PLoS ONE: kræft i bugspytkirtlen patientoverlevelse korrelerer med DNA Methylering af Pancreas Development Gener

Abstrakt

DNA methylering er en epigenetisk mærke i forbindelse med regulering af transskription og genom struktur. Disse markører er blevet undersøgt i en række indstillinger kræft for deres anvendelighed i at differentiere normalt væv fra tumorvæv. Her undersøger vi den direkte sammenhæng mellem DNA methylering og patient overlevelse. Vi finder, at ændringer i DNA-methylering af vigtige pancreas udviklingsmæssige gener er stærkt forbundet med patientens overlevelse

Henvisning:. Thompson MJ, Rubbi L, Dawson DW, Donahue TR, Pellegrini M (2015) kræft i bugspytkirtlen Patient Survival korrelerer med DNA Methylering af Pancreas Development Genes. PLoS ONE 10 (6): e0128814. doi: 10,1371 /journal.pone.0128814

Academic Redaktør: Max Costa, New York University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Januar 5, 2015; Accepteret: April 30, 2015; Udgivet: 3 Juni 2015

Copyright: © 2015 Thompson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Data for denne undersøgelse er nu tilgængelige på Gene Expression Omnibus (GEO) under tiltrædelsen kode GSE67205. Det kan findes her: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE67205

Finansiering:. Blev givet støtte til bugspytkirtlen væv banking (DWD) af hirshberg Foundation for bugspytkirtlen Research. M.J.T. blev støttet af tilskud P01 GM099134

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft-dødsfald i USA [1]. Det 5-års overlevelse på 6% for patienter med pancreas ductusceller adenokarcinomer (PDAC) er den laveste for nogen fast kræft. Tidlig opdagelse vurderes at være nødvendig for at forbedre patientens overlevelse, da de fleste patienter til stede med fremskreden, ikke-operabel sygdom [2, 3]. Nylige fremskridt i teknologier til genom-dækkende målinger hæve håb for identifikation af sådanne tidlige biomarkører, samt nye terapeutiske mål.

Flere dybe sekventering indsats har identificeret et stort antal meget heterogene mutationer (~ 63 i gennemsnit) med fire mutationer forekommer ved høj frekvens (KRAS, CDKN1A /P16, TP53 og Smad4) i PDAC [4, 5] Disse centrale mutationer har vist sig at mekanistisk drive tumorigenese i dyremodeller med Smad4 associere med dårlig prognose [6]. Genekspressionsanalyse af primære tumorer har muliggjort konstruktionen af ​​multi-gen-profiler, der kan forudsige metastatisk sygdom og kortere patientoverlevelse i uafhængige datasæt, men disse endnu ikke er anvendt i klinisk beslutningstagning [7, 8]. Ved at kombinere flere sæt kliniske data, tre molekylære undertyper af PDAC der forudsiger overlevelse og respons på behandling i eksperimentelle modeller er blevet udviklet [9]. For nylig blev 171 gener med prædiktiv biomarkør potentiale identificeret ved at kombinere mRNA-ekspression, DNA-kopi nummer variation og miRNA niveauer [10].

Men til dato, mindre om ændringer i DNA-methylering tværs bugspytkirtelkræft undertyper. DNA methylering har fået meget nylige interesse for sin rolle i cancer biologi. Afvigende mønstre af DNA-methylering er kendt for at være forbundet med carcinogenese og påvirke reguleringen af ​​genom stabilitet og gentranskription [11]. Genom-dækkende undersøgelser af CpG øer har afdækket tusindvis af loci, hvor forskellen methylering kan adskille bugspytkirtlen tumorvæv fra normalt væv [12, 13]. Trods disse fremskridt brugen af ​​ændringer i DNA-methylering til at forudsige bugspytkirtlen patient overlevelse forbliver uudforsket.

Her undersøger vi den direkte sammenhæng mellem PDAC patient overlevelsestid og methylering af individuelle CpG sites opnået fra reduceret repræsentation bisulfit sekventering ( RRBS). Talrige statistisk signifikante ændringer i methylering korrelerede direkte med patienten overlevelse. Vi observerede en stærk berigelse af disse sites blandt gener involveret i celle-skæbne bestemmelse i bugspytkirtlen. I modsætning til sekventering indsats, der identificerede cellulære signalveje, disse resultater antyder, at cellulær identitet, som dikteret af tumorens epigenome, kan være en vigtig del af klinisk aggressiv PDAC. Endelig har vi yderligere valideret evne et par eksempler sites at adskille patienterne baseret på overlevelsestiden, hvilket tyder på muligheden for at udvikle kliniske biomarkører baseret på mere omfattende methylering analyse.

Resultater

Clinicopathologic karakteristika af prøverne

tabel 1 giver en oversigt over statistik for de patienter, der anvendes i dette arbejde. Individuelle patientdata kan findes i S1 tabel. Alle patienter havde tidlige fase PDAC og modtog adjuverende kemoterapi. På tidspunktet for analysen, 9 patienter havde tilbagevendende sygdom (median sygdomsfri overlevelse (DFS) på 15,0 måneder), mens 9 patienter var døde af sygdommen (median sygdomsspecifikke overlevelse (DSS) på 25,0 måneder). DFS refererer til intervallet mellem behandling eller fjernelse af tumoren og recidiv af sygdommen, mens DSS refererer til intervallet mellem oprindelige diagnose og patientens død hvor dødsårsag var sygdommen. For dette arbejde har vi anvendt DSS udelukkende. På tidspunktet for denne analyse 9 patienter var afdøde og 2 blev stadig lever. Disse clinicopathologic egenskaber og overlevelse resultater ligner andre offentliggjorte kohorter af PDAC.

nedsat repræsentation bisulfit sekventering

Kortlægning af alle kvaliteten læser til referencen humane genom (hg19) gav ~ 5 millioner CpG steder, hvor en sikker methylering frekvens kunne anslås i mindst én af de 16 prøver. Anvendelse af datakvalitet filtre forklaret ovenfor reduceret dette til en endelig række 251,566 methylering steder, der anvendes i alle efterfølgende analyse.

Principal Component Analysis Adskiller Tumor fra ikke-tumor

Principal komponent analyse (PCA ) af methylering profiler for de 16 prøver blev udført. Fig 1 viser en projektion af prøverne på de første to hovedakser. Langs den første princip komponent der er adskillelse af tumorprøver. Langs den anden hovedakse er der en klar adskillelse mellem tumor prøver og de normale og pancreatitis prøver. Den første komponent forklarer 24% af variansen i methylering data, mens den anden komponent forklarer yderligere 21%.

For at få indblik i biologi ligger til grund for adskillelse af prøver langs de to principielle komponenter, vi valgte de 500 største størrelsesorden koefficienter for både positive og negative retninger langs hver akse. Da disse koefficienter svarer til CpG sites forelagde vi dem til genomiske regioner Berigelse af anmærkninger Tool (store) server til anmærkning [14]. For første hovedakse (se S2 tabel) de stærkeste negative bidrag kommer fra gener involveret i pancreasudviklingen (fx ONECUT1, PDX1, Sox9, FOXA2, …). De stærkeste positive bidrag dog ikke kommer fra et sæt gener med så sammenhængende en funktionel anmærkning som negativer undtagen med hensyn til insulin menneskehandel og sekretion; BACE2 og PIM-3, som også er kendt for at fremme human pancreascancer vækst [15].

I det andet princip akse (se S3 tabel) de stærkeste negative bidrag kommer fra udviklingsmæssige gener for af et stort antal vævstyper og organsystemer. De stærkeste positive bidrag kommer fra transmembrane receptor protein kinaser. Den mest bemærkelsesværdige bidrag kommer fra MST1R som har været impliceret i KRAS onkogen aktivering i PDAC [16].

I betragtning af adskillelsen mellem tumor prøver baseret på methylering af gener er vigtige for udvikling, vi flyttede at undersøge, om der kan være en korrelation mellem methylering af disse gener og sygdomsspecifikke overlevelse af patienterne.

Definition af

Survival +

Survival-

vilkår for methylering sites

Vi observerede, at methylering websteder med positive eller negative Cox regression scores dannet to grupper med forskellige egenskaber, som beskrevet nedenfor. For at forenkle konceptualisering og henvisninger af disse to grupper, vi definerede dem som “

survival-”

eller “

overlevelse +

“, begge signifikant korreleret med øget methylering. For

survival-

, øget methylering var forbundet med kortere overlevelsestid. Omvendt for

overlevelse +

øget methylering var forbundet med længere overlevelsestid. Baseret på vores filtreringskriterier og anvende ap ≤ 0,05 tærskel for signifikans, opnåede vi et sæt af 17,251

overlevelse +

sites og 3256

survival-

sites.

Individuel CpG websted methylering korrelerer med patientens overlevelse

vi testede, om andre kliniske variable kendt for at påvirke DNA methylering kan redegøre for korrelationerne vi observerer. Vi udførte den samme Cox regression med censurere for hvert websted methylering mod både patientens alder og tumor indhold (cellularitet). Vi tog derefter Cox scores baseret på overlevelse og der er baseret på hver enkelt af de andre variabler og beregnet Pearson korrelationen mellem de to koefficienter blandt alle de steder i hver af de

overlevelse +

survival-

sites. For tumor kvalitet, var korrelationen 0,06 og for alder, var 0,08. Anvendelse af kun de steder af interesse for denne undersøgelse (dem med p-værdi 0,05 i overlevelse og methylering sammenligning) gav korrelationer af 0,16 for alder og -0,12 for tumor kvalitet. Desuden er antallet af steder, hvor korrelation var statistisk signifikant for både methylering og alder eller methylering og tumor indhold var helt lille (n ~ 10). Vi konkluderer derfor, at korrelationer mellem methylering niveauer og overlevelsestid ikke væsentligt påvirket af patientens alder eller tumor indhold.

Funktionel analyse afslører nøgler gener i bugspytkirtlen celle skæbne engagement

Brug af

overlevelse +

survival-

methylering sites individuelt og hele ~ 250K methylering sites som baggrund, brugte vi den fantastisk værktøj til at søge efter signifikante sammenhænge med forskellige funktionelle kategorier og veje [17]. En delmængde af de betydelige foreninger fundet af disse forespørgsler er angivet i tabel 2 for

survival-

websteder og tabel 3 for

overlevelse +

sites.

for

survival-

sæt af methylering sites, vi observeret en række væsentlige foreninger med udviklingsprocesser og stier er specifikke for bugspytkirtlen, herunder vigtige gener involveret i transkriptionel regulering bestemmer cellulær differentiering i bugspytkirtlen. Links blev også noteret mellem gener og processer neural celledifferentiering, en konstatering bemærket tidligere i en både en exome sekventering indsats [5] og en DNA-methylering undersøgelse af PDAC [13].

figur 2 er en skematisk afbildning af cellelinier i bugspytkirtlen tilpasset fra Zaret,

et al

. [18]. Gener fremhævet med rødt blev beriget i

survival-

sæt, herunder HHEX, ONECUT1, ISL1, NKX2-2, og Pax6. HHEX, et homeobox gen, er kritisk for pancreas udvikling og ONECUT1 er nødvendig for rettidig udtryk for PDX1 og NEUROG3 i både ryg og bugspytkirtlen endoderm [19, 20]. NKX2-2 kræves for pancreas-beta-celleudvikling [21], er ISL1 kræves til ø-celle udvikling [22], og, Pax6 er nødvendig for differentieringen af ​​alfa-celler [22]. Salg

Gener, der er godt -Etableret som at spille centrale roller i celle skæbne er angivet ved navn. Navne markeret med rødt er gener beriget for

survival-

methylering sites.

Det er tidligere blevet rapporteret, at hypermethylering af ISL1 korrelerer med nedsat genekspression og aggressiv progression af invasiv blærekræft [23]. Methylering af NKX2-2 blev identificeret som en del af en signatur for glioblastoma multiforme [24]. Endelig blev hypermethylering af Pax6 observeret at korrelere med dårlig klinisk resultat i gastrisk kræft [25, 26], udvikling af ikke-småcellet lungecancer [27] og transkriptionel deaktivering i invasiv duktalt brystcarcinom [28, 29].

survival-

og

overlevelse +

har forskellige positionelle tilbøjeligheder

fig 3A plotter log-odds ratio for

survival-

og

overlevelse +

sites på forskellige afstande fra transskription start-steder af deres nærmeste gener.

survival-

sites, som har de klareste annotation resultater blev væsentligt beriget med promotor-regioner af gener. I modsætning hertil

overlevelse +

methylering sites, der, som en gruppe, har mindre sammenhængende tilknytning til bestemte funktionelle anmærkninger fordelte mere bredt og distal til generne “transskriptionelle start- sites. Tilsvarende de to kategorier af methylering sites har forskellige statistiske egenskaber. Fig 3B er et histogram af gennemsnitlige methylering værdier for methylering steder i begge kategorier. Survival- og overlevelse + steder synes at have næsten separate og adskilte fordelinger af methylering værdier. Mens survival- sites tendens til at have lav methylering der øger med forkortede overlevelsestider, er overlevelsen + kategori overvældende bestående af bindingssteder for CpG, som er hyper-methyleret. Vi bemærker, at disse to fordelinger afspejler baggrunden distribution af alle steder (se S1 Fig). Den overflod af overlevelse + steder i forhold til survival- sites afspejler større baggrund fordeling af hypermethyleret CpG’er. Som hypomethylated regioner af genomerne typisk er forbundet med transkriptionelle startsteder, er det sandsynligt, at de survival- steder er mere direkte relateret til transkriptionelle ændringer end overlevelsen + sites, som ofte i distale intergeniske regioner, og har en mindre klar sammenhæng til transkriptionelle regulering.

(A) Enrichment (log -odds

ratio) på

overlevelse +

survival-

steder i forskellige afstande beholdere i forhold til de transkriptionelle start- sites ( TSS) af deres nærmeste gener. (B) Histogram af gennemsnitlige methylering scoringer for CpG sites kategoriseret som

survival-

og

overlevelse +

.

Mod Biomarkør Development

Specifikke eksempler af sammenhængen mellem methylering og patient overlevelse er vist i figur 4. fig 4A viser tre gener (FAM150A, ONECUT1, og RASSF10), der blev lokalt beriget for

survival-

sites. Panelet viser den kromosomale placering, struktur, og et forstørret billede af methylering af DNA spor for de 11 PDAC patienter med deres overlevelse i måneder, der er anført til venstre af sporet samt spor i 2 pancreatitis og 3 normale prøver. Den laveste del af Fig 4A panel afbilder spor til transskriptionsfaktorbindende regioner opnået fra KODE projektet [30]. Fig 4B viser Kaplan-Meier-kurver for tre specifikke sites-hver taget fra genet umiddelbart over det. En gratis sæt af eksempler med

overlevelse +

sites findes i S2 Fig.

(A) Tre gener hvor øget methylering i promotorområdet stærkt korrelerer med nedsat patient overlevelse. Også vist er spor svarende til transskriptionsfaktorbindende beviser. (B) Kaplan-Meier-kurver for et websted fra hvert gen forekommer inden en transkriptionsfaktor bindingssted.

Sammenligning med kendte PDAC-associerede gener

Anvender et gen-centreret tilgang, vi tælles antallet af signifikante methylering sites (

overlevelse +

eller

survival-

) forekommer i et givent gen plus en 5 kb forlængelse opstrøms af transkriptionsstartsitet. Vi derefter sorteres disse to lister og undersøgte de 10 poster i hver. Den komplette liste over gener og antallet af betydelige methylering websteder for hver er givet i S4 tabel.

Desuden har vi set på overlap mellem vores gen-sæt og sæt af gener med mutationer afsløret i to omfattende sekventering studier af bugspytkirtlen cancere [4, 5]. For vores gen-lister, vi tog kun dem, der havde 10 eller flere betydelige methylering sites (for at reducere falske opdagelse på et enkelt sted). Dette gav os 32 gener for

survival-

sæt og 54 gener for

overlevelse +

sæt. Kun én (COL5A1) optrådte i både en liste af muterede gener [4] og

overlevelse +

listen, mens ingen overlapning blev bemærket med

survival-

indstillet. Denne mangel på overlapning mellem gener beriget for survival- og overlevelse + methylering steder og gener, der er forbundet med kræft i bugspytkirtlen mutanter skyldes to faktorer. Den første er, at vi anvendte strenge kriterier for gener, der skal overvejes for at minimere falsk opdagelse, og derfor har vi ikke nødvendigvis fanget alle epigenetiske ændringer. Den anden, og sandsynligvis mere vigtig observation er, at PDAC-associerede mutante gener ikke beriget med pancreas udviklingsmæssige gener, men snarere for signalveje. Således mutationer i disse signalveje sandsynligvis bibringe overlevelse fordele for tumorer, mens udviklingsmæssige ændringer, giver overlevelse fordele mere effektivt moduleret selvom epigenetisk snarere end genetiske ændringer.

Diskussion

Genomisk ændringer og genekspression ændringer i forbindelse med kræft i bugspytkirtlen er blevet undersøgt intensivt, og er blevet identificeret en række kritiske gener [4, 31, 32]. Kvantitativ integration af flere data-kilder til genomiske forandringer, genekspression og epigenetisk regulering med patient overlevelse har hjulpet til at karakterisere forholdet mellem PI3K /AKT og SRC veje [10], og PDAC progression. I modsætning til tidligere undersøgelser, har vi vedtaget den

survival-

tilgang med fokus på potentiel epigenetisk regulering via DNA methylering.

Vi fandt, at methylering af CpG sites forbundet med patientens overlevelse i ~ 20.000 tilfælde ud af ~ 250.000 målt. Disse websteder faldt i to kategorier, vi kaldte

survival-

og

overlevelse +

repræsenterer forholdet mellem øget methylering til overlevelse. Vi fandt også, at disse to typer af sider havde distinkte positionelle tilbøjeligheder forhold til de transkriptionelle startsteder af gener. Mens

survival-

sites klynger nær TSS-svarende til hypermethylering af promotorområder,

overlevelse +

steder blev mere bredt fordelt intragenically. Som et resultat af denne opdeling, og de generelt mere fuldstændigt forstået og karakteriseret promotorområder af gener,

survival-

sites gav klarere inddrivelse af funktionel annotation og gener i den samlede indtægt.

Mens langt størstedelen af ​​DNA methylering undersøgelser har fokuseret på status methylering af initiativtagerne og CpG øer, der er stigende tegn på, at intron methylering og /eller methylering websteder, der ikke er en del af CpG øer også spille en rolle i modulering af genekspression [33, 34] . Det menes, at disse methylering af disse inden for fremkaldende sites påvirker rolle forstærkere af transkription [35-37]. Vores undersøgelse giver tiltro til dette som hovedparten af ​​væsentlige ændringer methylering vi observerede var i

overlevelse +

kategori (ikke proksimalt for TSS).

Genet FAM150A havde det største antal

survival-

sites. Mens ikke velkarakteriserede i litteraturen, i en nylig undersøgelse af nyrecellecarcinomer, blev det konstateret at være hypermethyleret i klyngen af ​​patienter med aggressiv cancer og ringe overlevelse [38, 39]. Rolle ONECUT1 (HNF6) i pancreasudviklingen er veletableret. Især menes det at fungere som en fænotypisk switch i acinære-til-duktalt metaplasi, der kan føre til pancreas intraepitelialneoplasi og efterfølgende PDAC [40]. Studier i mus indikerer ONECUT1 har tumorsuppressoraktivitet [41]. Et andet velkendt tumorsuppressor i vores top 10 liste er RASSF10. Nylige undersøgelser har identificeret det som epigenetisk tavs via promotor hypermethylering i en række cancere [42-52]. RNF207 blev også for nylig identificeret som en tumor suppressor i neuroblastomer [53]. PCDH9 ofte tabt i hepatocellulære karcinomer, dets nedregulering er forbundet med tumorceller migration, og PCDH9-negative tumorer korrelerer med betydeligt kortere overlevelsestid for gliom patienter [54, 55]. Ligeledes er tab af en allel af BRF1 associeret med en række forskellige tumorer [56]. Som en underenhed af TFIIB, dereguleringen af ​​dette gen bidrager sandsynligvis til deregulering af RNA pol III transskription bredt observeret i cancerceller [57].

Af top 10

survival-

gener, kun tre (MAP6, RIN3, og HIST1H2BI) manglede klare beviser for en onkogen eller tumor-suppressor rolle i litteraturen. RIN3 er en negativ regulator af mastcelle respons på stamcellefaktor [58], og kan spille en suppressiv rolle i tumorindtrængen. HIST1H2BI synes ikke at have en kendt rolle i cancer bortset fra en generel kromatin strukturel rolle.

Den resterende gen i vores top 10 liste koder for en miRNA (MIR96) kendt for at undertrykke KRAS og fungere som en tumorsuppressor i pancreascancer [59]. Som et resultat, vi undersøgte også andre miRNA optræder i vores

survival-

gen listen. Dog ikke i top 10, fandt vi to mere miRNA gener med mere end 5 betydende methylering sites. MIR130B nedreguleres i bugspytkirtelkræft væv og dens udtryk er en nyttig prognostisk for bugspytkirtlen kræftpatienter [60]. MIR196A1 er også blevet identificeret som havende afvigende udtryk forbundet med unormal apoptose, invasion og spredning af bugspytkirtelkræftceller [61].

Undersøgelse af 10 gener med de mest talrige

overlevelse +

sites gav følgende fund. PTPRN2 er et velkendt medlem af de store auto-antigener i insulin-afhængig diabetes mellitus. Det er også blevet identificeret som en hypermethyleret biomarkør i planocellulært lungecancer [62]. CDH4 er afvigende methyleret i sin promoter region i mave- og tarmkræft og kan fungere som en epigenetisk tavshed tumor suppressor i nasofaryngealt karcinom [63, 64]. MAD1L1 er en velundersøgte cellecyklus checkpoint genet med mutationer impliceret i mange forskellige typer cancer [65]. CBFA2T3 findes i pædiatrisk akut myeloid leukæmi og er involveret i kromosomale translokationer og fusion proteinprodukter (CBFA2T3-GLIS2) [66]. Afvigende methylering af CBFA2T3 promotoren er fundet i bryst- cancervæv sammenlignet med normal [67]. CBFA2T3 findes også i IGH kromosomale translokationer i pædiatrisk B-celle lymfom [68]. Den collagen-remodeling gen, COL5A1, blev anvendt i en 10-genekspression signatur forbundet med dårlig patientoverlevelse i høj kvalitet serøs ovariecancer og dets ekspression tilsyneladende promoverer metastase [69]. CAMTA1 er en tumorsuppressor kandidat sig at inhibere væksten i neuroblastomer og synes at spille en rolle i udviklingen af ​​gliom stamceller [53, 70-72]. Den H3K9me1 methyltransferase PRDM16 hjælper med at beskytte genomisk integritet [73]. Translokationer af dette gen findes i akut myeloid leukæmi og myelodysplastisk syndrom og korreleret med dårlig patientoverlevelse [74]. SHANK2 er blevet foreslået som en ny onkogen som sin overekspression i esophageal planocellulært karcinom er associeret med celledeling og beskyttelse mod celledød [75].

For to af de 10 gener der var lidt litteratur annotation . Høje niveauer af RBFOX4 protein er blevet fundet i supratentoriale ependymomas. [76], mens der er væsentlige ingen link i litteraturen til en cancer forening for TRAPPC9.

Som vi fandt interessante miRNA i vores sæt af

survival-

gener, vi kiggede efter dem i

overlevelse +

sæt, så godt. På trods af de større antal af

overlevelse +

sites i forhold til overlevelse site, var der ingen miRNA gener forbundet med mere end 5 i denne klasse af sites.

Efter en nærmere undersøgelse af de enkelte gener, der er forbundet med flere forekomster af

overlevelse +

survival-

sites, fandt vi, at næsten alle var blevet identificeret via andre undersøgelser med andre typer data som spiller en rolle i kræft, selv om de ikke er blevet undersøgt specifikt i forhold til PDAC. Vores resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser rapporterer korrelationer mellem promotor hypermethylering eller transskription inaktivering for flere centrale udviklingsmæssige regulatoriske gener eller gener med tumor undertrykkende kapacitet i andre kræftformer. De veje, der er beriget til

survival-

relaterede epigenetiske ændringer svarer til nogle af de veje, der tidligere er identificeret i bred forstand. Fremkomsten af ​​3 miRNA gener i vores

survival-

sæt, som alle er blevet identificeret som centrale transskription regulatorer i PDAC, er af partikulært note og giver os større tillid til den tilgang, vi har taget.

Endelig, som en indledende test af det potentielle forudsigende nytte af DNA methylering for kræft i bugspytkirtlen patient overlevelse, vi testede 3

survival-

sites forekommer i 3 gener med flere

survival-

sites på steder, hvor der er tegn på proteinbinding. De methylering værdier ved hver af disse steder kunne dichotomize patienterne i korte overlevelse og længere overlevelse med statistisk signifikans.

Resultatet af denne fremgangsmåde viser klart, at DNA-methylering ændringer i centrale celle skæbne bestemme gener er stærkt forbundet med PDAC progression. Denne undersøgelse bør motivere indsamling af flere eksempler på data til at bekræfte vores resultater samt at udvikle biomarkører baseret på DNA-methylering ændringer i forbindelse med disse vigtige gener.

Metoder og Materialer

Patienter og prøver

Alt arbejde blev udført med godkendelse fra University of California, Los Angeles (UCLA) Institutional Review Board med skriftlig tilladelse fra alle patienter. Prøver fra PDAC tumorer og maligne bugspytkirtel blev lynfrosset på tidspunktet for operationen. Tumor indhold blev vurderet på hematoxylin og eosin sektioner ved en praktiserende mave patolog (DWD). Alle clinicopathologic og overlevelse information til patienter blev udvundet fra et prospektivt vedligeholdt UCLA kirurgisk database af bugspytkirtlen patienter. Samlet overlevelse blev bestemt ved at søge på Social Security Død Index og overlevelse intervaller blev beregnet ud fra datoen for kirurgi til datoen for bekræftet død eller sidste patientkontakt.

Til denne undersøgelse blev i alt 16 prøver anvendes, herunder 11 PDAC tumorer, 2 normale prøver og 3 kronisk pancreatitis prøver. Kliniske oplysninger om disse prøver er givet i S1 tabel.

Reduceret repræsentation bisulfit sekventering

Genomisk DNA fra alle prøver blev ekstraheret til at skabe biblioteker for reduceret repræsentation bisulfit sekventering (RRBS) efter en standard-protokol [ ,,,0],77]. Fordøjelser blev udført med methylering-ufølsomme restriktionsenzym, MspI og fragmenter i området fra 50 til 300 baser blev udvalgt til at berige for CpG rige regioner. Efter fordøjelse blev prøver ligeret med Illumina adaptere, størrelse valgt, denatureret og behandles med natriumbisulfit til at afsløre deres methylering tilstand. Biblioteker blev sekventeret ved hjælp Illumina Hiseq 2000 sequencere.

Sekventering læser blev kortlagt til den menneskelige henvisning genom (hg19) ved hjælp af BS Seeker2 sæt beregningsværktøjer [78]. Som bisulfitbehandling konverterer umethylerede cytosiner til thyminer, vi beregnet den methylering niveau på hvert genomics CpG sted som den del af læser entydigt knyttet til dette websted, der indeholder en cytosin.

Datafiltrering

Vi filtreret sæt af methylering til efterfølgende analyse under anvendelse af to statistiske kriterier der udvælges biologisk relevante steder og forbedre kvaliteten af ​​downstream beregninger. Først da methylering tilstand på et givet site er en binomial frekvens estimat, vi beregnede konfidensintervaller ved hjælp af Clopper-Pearson-metoden [79]. Vi inkluderede kun steder, hvor methylering frekvenser for hver af de 16 prøver havde 95% konfidensintervaller mindre end 0,25. For det andet, vi beregnet standardafvigelsen på tværs af de 16 prøver og aflives websteder med en standardafvigelse = 0,05 for yderligere analyse.

Statistisk analyse

Principal Component Analysis [80] blev udført på methylering vektorer består af alle websteder, der passerede filtrene beskrevet ovenfor. Cox regression [81] med censurering blev anvendt til at beregne en regressionskoefficient og tilhørende p-værdi ved hvert sted individuelt for at bestemme fortegnet og styrken af ​​forbindelser med overlevelsesdata. Ligeledes for nogle steder af interesse præsenteret i Resultater og Diskussion, vi beregnede Kaplan-Meier [82] kurver og log-rank p-værdier ved dichotomizing prøverne på grundlag af gennemsnittet methylering værdi på hvert site.

Funktion og Pathway Analyse

for at undersøge de funktionelle konsekvenser af methylering sites med stærk korrelation til overlevelse, vi udnyttede genomiske regioner Berigelse af anmærkninger Tool (store) [17]. Dette værktøj aggregater flere databaser af biomolekylær annotation og beregner statistiske sammenhænge mellem disse tal og et givet input sæt af genomiske regioner. For vores input, anvendte vi den delmængde af methylering med p-værdier mindre end 0,05. For baggrunden, vi brugte alle websteder, der passerede de to kvalitets filtre. For de store inputparametre valgte vi den eneste nærmeste gen option og en maksimal forlængelse af 100 kilobaser fra transkriptionsstartsitet af hvert gen.

I betragtning af det store antal CpG undersøgt i denne undersøgelse sites, vi forsøgte at anvende standard med flere test korrektioner [83] til disse p-værdier. Som et resultat af underrepræsentationen af ​​lave p-værdier i vores data i forhold til ensartet tilfældig forventning, de falske opdagelse satser vi opnåede var sandsynligvis oppustet. Men som vist i Resultater og Diskussion, hjælp ukorrigerede p-værdier til at vælge loci i en samlet måde (per gen eller genomisk region) forudsat overbevisende inddrivelse af funktionel annotation og gener tidligere fremhævet i litteraturen, hvilket tyder vores tilgang er robust. Endelig har vi sammenlignet det sæt af gener stærkest beriget med betydelige methylering websteder til listerne over gener fundet at være signifikant muteret i omfattende exome sekventering projekt [4, 5].

Støtte Information

S1 Fig. Baggrund Fordeling af Per site Gennemsnitlig methylering Værdier

doi:. 10,1371 /journal.pone.0128814.s001

(TIFF)

S2 Fig. Genom browser visualisering af Eksempel Gener med Survival + steder i doi:. 10,1371 /journal.pone.0128814.s002

(TIFF)

S1 Table. Klinisk-patologisk karakteristika af patientprøver

Kliniske variabler indsamles til pancreas adenocarcinom patienterne i denne undersøgelse

doi:.. 10,1371 /journal.pone.0128814.s003

(XLSX)

S2 Table. Funktionel Grundlag for Princip Komponent 1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0128814.s004

(XLSX)

S3 Table.