PLoS ONE: MicroRNA-203 er prognostisk indikator i blærekræft og forbedrer kemosensitivitet til cisplatin via apoptose ved Målretning Bd-w og Survivin

Abstrakt

Modstand mod cisplatin kemoterapi er en væsentlig årsag til behandlingssvigt i fremskreden blærekræft (BC) patienter. Der er stigende tegn på, at microRNA er involveret i udviklingen og progressionen af ​​BC. Men lidt om funktionen af ​​microRNA forudsige effekten af ​​adjuverende kemoterapi på BC overlevelse og regulere respons på cisplatin. For at løse dette problem, vi ansat RT-qPCR at vurdere den kliniske betydning af miR-203-ekspression i 108 væv af BC patienter, der fik cisplatin adjuverende kemoterapi, og udført in vitro-undersøgelser for at udforske kemoterapeutiske følsomhed over for cisplatin i miR-203 overekspression BC celler. Vi fandt miR-203 niveauer var signifikant lavere i BC progression gruppe end ikke-progression gruppe (

P

0,001). ROC kurve analyse illustrerede miR-203 kunne væsentlig skelne fremskredne patienter fra dem uden progression (

P

0,001), hvilket giver et areal under ROC-kurven af ​​0,839 (95% CI, 0,756-0,903). Desuden lav miR-203-ekspression korreleret med forkortet progressionsfri overlevelse (PFS) og samlet overlevelse (OS) af BC patienter, og var en uafhængig prognostisk faktor. Overekspression af miR-203 i 5637 og T24 BC celler kunne nedsætte cellernes levedygtighed, styrke cisplatin cytotoksicitet og fremme apoptose. Western blotting og luciferase reporter assay viste Bcl-w og Survivin var direkte nedstrøms mål for miR-203. Der var også en signifikant omvendt sammenhæng mellem miR-203 og Bd-w eller Survivin udtryk i BC væv (r = -0,781, -0,740, både

P

0,001). Afslutningsvis faldt miR-203 forudsiger progression og dårlig prognose for BC patienter behandlet med cisplatin kemoterapi mens miR-203 overekspression kan forbedre cisplatin overfølsomhed ved at fremme apoptose via direkte rettet mod Bcl-w og Survivin

Henvisning.: Zhang X Zhang Y, Liu X, Fang A, Li P, Li Z, et al. (2015) MicroRNA-203 er prognostisk indikator i blærekræft og Forbedrer kemosensitivitet til cisplatin via apoptose ved Målretning Bd-w og Survivin. PLoS ONE 10 (11): e0143441. doi: 10,1371 /journal.pone.0143441

Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, FRANCE

Modtaget: Juli 30, 2015; Accepteret: November 4, 2015; Udgivet: 23 November, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) til CW (nr 81.271.916) ; National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) til XZ (nr 81.301.506); Natural Science Foundation of Shandong-provinsen (https://www.sdnsf.gov.cn/portal/) til XZ (ZR2013HQ063); . Og ph.d.-program for videregående uddannelse i Kina (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm) til XZ (nr 20130131120067)

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Worldwide, blærekræft (BC) er den anden mest almindelige malignitet i urinvejene, med omkring 386.300 nye tilfælde og 150,200 dødsfald om året [1 ]. Fordi de fleste lokalt avancerede BC patienter oplever tilbagefald efter radikal cystektomi [2], adjuverende kemoterapi er normalt preformed i et forsøg på at forsinke tilbagefald og forlænge overlevelsen. I øjeblikket er cisplatin et af de vigtigste kemoterapi narkotika i BC kombinationsregimet, såsom MVAC (methotrexat, vinblastin, doxorubicin, cisplatin og) og GC (gemcitabin og cisplatin). Imidlertid har kun 50% af muskel invasive BC patienter reagerede på cisplatin kemoterapi [3]. Endnu værre, nogle patienter kun lider toksicitet uden at opnå kemoterapeutisk fordel. Derfor er der et presserende behov for at forudsige effekten af ​​adjuverende kemoterapi på BC overlevelse og forstå de mekanismer, der forhindrer reaktion på kemoterapi.

Nylige undersøgelser har fundet resistens mod cisplatin behandling kunne være medieret af microRNA (miRNA) [ ,,,0],4, 5]. miRNA er en klasse af ikke-kodende regulatoriske RNA’er sammensat af omkring 22 nucleotider, der fungerer primært til at nedregulere target mRNA’er ved specifikt at binde til deres 3′-utranslateret region (3′-UTR) og efterfølgende fremme nedbrydning og /eller inhibering oversættelse [6, 7]. Flere publikationer har dokumenteret miRNA kan fungere som tumor undertrykkere eller onkogener er involveret i dannelse af tumorer, vedligeholdelse og metastase, og er potentielle biomarkører for kræft diagnose, terapeutisk resultat og prognose [8-10]. Blandt disse, miR-203 fungerer som regel som en tumor suppressor, og nedreguleres i flere typer af humane maligniteter, herunder BC [11]. For nylig er MIR-203-ekspression blevet forbundet med udviklingen af ​​resistens over for kemoterapi i mange cancertyper. For eksempel blev MIR-203 niveauer faldt i erhvervede kemoterapi lægemiddelresistente brystcancerceller [12]. Overekspression af MIR-203 forøgede anticancervirkning af paclitaxel i colon cancerceller gennem inhibering af celleproliferation, fremme celleapoptose og død [13]. I modsætning hertil Zhou et al [14] fandt eksogen udtryk for miR-203 induceret resistens over for oxaliplatin kolorektale cancerceller. Indtil nu, er der lidt kendt om den potentielle rolle for miR-203 i cisplatin-baseret BC kemoterapi og yderligere forskning er nødvendig.

I denne undersøgelse miR-203 blev undersøgt i klinisk resektion væv af BC er behandlet med radikal cystektomi og cisplatin adjuverende kemoterapi, og foreningen mellem miR-203 og prognose blev analyseret. Desuden blev mekanismerne bag rolle miR-203 i kemoresistens af BC undersøgt. Vi fandt lav ekspression af miR-203 var korreleret med progression og dårlig overlevelse BC patienter, der fik cisplatin adjuverende kemoterapi. Endvidere kunne genoprettelse af MIR-203 ekspression forbedre følsomheden af ​​cisplatin i BC-celler ved at fremme celle apoptose ved at målrette Bcl-w (også kendt som BCL2L2) og Survivin (også kendt som BIRC5), som angivet MIR-203 kunne have en vis potentiel værdi i prognosen forudsigelse og terapeutiske anvendelse.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Qilu Hospital i Shandong University, og skriftligt informeret samtykke fra hver patient blev også opnået. Den indledende undersøgelse omfattede i alt 149 BC patienter behandlet med radikal cystektomi og cisplatin adjuverende kemoterapi i Qilu Hospital, Shandong University mellem april 2007 og marts 2010. Alle patienter havde histologisk bekræftet lokaliseret overgangsordning celle karcinom, iscenesat som pT3a-4a /N + og M0 ifølge 2010 AJCC /TNM klassifikationen. Standarden kemoterapeutiske regime (MVAC eller GC) blev givet mellem 3 til 10 uger efter fuldstændig resektion, med et maksimum på 6 cykler, medmindre progression eller uacceptabel toksicitet dukkede op. Af disse 25 fik strålebehandling, BCG behandling eller neoadjuverende kemoterapi, og 16 blev udelukket på grund af ufuldstændig resektion. De remanding 108 patienter blev fulgt op med cystoskopi kvartalsvis for de første 2 år, derefter halvårligt til 5 år, og derefter årligt indtil januar 2015. Progression blev defineret som locoregional tilbagefald, fjernmetastaser eller død på grund af BC. Progressionsfri overlevelse (PFS) blev beregnet ud fra tidspunktet for kirurgi til datoen for første progression, og samlet overlevelse (OS) blev beregnet ud fra tidspunktet for kirurgi til dødsdagen. Patienter uden ovenstående hændelse blev censureret på studiets afslutning. Alle væv blev snap-frosne og bekræftet ved patologisk analyse, og derefter opbevaret ved -80 ° C indtil RNA ekstraktion.

cellelinjer og kultur

De humane BC cellelinier (5637 og T24) og HEK 293T cellelinie blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), og opretholdt i RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og dyrket ved 37 ° C med en fugtig miljø med 5% CO

2 i luft.

Transfektion

Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) blev anvendt til miR- 203 efterligner /miRNA efterligner negative Kontroltransfektioner efter producentens anvisninger. MIR-203 efterligner (Dharmacon, Lafayette, CO, USA) var dobbeltstrengede RNA-oligonukleotider udformet til at efterligne endogen, Moden MIR-203. miRNA efterligner negativ kontrol (Dharmacon) var baseret på cel-miR-67, moden sekvens: UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA, og havde identisk design og modifikationer som miR-203 efterligner

RNA ekstraktion og RT-qPCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra væv ved hjælp standard TRIzol metode (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved at følge fabrikantens protokol, og målt ved NanoDrop spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). RT-qPCR blev udført i ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Påvisning af MIR-203 blev udført som tidligere [15] beskrevne. For Bcl-w og survivin mRNA’er kvantificering blev RNA revers-transkriberet under anvendelse af høj kapacitet cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), derefter 10 gange fortyndet cDNA blev amplificeret med Power SYBR Green PCR Master Mix ( Applied Biosystems). Den relative ekspression niveau af MIR-203 og Bcl-w og Survivin mRNA’er blev beregnet under anvendelse af 2

-ΔΔCT metode gennem normaliseret til henvisning gener U6 snRNA og GAPDH mRNA hhv.

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev kvantificeret ved anvendelse af Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Diojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) ifølge producentens instruktioner. Celler (5 x 10

3 celler /brønd) blev podet i plader med 96 brønde i tre eksemplarer 24 timer efter transfektion, og inkuberet med 0, 5, 10, 15, 20, 25 og 30 pM cisplatin i 100 pi kulturmedium til en anden 24h. Derefter blev WST-8-substrat tilsat ved 37 ° C i 2 timer, og absorbansen blev aflæst ved spektrofotometer ved 450 nm.

Flowcytometri for apoptose-assay

Flowcytometrianalyse af apoptose blev analyseret ved anvendelse af en annexin V-FITC /PI-farvning kit (BestBio, Shanghai, Kina) ifølge producentens instruktioner. Fireogtyve timer efter transfektion blev celler (1 x 10

4 celler /brønd) blev stimuleret med 5 uM cisplatin i 48 timer og derefter opsamlet. Efter vask 3 gange med med kold PBS blev cellerne resuspenderet i bindingsbuffer efterfulgt af farvning med Annexin V-FITC i 15 minutter og PI i 5min i mørke. 1 × 10

4 celler blev vurderet på en FACS Calibur flowcytometer (BD, Bedford, MA, USA). Alle eksperimenter blev udført tre gange.

TUNEL assay Salg

Celler (1 x 10

4 celler /brønd) blev podet i plader med 96 brønde i tre eksemplarer efter transfektion, og inkuberet med 5 uM cisplatin i 100 pi kulturmedium i 24 timer. Celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 30 minutter, derefter neutraliseret med 2 mg /ml glycin i 5min, permeabiliseret i 0,1% Triton X-100 i 10 min, og endelig mærket med fluorescein-12-dUTP under anvendelse af terminal deoxynukleotidyltransferase. Den lokaliserede grøn fluorescens af apoptotiske celler (fluorescein-12-dUTP) blev detekteret ved fluorescensmikroskopi.

Western blotting-analyse

Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne lyseret i iskold radio immunpræcipitationsassay (RIPA) buffer i 30 min, og proteinkoncentrationen blev kvantificeret under anvendelse af Bio-Rad proteinassay-reagens (Bio-Rad, CA, USA). Tredive ug proteinprøver blev påsat og separeret på 10% SDS-polyacrylamidgeler og overført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Bedford, MA, USA). Membranerne blev først blokeret med 5% fedtfri skummetmælk i 2 timer, derefter inkuberet med anti-Bcl-w (1: 1000; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-survivin (1: 1000; Abcam, Cambridge, Massachusetts, USA) eller anti-β-actin kanin-monoklonalt antistof (1: 1000; Cell Signaling Technology) natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubering med HRP-mærket sekundært antistof (1: 5000; Cell Signaling Technology) i 1 time ved stuetemperatur. Endelig blev båndene visualiseret under anvendelse kemiluminescensdetektion kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) på FluorChem E Chemiluminescent Western Blot Imaging System (Cell Biosciences, Santa Clara, CA, USA).

Luciferase reporter assay

pmiR-RAPPORT

TM vektorer (RiboBio, Guangzhou, Kina) blev konstrueret med vildtype (WT) eller mutant (MUT) 3′-UTR af Bd-w og Survivin, og alle sekvenser var indsat mellem hRluc og hLuc genet. HEK293T celler (1 x 10

4 celler /brønd) blev podet i plader med 96 brønde og co-transficeret med MIR-203 /negativ kontrol miRNA og WT-Survivin 3′-UTR vektor /Mut Survivin 3′-UTR vektor eller WT-Bcl-w 3′-UTR vektor /Mut Bcl-w 3′-UTR vektor under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Otteogfyrre timer efter transfektion blev celler opsamlet og analyseret ved anvendelse af Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). Hver assay blev udført tre gange.

Statistisk analyse

MIR-203-ekspression i vævsprøver blev bestemt som ikke-normal fordeling ved hjælp af Kolmogorov-Smirnov test. Således blev Mann-Whitney U-test eller Kruskal-Wallis test anvendt til at vurdere betydningen af ​​MIR-203 forskelle mellem grupperne. Receiver operating characteristic (ROC) kurve blev udført for at vurdere effekten af ​​MIR-203 diskrimination for kræsne skred patienter fra dem uden progression, og den optimale cutoff-værdien blev indstillet baseret på Youden indeks (følsomhed + specificitet-1) [16]. Overlevelseskurver blev konstrueret ved Kaplan-Meier-metoden, og sammenlignet ved log-rank test. Cox model blev anvendt til identifikation af uafhængige faktorer af PFS og OS. T-test blev udført for at bestemme betydningen af ​​data i levedygtighedsassay, apoptose-assay og luciferase reporter assay. Forholdet mellem MIR-203 og målgenekspression blev udforsket af Spearman korrelation. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS Statistics 17,0 til Windows (IBM Corporation, Armonk, NY, USA).

Resultater

Patient karakteristika

Den mediane alder af 108 f.Kr. patienter, der fik cisplatin adjuverende kemoterapi var 62 (spændvidde 42-81) år, og den mediane opfølgningsperiode var 51,5 (spændvidde 6-65) måneder. Under opfølgning, viste 45 patienter progression, hvoraf 32 tilfælde havde locoregional tilbagefald, viste 11 tilfælde fjernmetastaser, og 39 til sidst døde med BC. De detalje baseline karakteristika for patienterne blev vist i tabel 1.

Reduceret miR-203-ekspression var forbundet med sygdomsprogression

MIR-203 niveauer blev signifikant reduceret i progression gruppen sammenlignet med ikke-progression gruppe (

P

0,001, fig 1A og S1 File). ROC kurver analyser illustrerede miR-203 gav et areal under ROC-kurven (AUC) værdi på 0,839 (95% CI, 0,756-0,903) at skelne patienter med progression fra dem uden progression, hvilket var mere præcis end at gætte (

P

0,001, fig 1B). Der blev imidlertid ikke signifikante associationer fundet mellem miR-203 niveauer og alder, køn, klasse, T stage, nodal status, og kemoterapi (alle på

P

0,05; tabel 2).

(A) mIR-203-niveauer blev detekteret ved RT-qPCR fremgangsmåde og normaliseret mod U6 RNA i 108 tilfælde af blærekræft væv. Niveauer af miR-203 i progression gruppe var signifikant lavere end i ikke-progression gruppe (

P

0,001, Mann-Whitney U-test). (B) ROC kurve fornemme patienter med progression fra dem uden progression hjælp miR-203, med et areal under ROC-kurven værdi på 0,839 (95% CI, 0,756-0,903). (C, D) Kaplan-Meier PFS og OS kurver baseret på MIR-203 ekspression af blærecancerpatienter. Den optimale afskåret værdi (0,345) beregnet af ROC-analyse blev anvendt til at klassificere patienterne som høj og lav miR-203 udtryk grupper. Lav udtryk for miR-203 var signifikant korreleret med forkortet PFS eller OS. (Begge

P

0,001, log-rank test)

miR-203 forudsagt prognose i BC patienter efter kemoterapi

Baseret på optimale afskåret værdi (0,345) beregnet af ROC-analyse for BC progression efter kemoterapi, 79 patienter, hvis miR-203 niveauer var over 0,345 blev klassificeret som høj miR-203 udtryk gruppe blev de resterende 29 sager er klassificeret som lav miR-203 udtryk gruppe. Kaplan-Meier overlevelse kurve viste lav ekspression af miR-203 var signifikant korreleret med forkortet PFS og OS (både på

P Salg 0,001, Fig 1C og 1D).

univariate Cox regressionsanalyser afslørede betydelige sammenhænge mellem miR-203, T scenen, nodal status og PFS (alle på

P

0,05; tabel 3), samt miR-203, T scenen og OS (alle på

P

0,05; tabel 3). Når der lægges over væsentlige faktorer i multivariat Cox model, miR-203, T scenen, og nodal status demonstrerede uafhængig prognostisk værdi for PFS (alle på

P

0,05; tabel 3), og miR-203, T fase demonstrerede uafhængig prognostisk værdi for OS (alle på

P

0,05; tabel 3).

Overekspression af miR-203 forbedret cisplatin sensibilisering hos BC celler

at udforske effekten af ​​miR-203 om cisplatin kemosensitivitet i BC celler, koncentration-afhængige kurver for 5637 og T24 BC cellelinjer transficeret med miR-203 efterligner og negativ kontrol blev plottet. Som vist i figur 2A, 24 timer efter transfektion, Mir-203 ekspressionsniveauer i 5637 og T24-celler transficeret med MIR-203 efterligner var 5297 og 8089 gange højere end dem transficeret med negativ kontrol (

P

0,001). Cell levedygtighed af MIR-203-overudtrykkende 5637 og T24-celler blev dramatisk reduceret sammenlignet med celler transficeret med negativ kontrol ved en koncentrationsgradient på 5, 10, 15, 20, 25 og 30 pM i 24 timer (alle på

P

0,05, fig 2B og 2C). De halvmaksimal inhiberende koncentration (IC50) værdier af cisplatin til 5637 og T24-celler var 11,1 (95% IC 9,7-12,5) uM og 14,3 (95% IC 12,7-16,1) uM. Overekspression af MIR-203 faldt betydeligt IC50-værdierne til 8,3 (95% IC 6,9-9,6) uM og 9,0 (95% IC 7,6-10,4) uM. Endvidere blev virkningerne af MIR-203 på gemcitabin og cisplatin kombination vist i S2 Filer.

(A) MIR-203 ekspressionsniveauer i 5637 og T24-celler transficeret med MIR-203 efterligner /negativ kontrol. MIR-203-niveauer blev signifikant forøget i celler transficeret med MIR-203 efterligner sammenlignet med celler transficeret med negativ kontrol (*

P

0,001, t-test, n = 6). (B, C) koncentrationsafhængig kurver for 5637 og T24-cellelinier transficeret med MIR-203 efterligner og negativ kontrol på 24 timer. Cell levedygtighed af MIR-203-overudtrykkende celler blev dramatisk reduceret sammenlignet med negative kontrolceller ved 5, 10, 15, 20, 25 og 30 pM cisplatin (alle på

P

0,05, t-test). (D) Flowcytometrianalyse for apoptose via dobbelt farvning af celler med Annexin V FITC og propidiumiodid (PI). (E) Kvantificering analyse af apoptose i fig 2B. Overekspression af MIR-203 signifikant forøget apoptose i 5637 og T24 cellelinjer (*

P

0,01, t-test, n = 6). (F) TUNEL assay angivet 5637 og T24-cellelinier transficeret med MIR-203 efterligner viste forhøjede niveauer af DNA-spaltning i forhold til normal kontrol (40 ×). Celler blev farvet med DAPI og underkastet TUNEL-assay til påvisning af DNA og apoptotiske celler.

Derefter udførte vi en flowcytometri analyse til beregning apoptose via dobbelt farvning af celler med annexin V FITC og propidiumiodid ( PI). Resultaterne viste overekspression af miR-203 signifikant forøget apoptose i både BC cellelinier (både på

P

0,05, Fig 2D og 2E). At verificere, at stigningen i apoptose skyldtes aktiveringen af ​​ovennævnte apoptose pathway, målte vi DNA-fragmentering ved TUNEL-assay og bekræftede, at celler transficeret med MIR-203 udviste forhøjede niveauer af DNA-spaltning (fig 2F).

Bcl-w og Survivin var direkte nedstrøms mål for miR-203

Bcl-w og Survivin blev forudsagt som potentielle direkte mål for miR-203 med to store mål forudsigelse programmer, Targetscan 5.1 (http: //www.targetscan.org/) og Miranda (https://www.microrna.org/). Desuden Bcl-w og Survivin spillede vigtige roller i BC udvikling, og deres nedregulering var forbundet med forøget følsomhed over for cisplatin-induceret apoptose [17-20]. De forudsagte MIR-203 rettet mod sites i 3’UTR regioner af Bcl-w (også kendt som BCL2L2) og Survivin (også kendt som BIRC5) blev vist i fig 3A. En dobbelt-reporter luciferaseanalyse blev anvendt til at bekræfte, om 3’UTR af Bd-w og Survivin mRNA havde målområder for miR-203. Vi konstruerede en luciferase reporter vektor, der koder vildtype-3′-UTR-sekvensen af ​​Bcl-w mRNA eller Survivin mRNA, herunder de forudsagte MIR-203 målsteder, og en tilsvarende mutant reporter vektor. Som vist i fig 3B, MIR-203 signifikant inhiberede luminescensintensitet af WT-Bcl-w 3′-UTR vektor og WT-Survivin 3′-UTR-vektoren (begge

P

0,01), mens mutation af bindingsstedet blokeret faldet i luciferaseaktivitet, hvilket indikerer at der var en direkte interaktion mellem mIR-203 og 3’UTR af Bcl-w mRNA eller Survivin mRNA.

(a) Illustration af den forudsagte mIR-203 målrette steder i 3’UTR regioner af Bd-w og Survivin. (B) Dobbelt-Luciferaseaktivitet blev udført i HEK293T celler cotransficeret med kontrol /MIR-203 og pmiR-RAPPORT vektorer med vildtype /mutant 3′-UTR af Bcl-w (ovenfor) og Survivin (nedenfor). *

P

0,01, t-test, n = 6. (C) Western blots viser nedregulering af Bel-w og survivin proteiner efter transfektion af miR-203 efterligner i 5637 og T24-cellelinjer. β-actin blev anvendt som kontrol. (D) RT-qPCR viser nedregulering af Bcl-w og Survivin mRNA’er efter transfektion af MIR-203 efterligner i 5637 og T24 cellelinier. *

P

0,01, t-test, n = 6. (E) Spearmans korrelationsanalyse viser en signifikant omvendt sammenhæng mellem MIR-203 og Bcl-w-mRNA eller Survivin mRNA-ekspression i blærekræft væv (r = -0,781, -0,740, både på

P

. 0,001)

For yderligere at bekræfte deres forhold i BC, vi transficeret 5637 og T24-cellelinier med miR-203 efterligner eller negativ kontrol, og analyserede mRNA og protein ekspression af Bcl-w eller Survivin ved RT-qPCR og vestlige-blotting assays. Resultaterne viste, at endogene udtryk for Bcl-w og Survivin blev signifikant reduceret i både mRNA og protein niveauer for MIR-203 transficerede BC-celler (fig 3C og 3D). I overensstemmelse med dette, var der også en signifikant omvendt sammenhæng mellem miR-203 og Bd-w eller Survivin mRNA ekspression i BC væv (r = -0,781, -0,740, både på

P

0,001; Fig 3E ). Tilsammen kan miR-203 udøve sin funktion ved direkte rettet mod Bcl-w og Survivin gen i BC.

Diskussion

Postoperativ cisplatin kemoterapi har været meget anvendt til muskel invasiv eller metastatisk BC , hvilket resulterer en reaktion i op til 70% af patienterne [21]. Desværre, på grund kemoresistens af kræftceller, svaret er ikke opretholdt i mere end 50% af tilfældene, hvilket resulterer i en 5-års overlevelse på 15% [22, 23]. Således er det vigtigt at bedre at forstå de faktorer, der bestemmer kemoterapi respons og prognose. Nordentoft et al [24] har fundet 15 miRNA som reaktion på cisplatin behandling, og 5 miRNA forbundet med overlevelsestid, hvoraf 3 miRNA (miR-886-3p, miR-923, miR-944) blev anset som indikatorer for både cisplatin respons og prognose. Tidligere undersøgelser har dokumenteret nedsat ekspression af MIR-203 blev associeret med tumorudvikling og dårlig prognose i nogle kræftformer, såsom menneskelige hoved og hals pladecellecarcinom [25], gliomer [26], og esophageal adenocarcinom [27]. I overensstemmelse med ovenstående resultater denne undersøgelse kvantificeret miR-203 niveauer i en kohorte af BC patienter behandlet med radikal cystektomi og cisplatin adjuverende kemoterapi, og fundet miR-203 var signifikant reduceret hos patienter med progressiv sygdom, mens ikke er forbundet med andre klinisk-patologiske karakteristika. Desuden viste ROC-analyse miR-203 havde nogle diagnostiske magt i at diskriminere patienter med eller uden progression. Baseret på den optimale cutoff værdi MIR-203, vi klassificeret alle patienter i høj og lav MIR-203 udtryksgrupper. Kaplan-Meier analyse viste lav miR-203 udtryk gruppe havde dårlige PFS og OS. Multivariate Cox regressionsanalyser viste, at miR-203 var en uafhængig prognostisk faktor for BC patienter. Således kunne mi-203 anvendes til prognose forudsigelse af BC patienter behandlet med cisplatin adjuverende kemoterapi.

Cellular modstand mod cisplatin ofte udviser en multifaktoriel karakter, herunder svækket intracellulær stof optagelse, øget DNA skader reparation, og faldt udførelse af apoptotiske program [28]. Drayton et al [29] fandt miR-27a bidraget til cisplatin modstand gennem regulering af intracellulær glutathion. Vinall et al [30] viste samtidig behandling med miR-34a og cisplatin resulterede i en dramatisk hæmning i spredning af kræftceller sammenlignet med behandling med cisplatin alene. Omvendt cisplatin inducerer demethylering af MIR-34a-promotoren og øger MIR-34a-ekspression, yderligere sensibiliserende BC celler til cisplatin [31]. I denne undersøgelse fandt vi, at transfektion af BC-celler med MIR-203 efterligner sensibiliserede celler til cytotoksiske aktivitet af cisplatin. I mellemtiden, data fra apoptoseassays viste når der tilføjes 5 uM cisplatin, blev mere apoptose fundet i MIR-203-overekspression blære cancerceller, hvilket antyder, at inhiberingen af ​​BC-celler levedygtighed kan være relateret i det mindste delvist, til den forbedrede modtagelighed for cisplatin-induceret apoptose. Således kan kombinationen regime af miR-203 efterligner og cisplatin forbedre BC patient behandlingsresultater.

For at få en yderligere forståelse af den rolle, miR-203 i BC udvikling, blev analyseret de potentielle downstream mål. Som medlem af Bcl-2-familien, kan Bcl-w fremme celleoverlevelse ved at hæmme indre vej af apoptose [32]. Chen et al [33] fandt Bcl-w blev overudtrykt i BC prøver sammenlignet med tilstødende normale væv, hvilket tyder på det spillede en vigtig rolle i carcinogenese af BC. Survivin, som var et vigtigt medlem af inhibitoren af ​​apoptose protein (IAP) familie [34], udført sin antiapoptotisk funktion ved at blokere caspaser aktivitet i et kompleks med X-bundet inhibitor af apoptose protein (XIAP) [35]. En multicenter undersøgelse viste Survivin udtryk var forbundet med en forhøjet risiko for BC tilbagefald og kræft dødelighed [36]. Vores data viste, at miR-203 direkte kunne binde 3′-UTR af både Bcl-w og Survivin, hvilket resulterer i nedreguleret ekspression af Bd-w og Survivin på post-transkriptionel niveau. Disse blev understøttet af kliniske data, hvor vi fandt miR-203-ekspression var og negativt korreleret med Bcl-w og survivin mRNA udtryk i BC væv prøver. Således kunne MIR-203 betragtes som et potentielt terapeutisk middel ved samtidig inhibering af antiapoptotiske faktorer Bcl-w- og survivin.

Som konklusion vores undersøgelse viser, at faldet MIR-203 kan anvendes som indikator for progression og prognose af BC patienter behandlet med cisplatin kemoterapi. Desuden kan overekspression af miR-203 forbedre cisplatin overfølsomhed ved at fremme apoptose via direkte rettet mod Bcl-w og Survivin. er behov for yderligere multicenter undersøgelser for at bekræfte, om miR-203 kunne være nyttigt som en indikator for kemosensitivitet til cisplatin-baseret kemoterapi samt en terapeutisk mål for BC i klinikken.

Støtte Information

S1 fil . MIR-203 ekspressionsniveauer af NMIBC patienter, Progression gruppe med 45 sager og ikke-progression gruppe med 67 tilfælde

doi:. 10,1371 /journal.pone.0143441.s001

(XLSX)

S2 fil. Virkningerne af miR-203 om gemcitabin og cisplatin kombination

doi:. 10,1371 /journal.pone.0143441.s002

(DOCX)