PLoS ONE: miR-126-3p Hæmmer kræft i skjoldbruskkirtlen Cell Growth og metastase, og er forbundet med Aggressiv kræft i skjoldbruskkirtlen

Abstrakt

Baggrund

Tidligere undersøgelser har vist, at microRNA er dysreguleret i kræft i skjoldbruskkirtlen og spiller en vigtig rolle i den post-transkriptionel regulering af mål onkogener og /eller tumorsuppressorgener.

Metode /vigtigste resultater

Vi studerede funktionen af ​​miR-126-3p i skjoldbruskkirtlen kræftceller, og som en markør for sygdom aggressivitet. Vi fandt, at miR-126-3p udtryk var signifikant lavere i større tumorer, i tumorprøver med ekstrathyroidale invasion, og i højere risikogruppe kræft i skjoldbruskkirtlen i 496 papillære kræft i skjoldbruskkirtlen prøver fra The Cancer Genome Atlas undersøgelse kohorte. I et uafhængigt prøvesæt, lavere MIR-126-3p ekspression blev observeret i follikulære skjoldbruskkirtelkræft (som har kapsulære og angioinvasion) sammenlignet med follikulære adenomer. Mekanistisk, ektopisk overekspression af miR-126-3p betydeligt hæmmet kræft i skjoldbruskkirtlen celleproliferation,

in vitro

(p 0,01) og

in vivo

(p 0,01), kolonidannelse (p 0,01), tumor kugleformet dannelse (p 0,05), den cellulære migration (p 0,05), VEGF-sekretion og endotelrør-dannelse og lunge metastase

in vivo

. Vi fandt 14 forudsagde target gener, som er blevet omformet betydeligt på miR-126-3p transfektion i skjoldbruskkirtlen kræftceller, og som er involveret i kræft biologi. Af disse 14 gener,

SLC7A5

ADAM9

blev bekræftet at være hæmmet af miR-126-3p overekspression og være direkte mål for miR-136-3p.

konklusioner /betydning

Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at vise, at miR-126-3p har en tumor-undertrykkende funktion i skjoldbruskkirtlen kræftceller, og er forbundet med aggressiv sygdom fænotype.

Henvisning: Xiong Y, Kotian S, Zeiger MA, Zhang L, Kebebew E (2015) miR-126-3p Hæmmer kræft i skjoldbruskkirtlen Cell Growth og metastase, og er forbundet med Aggressiv kræft i skjoldbruskkirtlen. PLoS ONE 10 (8): e0130496. doi: 10,1371 /journal.pone.0130496

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, KINA

Modtaget: Marts 20, 2015; Accepteret: 19 maj 2015; Udgivet: 5 August, 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Denne forskning blev støttet af intramuralt forskningsprogram for center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft i skjoldbruskkirtlen er den mest almindelige endokrine kræft. og en af ​​de hurtigst voksende cancer diagnoser i USA [1,2]. Skjoldbruskkirtelkræft stammer fra parafollikulære celler (medullær) og follikulært celler (ikke-medullær), som tegner sig for over 95% af alle tilfælde kræft i skjoldbruskkirtlen og er klassificeret i fire store histologiske grupper: follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen (FTC), papillær kræft i skjoldbruskkirtlen (PTC ), anaplastisk kræft i skjoldbruskkirtlen (ATC), og Hürthle celle carcinom (HCC).

MikroRNA’er (miRNA) er små, ikke-kodende RNA, der er ca. 21 nukleotider lange og regulerer genekspression [3,4]. miRNA spiller en væsentlig rolle i tumorigenese og vise bemærkelsesværdig vævsspecificitet, og miRNA har også vist sig at være gode cancer biomarkører [5]. Tidligere undersøgelser har vist, at adskillige miRNA er dysreguleret i skjoldbruskkirtelkræft oprindelse fra follikelceller [6-8]. I vores tidligere undersøgelse fandt vi, at ekspressionen af ​​MIR-126-3p blev nedreguleret i maligne thyreoidea tumorprøver sammenlignet med benigne skjoldbruskkirtlen tumorprøver [9,10]. Nedreguleret MIR-126-3p ekspression blev observeret i FTC og HCC, som kun adskiller sig fra histologisk follikulær eller Hürthle adenomer når kapsulær invasion og /eller angioinvasion er til stede. Rolle MIR-126-3p i kræft i skjoldbruskkirtlen er ikke blevet undersøgt tidligere, men vores ekspressionsanalyse i kræft i skjoldbruskkirtlen prøver antyder, at tabet af MIR-126-3p kan være forbundet med kræft i skjoldbruskkirtlen progression, og at det kan fungere som en tumorsuppressor.

i den foreliggende undersøgelse testede vi den hypotese, at mIR-126-3p er en tumorsuppressor og er forbundet med sygdommen fænotype. Vi bestemt funktion miR-126-3p i skjoldbruskkirtlen cancerceller, ved hjælp af både

in vitro

og

in vivo

modeller. Vi fandt, at overekspression af MIR-126-3p signifikant hæmmet kræft i skjoldbruskkirtlen celleproliferation, kolonidannelse, tumor kugleformet dannelse, migration, VEGF sekretion og HUVEC rør-dannelse og lungemetastaser

in vivo

. Endvidere fandt vi, at MIR-126-3p regulerer ekspressionen af ​​mange cancerrelaterede gener, herunder de, der koder solut luftfartsselskab familie 7 organ 5 (

SLC7A5

) og et disintegrin og metalloproteinase domæne-holdige protein 9 (

ADAM9

), og at den direkte er rettet mod disse gener. Endelig blev miR-126-3p udtryk fundet at være forbundet med sygdom aggressivitet.

Metoder

Animal Care og brug Udvalg af National Cancer Institute, National Institutes of Health godkendt dyreforsøg protokol. Når musene nåede humane eutanasi kriterier blev musene afbildet, og aflivet ved CO2 inhalation. Undersøgelsen blev godkendt af Kontoret for Menneskelige Research Beskyttelser og patientinformation blev indsamlet prospektivt under en institutionel Review Board-godkendt protokol ved National Institutes of Health Clinical Center (Bethesda, Maryland) efter at have indhentet skriftligt informeret samtykke.

Menneskelig skjoldbruskkirtlen tumor prøver, cellelinjer og dyrkningsbetingelser

Menneskelig thyreoideavæv blev opnået på tidspunktet for tumor fjernelse, straks lynfrosset og opbevaret ved -80 ° C. Serielle vævssnit blev anvendt til RNA-ekstraktion og farvet med hematoxylin og eosin for at bekræfte diagnosen og at tumorcelle indholdet var 80% eller højere. Undersøgelsen blev godkendt af Kontoret for Menneskelige Research Beskyttelser og patientinformation blev indsamlet prospektivt under en institutionel Review Board-godkendt protokol ved National Institutes of Health efter at have indhentet skriftligt informeret samtykke.

Menneskelig kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer XTC- 1 (HCC), FTC-133 (FTC), og TPC-1 (PTC) blev opretholdt i DMEM med 4.500 mg /l D-glucose og L-glutamin og 110 mg /l natriumpyruvat, suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), TSH (10 mU /ml), penicillin (10.000 U /ml), streptomycin (10.000 U /ml), Fungizone (250 mg /ml) og insulin (10 pg /ml) i en standard befugtet inkubator ved 37 ° C i en CO 5%

2 og 95% O

2 atmosfære. FTC-133-Luc2 celler blev genereret ved transfektion af FTC-133-celler med en luciferase-udtrykkende vektor, og cellerne blev dyrket i det samme medium med G418 ved en koncentration på 200 ug /ml [11]. De cellelinjer blev autentificeret ved hjælp af kort tandem repeat profilering

miRNA transfektion

En miRNA efterligner for HSA-miR-126-3p (miRNA mimic, Assay ID:. MC12841, Applied Biosystems, Foster City , CA) blev transficeret ind i celler ved en koncentration på 25 nm ved anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. Et oligonukleotid ikke repræsenterer nogen kendt miRNA (miRNA Mimic negativ kontrol # 1; Applied Biosystems). Blev anvendt som en negativ kontrol

RNA-isolering og kvantitativ real-time RT-PCR

Totalt RNA blev isoleret fra cellelinjer og vævsprøver ved hjælp af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA). TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) blev anvendt til måling MIR-126-3p ekspressionsniveau (HSA-MIR-126-3p, Assay ID: 002228). Totalt RNA blev revers transkriberet med en miRNA-specifik primer, efterfulgt af real-time PCR under anvendelse TaqMan prober. U6 blev anvendt som en endogen kontrol. De relative mængder af

ADAM9

SLC7A5 Salg mRNA’er blev bestemt under anvendelse af TaqMan assay (Applied Biosystems) på en ABI 7900 HT-system; human

GAPDH

blev anvendt som en endogen kontrol. Den ΔΔ Ct metode blev anvendt til at beregne ekspressionsniveauer.

Western blot-

Whole-cellelysat blev fremstillet med RIPA-buffer (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) og blev anvendt til ADAM9 proteinpåvisning ved Western blot under anvendelse af et kanin-polyklonalt anti-ADAM9 antistof (1: 1000 fortynding; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA) og for SLC7A5 protein detektion ved Western blot under anvendelse af et kanin-polyklonalt anti-SLC7A5 antistof (1: 500 fortynding; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). GAPDH protein, en kontrol blev detekteret ved anvendelse af et muse-monoklonalt anti-GAPDH (# 0411) antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Proliferationsassay

Celleproliferation blev bestemt ved hjælp af CyQUANT celleproliferationsassay (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Fluorescensintensiteten blev målt under anvendelse af en fluorescens-mikropladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), med excitation ved 485 nm og emission detektion ved 538 nm.

Migration assay

Cellulær migration blev målt ved anvendelse en BD afdeling (Catalog # 354.578, BD Biosciences, Bedford, MA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Cellekulturmedium med 10% FBS blev anvendt som en kemoattraktant i den nedre brønd i Boyden kammer. Thyroid cancer-celler blev podet i det øvre rum af kammeret i serum-frit medium (4 × 10

4 celler per brønd). Efter inkubation ved 37 ° C i 5% CO

2 i 22 timer, blev de ikke-migrerende celler fjernet fra den øvre overflade, og de celler, der var migreret gennem membranen til den nedre overflade blev farvet med Diff-Quik Farv Set (Siemens Healthcare Diagnostics, Inc., Newark, DE). Billeder blev taget fra membranen af ​​hver indsats under et mikroskop (50 ganges forstørrelse) med et digitalt kamera. Billederne blev vist på computerskærmen, og cellerne i fem områder af hver indsats blev talt.

Sfæroide kultur

To dage efter miRNA transfektion blev cellerne trypsiniseret, talt, resuspenderes i kulturmedier og udpladet i en Ultra Low Cluster plade (Costar, Corning, NY) ved 3,5 × 10

4 celler pr. Pladerne blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO

2, og mediet blev skiftet hver 2. til 3. dag. Efter 2 ugers dyrkning blev celler farvet med krystalviolet og fotograferet under et mikroskop. Det samlede areal er besat af sfæroider i et billede blev målt ved at begrænse omkredsen af ​​hver klumpformet, markerer hele området, og beregning af pixel numre ved hjælp ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Blød agar assay for kolonidannelse

Tre dage efter miRNA transfektion blev FTC-133-celler trypsiniseret, talt og resuspenderet i dyrkningsmediet. To-lags blød agar-assays blev udført i seks-brønds plader. Det nederste lag af agar (2 ml /brønd) indeholdt 0,6% agar (Difco agar ædel, BD Diagnostics, Sparks, MD) i Hams F-12-medium suppleret med 10% FBS, penicillin (100 U /ml), streptomycin ( 10.000 U /ml), og Fungizone (250 ng /ml). Tredive tusinde celler blev blandet med 1 ml øvre agar opløsning (0,35% agar i dyrkningsmedier). Efter 30 minutter blev 1 ml af dyrkningsmedier tilsat til hver brønd. Pladerne blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO

2, og medierne blev ændret to gange om ugen. Efter to ugers dyrkning blev cellekolonier farvet med krystalviolet og undersøges under et mikroskop. Koloni optælling blev udført i tre forskellige områder.

Tumor xenografundersøgelser

FTC-133 celler, der indeholder luciferasereportergen

luc2

blev transficeret med miR-126-3p eller miR- NC og inokuleret subkutant (10

6 levedygtige celler) i venstre og højre flanker af athymiske nøgne mus. Tumorer blev målt med calipre på forskellige tidspunkter, og volumener blev beregnet som længde × bredde × højde. Autopsi tumorprøver blev fotograferet for at dokumentere grov morfologi, og derefter prøver blev vejet. FTC-133-

luc2

celler (7,5 x 10

5) transficeret med MIR-126-3p og MIR-NC blev injiceret i athymiske nøgne mus via halevenen, og musene blev afbildet ugentligt under anvendelse en Xenogen IVIS 100 system.

sårheling assay

kræft i skjoldbruskkirtlen cellemigrering blev vurderet ved anvendelse af en ridse sårhelende assay [12], hvori 150.000 celler blev transficeret med miRNA, udpladet i seks-brønds plader og fik lov at vedhæfte og vokse i 44 timer (miRNA). Derefter blev tre lodrette sår lavet med en steril 10-pi pipettespids, og derefter en vandret linje blev foretaget på tværs af de tre linjer, så celler kunne konstateres på det samme punkt. Cellerne blev inspiceret hver 12 timer og bredde målinger op til 24 timer.

VEGF ELISA

Kultur media supernatant blev opsamlet 72 timer efter transfektion af skjoldbruskkirtlen cancerceller med miR-NC eller miR- 126-3p. VEGF-niveauer blev målt ved anvendelse af human VEGF Quantikine ELISA-kit (R 0,05. Den Ingenuity Pathway Analysis (IPA) systemet (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) blev anvendt til sti analyse

miRNA-126-3p mål forudsigelser

Targetscan 5.1 (http:. //Targetscan .org /) blev anvendt til at identificere potentielle direkte målgener for miR-126-3p.

Luciferase reporter assay

1573-basepar 3′-UTR af menneskelige

ADAM9

blev klonet ind i en tom luciferase reporter vektor, pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), generering af et vildtype

ADAM9

3′-UTR luciferase-reporterkonstruktion (pEZX-ADAM9-3’UTR) . Den 2947-basepar 3′-UTR af menneskelige

SLC7A5

blev også klonet ind pEZX-MT01, genererer en vildtype

SLC7A5

3′-UTR luciferase reporter konstruktion (pEZX-SLC7A5- 3’UTR). For den dobbelte luciferase assay blev FTC-133 celler udpladet tredobbelt i 24-brønds plader og co-transficeret med 0,25 ug af reporterkonstruktet og 15 pmol MIR-126-3p eller MIR-NC ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) . Efter 24 timer blev cellerne lyseret og analyseret for både ildflue og

Renilla

luciferaseaktivitet under anvendelse af miR Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia) på en SpectraMax M5E mikropladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), ifølge producentens anvisninger.

Dataanalyse

The National cancer Institute cancer Genome Atlas (TCGA) datasæt for kræft i skjoldbruskkirtlen blev anvendt til at bestemme en sammenhæng mellem miR-126-3p udtryk og sygdom aggressivitet (data portal, https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). værdier normaliseret intensitet (log 10) for miR-126-3p udtryk blev opnået fra 454 papillære kræft i skjoldbruskkirtlen prøver. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardfejl af gennemsnittet. For at bestemme statistisk signifikans, blev en variansanalyse og t-test anvendes som passende. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

miR-126-3p udtryk i kræft i skjoldbruskkirtlen er forbundet med aggressiv sygdom fænotype og tumorer med kapselskrumpning og angioinvasion

Vi havde tidligere identificeret miR-126-3p skal nedreguleres i skjoldbruskkirtelkræft af follikulært celle oprindelse og i tumortyper, der var vanskelige at diagnosticere ved tumor biopsi undersøgelse kapsel invasion og angioinvasion kan ikke bestemme ved cytologi. Således var vi interesserede i at bestemme, om miR-126-3p udtryk var forbundet med sygdom aggressivitet og specifikt i tumorer med kapsel invasion og angioinvasion. For at undersøge dette, brugte vi TCGA datasæt for papillær kræft i skjoldbruskkirtlen. Vi fandt, at miR-126-3p udtryk var lavere i større primære tumorer (Fig 1A), i tumorprøver med ekstrathyroidale invasion (Fig 1B), og i højrisikogruppe kræft i skjoldbruskkirtlen (Fig 1C). I betragtning af den sammenslutning af miR-126-3p med mere aggressiv papillær kræft i skjoldbruskkirtlen, vi næste spurgte, om miR-126-3p udtryk blev lavere i lokaliserede tumorer med kapsel invasion og angioinvasion hjælp follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen og adenomer prøver, for hvilke malignitet er kun etableret tilstedeværelsen af ​​disse to kendetegnende for kræft. Vi fandt MIR-126-3p var signifikant lavere i lokaliserede follikulær cancer i skjoldbruskkirtlen sammenlignet med follikulære adenomer (Fig 1D). Disse resultater tilsammen tyder på, at miR-126-3p kan have en væsentlig rolle i kræft i skjoldbruskkirtlen initiering og eller progression.

(A) miR-126-3p er betydeligt lavere i større papillær kræft i skjoldbruskkirtlen (T3 i forhold til T2 og T1 tumorer). Data for TCGA prøver med tilgængelige tumor størrelse oplysninger. T1 tumorer mindre end 2 cm og ikke vokser uden skjoldbruskkirtlen, T2 tumorer 2cm men 4 cm og ikke vokser uden skjoldbruskkirtlen, T3 tumorer måling 4 cm eller vokser uden skjoldbruskkirtlen. ** Angiver p 0,01, *** angiver p 0,001. Y-aksen er log

10 normaliseret udtryk. (B) MIR-126-3p ekspression er betydeligt lavere i papillær thyreoideacancer med minimal og moderat ekstrathyreoideale invasion. ** Angiver p 0,01, *** angiver p 0,001. Y-aksen er log

10 normaliseret udtryk. (C) miR-126-3p udtryk er betydeligt lavere i høj og mellemliggende Macis risiko papillære kræft i skjoldbruskkirtlen i forhold til lave tumorer Macis risiko. Macis er et prognostisk pointsystem anvendes i TCGA database, som er baseret på tilstedeværelsen af ​​metastase, patientens alder, fuldstændighed resektion, lokal invasion, og tumor størrelse. ** Angiver p 0,01, *** angiver p 0,001. Y-aksen er log

10 normaliseret udtryk. (D) miR-126-3p udtryk er væsentligt lavere i follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen end follikulært skjoldbruskkirtlen adenom. Alle follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen tilfælde havde histologisk bevis på kapsel og vaskulær invasion og adenomer havde ikke nogen tegn på kapsel og vaskulær invasion. ** Angiver p 0,01. Y-aksen er 2 ^ -. (ΔΔCt)

miR-126-3p regulerer kræft i skjoldbruskkirtlen celleproliferation, koloni og kugleformet dannelse, og cellulær migration

I betragtning af sammenhængen mellem miR- 126-3p udtryk og aggressiv kræft i skjoldbruskkirtlen sygdom fænotype, vi ønskede at afgøre, om funktionen af ​​miR-126-3p i kræft i skjoldbruskkirtlen mekanistisk kunne forklare denne forening. Vi overudtrykt miR-126-3p i tre velkarakteriserede og bekræftet kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinier (TPC-1, FTC-133 og XTC-1) ved hjælp af miR-NC som en negativ kontrol for at bestemme dens virkning på celleproliferation. MIR-126-3p overekspression inhiberede celleproliferation betydeligt i TPC-1 og FTC-133 celler ved 120 timer, med 52% (p 0,001) og 37% (p 0,001), henholdsvis; men det inhiberede proliferation kun med 16% i XTC-1-celler på 168 timer (p 0,001) (Fig 2A, 2B og 2C). En blød agar-kolonidannelse assay blev udført for at vurdere forankringsuafhængig vækst i FTC-133, som er en kolonidannende thyreoideacancer cellelinie. Vi fandt en signifikant lavere antal kolonier i FTC-133 cellelinjer overudtrykker MIR-126-3p (Fig 2D). Vi undersøgte også effekten af ​​miR-126-3p på kræft i skjoldbruskkirtlen celle tumor klumpformet formation. FTC-133 og XTC-1 cellelinjer danner sfæroider når dyrket i ultralav klæbende dyrkningskolber, og efter transfektion med miR-126-3p blev antallet og størrelsen af ​​spheroids faldt betydeligt (figur 2E).

(A-C) Thyroid cancer cellelinje proliferation med mIR-126-3p overekspression. Y-aksen repræsenterer celleantallet. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM). (* Angiver p 0,05; ** angiver p 0,01; *** angiver p 0,001). (D) MIR-126-3p overekspression hæmmer kolonidannelse i skjoldbruskkirtlen cancerceller. Colony numre i FTC-133-cellelinjer. Y-aksen repræsenterer antallet af kolonier pr felt. Fejl- søjler repræsenterer SEM (*** indikerer p 0,001). (E) miR-126-3p overekspression reducerer størrelsen og antallet af sfæroider. Overfyld: repræsentativ billede af sfæroider i kultur med miR-126-3p overekspression (FTC-133 celler). Lavere panel: Kvantificering af kugleformede forskelle mellem XTC-1 og FTC-133 celler med miR-126-3p overekspression. Det samlede areal, som anvendes sfæroiderne i et billede blev målt ved omgiver omkredsen af ​​hver sfæroide, mærkning hele området, og beregning af pixel numre med ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Y-aksen repræsenterer størrelsen og antallet af sfæroiderne. Fejl søjler repræsenterer SEM (* angiver p 0,05).

Vi næste bestemmes effekten af ​​miR-126-3p på cellulær migration ved hjælp af scratch sårheling assay. Vi fandt, at overekspression af MIR-126-3p signifikant inhiberede sårlukning i TPC-1-celler (p 0,001), FTC-133 celler (p 0,001), og XTC-1-celler (p 0,01) (Fig 3A). For at bekræfte vores resultater, vi brugte også en Boyden kammer assay for at undersøge effekten af ​​miR-126-3p på cellulær migration. Vi fandt, at overekspression af MIR-126-3p også signifikant inhiberede celle migration (Fig 3B).

Sårheling assay (A) og Boyden kammer assay (B) data. MIR-126-3p overekspression faldt betydeligt sår bredde lukning efter 24 timer i alle kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer undersøgt. Y-aksen repræsenterer såret afstand. Fejl søjler repræsenterer SEM (** angiver p 0,01; *** angiver p 0,001). MIR-126-3p overekspression faldt betydeligt antallet af migrerede celler i alle skjoldbruskkirtlen kræftceller i Boyden kammer assay. Y-aksen repræsenterer antallet af migrerede celler pr. Fejl søjler repræsenterer SEM (* angiver p 0,05; ** angiver p 0,01; *** angiver p 0,001).

miR-126-3p regulerer skjoldbruskkirtlen tumorvækst og metastase

in vivo

Da vores

in vitro

data, vi ønskede at evaluere effekten af ​​miR-126-3p på tumorvækst

in vivo

og afgøre, om forbigående forhøjede niveauer af miR-126-3p kunne have en vedvarende, langsigtet fænotypisk effekt. Vi fandt, at tumorxenotransplantater afledt af FTC-133-

luc2

celler transficeret med MIR-126-3p var betydeligt mindre og vejede mindre end tumorxenotransplantater fra MIR-NC-gruppe (p 0,01) (Fig 4A) . Fordi en af ​​de mest dramatiske virkninger af miR-126-3p overekspression

in vitro

var på cellulære migration, vi næste bestemmes, hvis miR-126-3p reguleret metastaser

in vivo

. For at bestemme, om overekspression af miR-126-3p kunne hæmme tumor metastase

in vivo

, FTC-133-

luc2

celler transficeret med miR-126-3p og miR-NC blev injiceret i athymiske nøgne mus via halevenen, og musene blev afbildet hver uge. Vi fandt, at overekspression af MIR-126-3p dramatisk undertrykt lunge metastase i denne model (Fig 4B).

(A) Vækst af tumorxenografter i nøgne mus. Venstre panel: repræsentative billeder af mus xenograft størrelse ved obduktionen. Midterste og højre panel: tumor luciferaseaktivitet og tumorvolumen måling og vægt. FTC-133-Luc2 celler transficeret med MIR-126-3p og MIR-NC blev inokuleret subkutant i flankerne af athymiske nøgne mus. (B) tumormetastase. Venstre panel: Repræsentative billeder af mus med metastaser viser luminescens signal. Midterste panel: Kvantificering af luminescens signal intensitet forskelle mellem miR-126-3p og miR-NC. FTC-133-Luc2 celler transficeret med MIR-126-3p og MIR-NC blev injiceret i athymiske nøgne mus via halevenen, og musene blev afbildet med en Xenogen IVIS 100 system. Den relative luminescens signal på hver mus beregnes som forholdet mellem oprindelige signal til signalet taget 14 dage efter injektion. De viste billeder blev taget 7 uger efter vene injektion af tumorceller. Fejl søjler repræsenterer SEM (* angiver p 0,05; ** angiver p 0,01; *** angiver p 0,001). Alle dyreforsøg blev gentaget to gange. Højre panel: Et repræsentativt mikroskopisk billede (hematoxylin og eosin [H 0,01), men ikke med ADAM9 mRNA-ekspression (fig 5E).

(A) immunoblotter af SLC7A5 og GAPDH i TPC-1 og XTC-1 cellelinjer, som blev transficeret med enten mIR-126-3p eller mIR-NC for 72 timer. FTC-133 cellelinje havde ingen påviselig proteinekspression for SLC7A5. (B) Immunoblots for ADAM9 og GAPDH i TPC-1, FTC-133 og XTC-1 cellelinjer, som blev transficeret med enten MIR-126-3p eller MIR-NC i 72 timer

in vitro

. (C) Immunoblots til detektering ADAM9 og GAPDH i FTC-133-Luc2 tumorxenoplantater der var blevet inokuleret subkutant i flankerne af athymiske nøgne mus og lodes udvikle i 10 dage. (D) Luciferase aktivitet af pEZX-SLC7A5-3’UTR og pEZX-SLC7A5-3’UTR i FTC-133 celler, når cotransficeret med MIR-126-3p eller MIR-NC. Alle luciferase målinger blev udført i tre eksemplarer og aflæsninger blev udført 24 timer efter transfektion. Fejl- søjler repræsenterer SEM (*** indikerer p 0,001). (E) Ekspressionsniveauet af MIR-126-3p signifikant omvendt forbundet med ekspressionsniveauet af

SLC7A5

i 481 papillære kræft i skjoldbruskkirtlen prøver fra TCGA datasæt. *** Angiver p. 0,001

miR-126-3p reducerer VEGF-sekretion og endotel rør dannelse

Da vi fandt miR-126-3p udtryk er lavere i lokaliserede follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen med kapsel og vaskulær invasion, og miR-126-3p er blevet rapporteret til at regulere angiogenese og mål

VEGF

, vi næste afgøres, om miR-126-3p regulerer angiogenese i skjoldbruskkirtlen cancerceller [17-20] . Vi fandt, at miR-126-3p overekspression faldt betydeligt VEGF-sekretion i to af tre skjoldbruskkirtlen kræftceller

in vitro

(Fig 6A). Et af de vigtigste determinanter for vellykket tumorvækst er evnen til at rekruttere nye blodkar. Således har vi analyseret VEGF-proteinet udtrykket niveau i lunge metastatiske tumorer fra

in vivo

undersøgelser og endotel rør dannelse ved hjælp af HUVEC assay

in vitro

.