niveauerne af glutathion var også mere variabel i IGROVCDDP celler. Behandling med 12,5 pM butathione sulfoximin (BSO), en inhibitor af γGCS [23] faldt betydeligt cellulær glutathion i både IGROV-1 og IGROVCDDP celler (data ikke vist). IGROV-1 og IGROVCDDP har også lignende proteinekspression af γGCS og det er ikke opreguleret i respons på lavt niveau cisplatin behandling (figur 4F). BSO behandling også signifikant sensibiliserede begge cellelinier for cisplatin (figur 4G). Men effekten var tilsvarende og cisplatin foldningsresistens forblev konstant (18,76 gange). De IGROVCDDP celler tendens til at være mere følsomme over for BSO behandling alene i en cytotoksicitet assay, men dette var ikke signifikant (figur 4G).

IGROVCDDP har Øget BRCA1 Expression

Øget udtryk for DNA reparation genet BRCA1 er tidligere blevet forbundet med cisplatin resistens [24]. IGROVCDDP celler har øget mRNA (tabel 2) og protein udtryk for BRCA1 (figur 5A).

Diskussion

P-gp overekspression er usædvanligt i en model af Erhvervet Cisplatin Resistance

Resistens over for paclitaxel i IGROVCDDP celler medieres af en overekspression af P-gp i genet (tabel 2) og proteinniveau (figur 1A). P-gp har vist sig at være funktionelt aktivt ved cytotoksicitetsassays (fig 1C) og epirubicin akkumulering assays (figur 1b). I modsætning til andre undersøgelser [25], men kortvarig cisplatin behandling ikke modulere P-gp-proteinekspression, aktivitet eller taxan cytotoksicitet i IGROVCDDP celler (figur 1A, 1B, data ikke vist). Det er usædvanligt, men ikke uden fortilfælde at se en model af erhvervet cisplatin resistens overudtrykker P-gp (tabel 4) [26] – [30]. Dette repræsenterer sandsynligvis en generaliseret stressreaktion til langsigtet cisplatin behandling som cisplatin ikke er en P-gp-substrat [13]. P-gp kan være opreguleret som del af et svar på forøgede reaktive oxygenarter (ROS) inden for en celle [31]. Dette kan være grunden til P-gp blev induceret i IGROVCDDP som ROS også produceres som reaktion på cisplatin [32]. Men da IGROVCDDP dyrkes uden cisplatin i medierne, synes der at være enten en anden stimulus favoriserer ekspression af P-gp eller P-gp leverer en selektiv fordel IGROVCDDP celler.

Mange modeller af erhvervet resistens vil have overekspression af en transportør, der effluxes det stof, der blev brugt til at udvikle modellen. Colchicin, et P-gp-substrat [33] der er valgt til P-gp overekspression i KB-8-5-11 celler [34] og epirubicin, en MRP1 substrat [35] induceret MRP1 udtryk i CCRF-CEM /E1000 [36]. Men methotrexat, fluoruracil, chlorambucil, cisplatin, og hydroxyurinstof har alle vist, at transient inducere ekspressionen af ​​P-gp i K562 leukæmiceller når disse lægemidler er ikke P-gp-substrater [15]. Det er så op til naturlig udvælgelse, hvis de celler, der transient udtrykker P-gp har andre overlevelsesfordel og bliver en del af den lægemiddel-resistente cellelinie. I nogle cisplatin-resistente modeller, som overudtrykker P-gp, P-gp har ingen overlevelsesfordel som ikke er funktionelt aktivt (SNU-601 /Cis10 – tabel 4) [29]. Inden cisplatin-resistente P-gp overudtrykkende cellelinjer kan der også være heterogenitet; i SKOV3 /CIS P-gp positive og negative populationer blev opretholdt efter behandling med cisplatin, hvilket indikerer, at P-gp har ingen overlevelse fordel for cisplatin behandling [27]. Imidlertid kan P-gp har anti-apoptotiske virkninger er forskellige fra dem i forbindelse med transport af cytotoksiske lægemidler, og nogle kan medieres gennem udstrømning af pro-apoptotisk glucosylceramid [37], [38]. Det er også muligt, at nogle xenobiotikum stede i FCS anvendes til dyrkning af cellerne kunne medvirke til at holde den P-gp-ekspression i IGROVCDDP.

IGROVCDDP er den eneste cisplatin-resistente model udviklet fra IGROV-1 vides at overudtrykke P-gp og derfor har en platin /taxan-resistente fænotype. Cisplatin-resistente modeller IGROV-1 /Pt0.5 og IGROV-1 /Pt1 [39] har den inverse platin /taxan-resistente fænotype. Andre cisplatin-resistente IGROV-1 modeller er blevet udviklet (IGROV-R10, IGROV-1 /CP), men de synes ikke at have været undersøgt for resistens over for P-gp-substrater eller P-gp udtryk. Men P-gp ikke er blevet identificeret, som differentielt udtrykt af genomisk eller proteomiske profilering [40] -. [44]

Platinum Resistance er multifaktoriel

Platinum modstand i IGROVCDDP celler er multifaktoriel og involverer glutathion pathway og nedsat akkumulering af lægemiddel. Dette kan resultere enten fra en kompleks regulatorisk vej som styrer mange forskellige mekanismer til giver resistens over for cisplatin, eller kunne afspejle, at cellerne blev valgt i flere trin, og kunne derfor har akkumuleret forskellige mekanismer på hvert trin.

IGROVCDDP celler er lavt niveau resistent over for CuSO

4 antyder en rolle kobber transport i platinmodstandstermometer (figur 2A).