PLoS ONE: Bypass mekanismer Androgen receptor Pathway i Terapi-Resistant Prostate Cancer Cell Modeller

Abstrakt

Baggrund

Prostatakræft er oprindeligt afhængig af androgener for overlevelse og vækst, hvilket gør hormonbehandling hjørnestenen behandling for sene tumorer. Men trods indledende remission, kræft vil uundgåeligt gentage sig. Den foreliggende undersøgelse var designet til at undersøge, hvordan androgenafhængige prostatacancerceller sidst overleve og genoptage vækst under androgen-berøvet og antiandrogen suppleret betingelser. Som modelsystem, vi brugte den androgen-responsive PC346C cellelinje og dens terapi-resistente underlinjer:. PC346DCC, PC346Flu1 og PC346Flu2

Metodologi /vigtigste resultater

Microarray teknologi blev brugt til at analysere forskelle i genekspression mellem androgen-reagerende og terapi-resistent PC346 cellelinjer. Microarray analyse afslørede 487 transkripter differentielt udtrykte mellem androgen-responsive og terapi-resistent cellelinier. De fleste af disse gener var fælles for alle tre terapi-resistent underlinjer og kun et mindretal (~ 5%) blev androgen-reguleret. Pathway analyse afslørede berigelse i funktioner, der involverer cellulær bevægelse, cellevækst og celledød, samt association med cancer og reproduktive system sygdom. PC346DCC udtrykte resterende niveauer af androgen receptor (AR) og viste signifikant nedregulering af androgen-regulerede gener (p-værdi = 10

-7). blev observeret opregulering af VAV3 og TWIST1 onkogener og undertrykkelse af DKK3 tumor-suppressor i PC346DCC, hvilket antyder en potentiel AR bypass mekanisme. Efterfølgende validering af disse tre gener i patientprøver bekræftede, at udtrykket blev dereguleret under prostatakræft progression.

Konklusioner /Betydning

Terapi-resistent vækst kan skyldes tilpasninger i AR vej, men androgen- uafhængighed kan også opnås ved alternative overlevelsesmekanismer. Her identificerede vi TWIST1, VAV3 og DKK3 som potentielle spillere i omgåelse af AR vej, hvilket gør dem gode kandidater som biomarkører og nye terapeutiske mål

Henvisning:. Marques RB, DIT’er NF, Erkens-Schulze S, van Weerden WM, Jenster G (2010) Bypass mekanismer Androgen receptor Pathway i terapi-Resistant Prostate Cancer Cell Models. PLoS ONE 5 (10): e13500. doi: 10,1371 /journal.pone.0013500

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Juli 1, 2010; Accepteret: September 29, 2010; Udgivet: 19 oktober 2010

Copyright: © 2010 Marques et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet præsenteres i dette manuskript blev støttet af den nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO), gennem ZonMw tilskud 903-46-187, og af den hollandske Cancer Society (KWF), gennem tilskud NKB97-1479 og DDHK 2001-2455. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den næststørste årsag til mandlige kræftdødsfald i de vestlige lande, og et stigende problem i de vedtage vestlige livsstil og kost. Fremskridt i screening og diagnosticering har tilladt påvisning af tumorer på tidligere stadier, når helbredende terapi er stadig mulig. For sene stadium dissemineret sygdom imidlertid nuværende behandlinger er kun lindrende og ingen helbredende behandling eksisterer. Da væksten af ​​prostatatumorer oprindeligt er androgenafhængige, er metastatiske cancere generelt behandlet med androgen ablation terapi, med eller uden antiandrogen tilskud [1], [2]. Langt størstedelen af ​​disse patienter viser en signifikant klinisk regression, men kræften til sidst vender tilbage inden 12-18 måneder. Disse tilbagevendende tumorer er flygtet androgen suppression og blev resistente over for hormonbehandling, kaldet hormon-refraktær eller kastrationsresistent PCa. For at overleve og genoptage vækst i en androgen-berøvet miljø PCA celler skal enten tilpasser androgen receptor (AR) pathway til androgen-depleterede betingelser eller påberåbe alternative overlevelse og vækst pathways [3]. Meget eksperimentelle beviser eksisterer for at støtte både mekanismer, som ikke nødvendigvis udelukker hinanden. AR-ekspression blev vist at blive opretholdt i de fleste patienter, der gennemgik hormonterapi og påviste fornyet sygdom, hvilket antyder en rolle AR også i sent stadium sygdom [4], [5]. Endvidere er AR-genet amplificeret og /eller overudtrykt i ca. 30% af hormon-terapi ildfaste tumorer, og det er blevet foreslået dette kunne sensibilisere receptoren for de tilbageværende androgen koncentrationer og antiandrogener stede under hormonbehandlinger [6], [7 ], [8]. Desuden flere AR mutationer, hvilket resulterer i øget aktivitet eller udvidet ligand-specificitet til alternative steroider og antiandrogener, har været forbundet med sygdomsprogression [9], [10]. Andre modifikationer af AR vej, der kan fremkalde hormon-refraktær vækst omfatter intratumoral steroidogenese, ligand-uafhængig aktivering af cross-talk med andre signalveje, ændringer i balancen i AR co-regulatorer eller udtryk for konstitutivt aktive trunkerede AR isoformer [3] [11], [12]. Interessant, har nyere arbejde fra andre og os viste, at AR pathway kan selektivt svækket i avanceret /metastatisk sygdom [13], [14], [15]. Da AR pathway også er involveret i processer af cellulær differentiering og prostata modning, er det fristende at antage, at PCA-celler i sidste ende kan få vækstfordel ved at hæmme AR inducerede differentiering. Foranlediget af disse resultater har vi fokuseret nærværende undersøgelse af alternative overlevelse og vækst veje, der er uafhængige af AR aktivering. For effektivt at omgå AR vej, skal cancer epitelceller kunne overleve de apoptotiske signaler udløst af hormonbehandlinger og påberåbe alternative vækst veje. Autokrin produktion af vækstfaktorer eller dens receptorer, aktivering af onkogener og inhibering af tumor-suppressor-gener er alle mulige mekanismer til at omgå AR pathway. I overensstemmelse med denne hypotese, parakrine vækstfaktorer, der normalt udskilles af prostata stromaceller, såsom epidermal vækstfaktor (EGF), insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF1), hepatocytvækstfaktor (HGF), keratinocytvækstfaktor (KGF) eller interleukin 6 (IL6), findes at være overekspression i hormon-refraktær cancer i association med et skift til autokrin produktion af cancer epitelceller [16]. Ud over at være potentielle mitogener, stigende evidens for, at disse væksthormoner er også i stand til krydstale med AR signalvej, hvilket fører til ekspression af AR målgener i fravær af androgener [17]. Derfor har det endnu ikke fastslået, om den autokrine produktion af disse vækstfaktorer repræsenterer en tilpasning eller en sand bypass af AR signalvejen. Ændringer i den anti-apoptotiske

BCL2

onkogen og i pro-apoptotiske

P53

PTEN

tumor-suppressor gener er også blevet fundet i prostatakræft [18], [19]. Men disse begivenheder meste optræder før sent progression, hvilket gør dem mindre sandsynlige kandidater til overgangen til hormon-refraktær vækst i sent stadium sygdom. Ikke desto mindre, ved at hæmme PCa celledød og ændre balancen i retning af cellulær proliferation, gener involveret i reguleringen af ​​apoptose kan også spille en rolle i hormon-refraktær vækst.

At udforske mekanismen (er), hvorved androgen- afhængige PCA celler bliver resistente over for hormonbehandling, brugte vi microarray-teknologi til at afhøre forskellene i genekspression mellem androgen-reagerende og terapi-resistent cellelinier. Som model system, vi brugte den androgen-responsive PC346C cellelinje og dens terapi-resistente underlinjer PC346DCC, PC346Flu1 og PC346Flu2. Disse underlinjer blev afledt fra forældrenes PC346C af langvarig androgen ablation (PC346DCC), suppleret med antiandrogen hydroxyflutamid (PC346Flu1 og PC346Flu2) [20], [21]. Tidligere undersøgelser afslørede distinkte AR modifikationer i alle tre terapi-resistent underlinjer, som svarede til forskellige mekanisme af hormon-refraktær vækst. Betragtninger PC346DCC, udtrykker meget lave niveauer af AR og PSA, viste tegn på omgåelse af AR vej, PC346Flu1 udstillet 4 gange AR opregulering og PC346Flu2 viste sig at bære T877A AR mutation. Både PC346Flu1 og PC346Flu2 underlinjer replikere progression til hormon-terapi refraktær sygdom gennem tilpasninger af AR vej. Derfor fokuserede vi på PC346DCC sublinjen at vælge for gener særligt involveret i bypass af AR vej. Ud over at give nye indsigter i mekanismerne i PCa progression, kan de identificerede gener her vise sig nyttige som prognostiske markører og potentielle mål for nye terapeutiske metoder.

Metoder

Reagenser og cellelinjer

PC346C cellelinie blev afledt af prostata tumor i en patient med ikke-progressiv prostata-adenocarcinom (T4N0M0) [20], [21]. Den PC346DCC blev PC346Flu1 og PC346Flu2 underlinjer afledt PC346C ved langtidsdyrkning i kul-strippet medium, uden eller med antiandrogen hydroxyflutamid tilskud hhv. Udviklingen og karakteriseringen af ​​disse cellelinier er tidligere blevet publiceret [20], [21]. Den grundlæggende anvendte dyrkningsmedium i vedligeholdelse af PC346 cellelinier bestod af DMEM-F12-medium (Cambrex BioWhitaker, Belgien) suppleret med 2% føtalt kalveserum (FCS; PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Tyskland), 1% insulin-transferrin-selen (Gibco BRL), 0,01% bovint serumalbumin (Boehringer Mannheim, Tyskland), 10 ng /ml epidermal vækstfaktor (Sigma-Aldrich), penicillin /streptomycin antibiotika (100 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin; BioWhitaker, Belgien ); suppleret med følgende: 100 ng /ml fibronectin (Harbor Bio-Products, Tebu-bio, Holland), 20 mg /ml fetuine (ICN Biomedicals, Holland), 50 ng /ml choleratoxin, 0,1 mM phosphoethanolamin, 0,6 ng /ml triiodthyronin og 500 ng /ml Dexametason (alle fra Sigma). PC346C celler blev holdt i kultur i komplet medium som beskrevet ovenfor, suppleret med 0,1 nM 17-methyltrienolone (R1881, NEN, Boston MA, USA). PC346DCC selektionsmedium blev suppleret som beskrevet ovenfor, men forarmet fra androgener ved hjælp dextran-belagt trækul (DCC) behandlet FCS. PC346Flu1 og PC346Flu2 dyrkningsmediet blev også androgen udtømt ved anvendelse af 2% DCC-FCS, og suppleret med 1 uM af hydroxyflutamid (OH-flutamid, Schering-Plough Research Institute, New Jersey, USA).

Celler dyrkedes i T25 Primaria ™ vævskulturkolber (BD Biosciences Benelux NV, Holland) ved 37 ° C under 5% CO

2 befugtet atmosfære.

Expression microarray analyse

Celler blev podet i deres respektive selektionsmedium at nå -50% konfluens og lodes vokse i 2 dage. Derefter blev celler skyllet to gange med PBS og opbevaret ved -20 ° C indtil RNA-isolering. Totalt RNA blev isoleret med RNAzol B reagens (Campro Scientific, Veenendaal, Holland) og yderligere oprenset ved RNeasy-søjler (Qiagen) med on-søjle DNA-fordøjelse, ifølge fabrikantens protokol. RNA kvalitet blev kontrolleret på 1% agarosegel.

Cy3- eller Cy5-mærkede RNA-prober blev fremstillet ved at inkorporere amino-allyl UTP under RNA-amplifikation, efterfulgt af kobling til N-hydroxysuccinimid modificeret farvestof. Kort beskrevet blev 3 ug RNA anvendes til en T7-baserede lineær mRNA amplificering protokol, der er beskrevet tidligere [22]. Amino-allyl UTP, plus samme mængde umodificeret rUTP, blev inkorporeret i aRNA med T7 Megascript Kit (alle fra Ambion) ifølge producentens protokol. Amplificerede RNA blev oprenset og koncentreret ved anvendelse af Microcon-YM 30 søjler (Amicon®) at skylle tre gange med 300 pi RNAse-frit vand. Endelig 2 ug aminoallyl-modificeret RNA, i højst 3,33 pi RNAse-frit vand, blev inkuberet med 1,66 pi natriumhydrogencarbonatbuffer (0,3 M, pH 9) og 5 pi Cy3- eller Cy5- farvestof (CyScribe Post-Mærkning kit, Amersham, NJ, USA), i 1 time i mørke ved stuetemperatur. Reaktionen blev standset med 5 pi 4 M hydroxylamin HCI (Sigma), blev kontraindikationer-mærkede prober kombineret og oprenset /koncentreret under anvendelse Microcon-YM 30. Probe blev opsamlet i 5-15 pi slutvolumen og resuspenderet i 80 pi Ambion hybridiseringsbuffer nummer 1 .

for microarray vi brugte dobbelt-dye oligoarrays repræsenterer ca. 15.000 humane gener, som mærket RNA fra hver terapi-resistent sublinie blev cohybridized med kontra-mærket PC346C. Fire mikroarrays blev udført pr tilstand, ved hjælp af to forskellige celle passager i dye-swap. Dette blev gjort for at tage højde for den biologiske variabilitet og til at udelukke farvestof-præferentiel binding til oligonukleotider på mikroarrayet. De oligoarrays anvendt i denne undersøgelse blev produceret på Erasmus Center for BIOMICS. Kort fortalt, et menneske 18,584 oligonukleotider bibliotek (Compugen, Sigma-Genosys) blev spottet på aminosilanforbindelser objektglas under anvendelse af en Virtek Chipwriter Professional arrayer (Virtek Vision International, Waterloo, Canada). Kontrolpletter inkluderet landmærker, spotting-buffer, fremmede oligonukleotider (SpotReport fremmede Oligo Array, La Jolla, Stratagene), poly-d [A] 40-60, laksesperma-DNA, og human COT-1 DNA. Før hybridisering blev microarray objektglas præhybridiseret i 5 x SSC, 0,05% SDS, 4% BSA-opløsning i 30 minutter ved 45 ° C, vasket to gange med RNAse-frit vand i 2 minutter, skyllet med isopropanol og spin-tørret i 3 minutter ved 1500 g. Microarray hybridiseringer blev udført natten over ved 45 ° C, under kontinuerlig omrøring, i en HS4800 Hybridisering Station (Tecan Benelux BV). Endelig blev arrays vasket automatisk i Hybridisering Station med:. 2x SSC /0,05% SDS (ved 45 ° C), 1x SSC og 0,2 x SSC (ved stuetemperatur), og tørret under en strøm af N2, før scanning

dataudtræk og analyse

Arrays blev scannet i en ScanArray Express HT scanner (Perkin Elmer, Nederland BV) og spot intensiteter blev kvantificeret ved hjælp Imagene software (Bio Discovery Inc, El Sequndo, CA, USA ). For at skabe balance Cy3 og Cy5 spot intensiteter, Loewess normalisering pr undergruppering blev udført ved hjælp limma-pakke (https://bioinf.wehi.edu.au/limma/) fra BioConductor (https://www.bioconductor.org) [23] , [24]. For at skalere mellem arrays, blev det globale median intensitet pr vifte sat til 1000. Dye intensiteter under 200 blev derefter tærsklingsbehandlet ved 200, at minimere støj og gøre fold-ændring på lav intensitet interval mere robust over for outliers. Steder med intensiteter under tærsklen (200) for begge Cy3 og Cy5 kanaler i mere end 2 af de 4 arrays udført pr sublinie blev udelukket fra analysen. Prøve at referere forhold blev derefter beregnet og 2log transformeret. Steder, der viste modsatrettede virkninger for dye-swap /biologiske replikater blev udelukket fra yderligere analyse; effekter blev kaldt modsat hvis middelværdien 2log ratio for pr sublinie var ≥0.5 for et farvestof og under ≤-0,5 for farvestoffet-swap. Efter normalisering og alle de ovennævnte kvalitetskontrol blev de 2log forhold intensitet midlet for de gentagelser af hver delområde. Disse data blev lagret i SRS7 (Sequence Retrieval System version 7, Lion Bioscience AG, Heidenberg, Tyskland), som også blev brugt til sammenligninger med andre tidligere publicerede /offentligt tilgængelige databaser [25]. Den microarray data blev deponeret i Gene Expression Omnibus repository (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/under tiltrædelse GEO nummer GSE21596). Hierarkisk klyngedannelse og datavisualisering blev udført ved hjælp af Cluster og TreeView programmer (Eisen Labs: https://rama.lbl.gov). Betydning Analyse af microarrays (SAM; https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM) blev anvendt til at bestemme, hvilke gener var statistisk forskellige mellem stimulerede prøver og ikke-stimulerede referencer. Gene ontologi klyngedannelse blev udført ved hjælp af Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [26], [27]. Den vej og funktionelle analyser blev genereret ved brug af Opfindsomhed Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

cDNA syntese og RT-PCR-analyse

Normal og tumor prøver fra patienter, der anvendes til kvantitativ real-time RT-PCR-analyse blev opnået fra den frosne vævsbank af Erasmus Medical center (Rotterdam, Holland). Prøverne blev indsamlet mellem 1984 og 2001. De eksperimentelle protokoller blev godkendt af Erasmus MC Medical Ethics Committee henhold til medicinsk forskning med mennesket Emner Act. Yderligere oplysninger om disse prøver blev leveret tidligere. [28] Totalt RNA blev isoleret som beskrevet ovenfor og cDNA blev syntetiseret under anvendelse af MMLV-revers transkriptase-kit og oligo (dT)

12-18 primer (Invitrogen) ifølge producentens protokol. cDNA-prøver blev opbevaret ved -20 ° C. TaqMan real-time PCR-analyse blev udført i en ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) under anvendelse af AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems) ifølge producentens specifikationer. Validerede primere og prober fra TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) blev anvendt til kvantificering af VAV3 (Hs00916821_m1), TWIST1 (Hs00361186_m1), DKK3 (Hs00951307_m1) og GAPDH (Hs99999905_m1), i overensstemmelse med PCR-indstillingerne leveret af Applied Biosystems. PBGD blev kvantificeret ved hjælp af 0,33 uM primere forward: CATGTCTGGTAACGGCAATG og omvendt: GTACGAGGCTTTCAATGTTG primere, i Power SybrGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems) ifølge termocykling protokol anbefalet af producenten. Udskrift mængder for hver prøve blev normaliseret mod gennemsnittet af to endogene referencer og i forhold til en kalibrator. De to husholdning gener anvendt som endogene referencer var

PBGD

og

GAPDH

; en blanding af cDNA’er fra prostatacarcinom xenotransplantater blev anvendt som kalibrator. Grafer og statistik blev udført med GraphPad Prism (version 3.0). P-værdier 0,05 blev anset for signifikant

Resultater

Differential genekspressionsprofil mellem androgen-responsive PC346C og dens terapi-resistente underlinjer

Expression array analyse blev udført. at undersøge, om den AR vej er stadig aktiv i hormon-terapi ildfaste celler under androgen-berøvet betingelser og identificere formodede alternative vækst /overlevelse veje. Hver af terapi-resistent underlinjer blev dyrket i deres respektive selektionsmedium (steroid-strippet medium for PC346DCC, suppleret med 1 uM OH-flutamid for PC346Flu1 og Flu2) og hybridiseret på mikroarrays, sammen med den parentale androgen-responsive PC346C (dyrkede i komplet medium suppleret med 0,1 nM R1881). At tage højde for den biologiske variabilitet og farvestof-præferentiel binding til oligonukleotider på mikroarrayet, blev udført fire arrays per tilstand, ved hjælp af to uafhængige cellepassager i farvestof-swap. Variation i udtryk mønster blev analyseret pr terapi-resistent sublinie, og pletter blev anset for at være udtrykt forskelligt, hvis den absolutte 2log forholdet ≥ 0,5 (forholdet ≥ 1,42 eller ≤0.71) i mindst tre af de 4 arrays og for gennemsnittet af alle fire arrays. Ifølge disse kriterier, der var i alt 487 forskelligt regulerede udskrifter i terapi-resistente underlinjer forhold til androgen-følsomme PC346C, hvoraf de fleste var overlappende alle tre ildfaste underlinjer (fig. 1). Med 276 forskelligt regulerede udskrifter, viste PC346DCC den stærkeste afvigelse fra forældrenes linje, mens PC346Flu2 afslørede de mindst ændringer (127 udskrifter). Betydning Analyse af microarrays (SAM) blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans af de udvalgte gener og, på et 5% falsk opdagelse sats, 392 i den 487 (80%) udvalgt nået statistisk signifikans. De øverste 100 differentielt udtrykte gener mellem terapi-resistente og androgen-responsive cellelinjer, respektive udtryk nøgletal og statistiske analyser er vist i tabel 1 og 2. En omfattende liste over alle de regulerede gener pr delområde gives i tabel S1 til S3 . Interessant, en betydelig del (64/487) af de differentielt regulerede gener grupperet i særskilte genomiske steder på kromosomerne 4, 5, 6, 8, 11 og 18 (p-værdi 0,05; tabel 3).

PC346C blev dyrket i komplet medium med 0,1 nM R1881, hvorimod hormonresistent underlinjer var kulturen i dextran-belagt trækul strippet medium (PC346DCC), suppleret med 1 uM af antiandrogenet hydroxyflutamid (PC346Flu1 og PC346Flu2). A) Heat-map repræsentation: røde og grønne farver repræsenterer opregulering og nedregulering, henholdsvis, mens sort angiver nogen forskel mellem underlinjer og forældrenes PC234C celler. Grå firkanter angiver manglende data, enten som følge af lave ekspressionsniveauer, dårlig datakvalitet eller fravær af prober til den respektive transkript i arrayet platform, der anvendes til undersøgelsen. B) Venn-diagram over antallet af regulerede gener i de forskellige underlinjer. Vejviser

AR vej nedreguleres i PC346DCC

For at undersøge aktivering tilstand AR vej i PC346DCC, PC346Flu1 og PC346Flu2 blev SRS-databasen anvendes til at forbinde og sammenligne vores nuværende data med en tidligere etableret androgen-respons gen signatur (fig. 2A). Denne androgen-respons signatur blev bestemt ved ekspression microarray analyse, efter stimulering af de forskellige PC346 cellelinjer med det syntetiske androgen R1881 eller antiandrogenet hydroxyflutamid (tabel S4). Af de 487 forskelligt regulerede udskrifter i terapi-resistente underlinjer, kun 27 var AR målgener ( 6%), hvilket indikerer, at andre gener og veje også er involveret i hormon-terapi refraktær spredning af disse underlinjer. Desuden AR målgener blev nedreguleret i PC346DCC (p-værdi = 10

-7), mens deres udtryk i PC346Flu1 og PC346Flu2 ikke var væsentligt påvirket (fig. 2B). Men selvom ikke statistisk signifikant for AR-vejen som helhed, PC346Flu1 og PC346Flu2 gjorde vise lavere induktion af visse androgen-responsive gener, såsom KLK2, STEAP1, STEAP2 og EHF. Salg

differentielt udtrykte gener i PC346 hormon -refractory underlinjer versus parental PC346C var knyttet til en tidligere etableret androgen-respons-gen signatur (se materialer og fremgangsmåder). (A) Heat-map repræsentation af androgen-responsive gener dereguleret i nogen af ​​PC346 hormonresistent underlinjer. Farvesammensætning som beskrevet i fig. 1. (B) Venn-diagram og respektive statistikker.

Gene ontologi og sti analyse identificerer kræft signatur

Den valgte 487-gen signatur blev klassificeret i henhold til Gene Ontology (GO) Biologiske processer ved hjælp af Database til Annotation, Visualisering og integreret Discovery (DAVID) [26], [27]. Annotation clustering analyse viste berigelse i kategorier, der er involveret i orgel udvikling, reproduktive system differentiering, cellevækst, differentiering og apoptose (tabel 4). Ingenuity Pathway Analyse blev anvendt til at identificere berigelse i “sygdomme og lidelser”, “molekylære og cellulære funktioner”, og at søge efter iboende veje /netværk inden for de udvalgte gen sæt (www.ingenuity.com). Kræft og reproduktive system sygdom blev rangeret i top 3 i “sygdomme og lidelser”, som logisk bekræftede berigelse af gener forbundet med PCa, såsom hepsin, clusterin, vitamin D receptor, trefoil faktor 3, tumor protein D52, AR selv og flere af målgener (fig. 3A og 3B, henholdsvis). Desuden brugte vi Network analyse til at screene 276-genet underskrift PC346DCC for potentielle alternative vækst veje, der kunne være involveret i omgåelse af AR signalering. Interessant, signalering via vækst-hormon receptor (GHR), insulin receptor (INSR) og epidermal vækstfaktor receptor var blandt de 10 Networks (score = 20) viser deregulering i PC346DCC (fig. 3C).

Top 5 biologiske funktioner beriget i terapien-resistente underlinjer: (A) sygdomme og lidelser, (B) molekylære og cellulære funktioner. (C) Eksempel på Netværk analyse for PC346DCC viser deregulering af hormon og vækst-faktor receptor signalering: opreguleret gener er repræsenteret i røde og fortrængte gener i grønt. Analyse blev udført ved hjælp Ingenuity Pathway Analysis software (www.ingenuity.com).

Integrativ analyse viser gener dereguleret i prostatakræft progression

For at identificere gener moduleret i PCa at kunne forklare hormon-terapi refraktær vækst gennem bypass af AR vej, vi forbandt 276-genet signatur fra PC346DCC med data fra syv PCA microarray studier tidligere offentliggjorte (tabel 5) [14], [29], [30], [31 ], [32], [33], [34]. Kun gener til stede i mindst 5/7 databaser (209 gener) og deregulerede i mindst 3/7 (111 gener) blev inkluderet til yderligere analyse. Hierarkisk klyngedannelse udført på signatur gener (første kolonne), ved siden af ​​primær kræft vs normal prostata (anden kolonne), metastatisk kræft vs primær cancer (tredje søjle), og endelig hormon-refraktær vs hormon-naive sygdom (fjerde kolonne ), er vist i fig. 4. Ca. 30% af generne udtrykkes forskelligt i PC346DCC viste sig at være konsekvent dereguleret i metastatisk PCa forhold til orgel-begrænset sygdom.

276-gen signatur fra PC346DCC var forbundet med data fra 7 prostatakræft microarray databaser over primær (Lapointe, Varambally, Tomlins, Yu), metastatisk (Chandran, Lapointe, Varambally, Tomlins, Yu) og hormon-terapi ildfaste tumorer (Tamura, Tomlins og Best). Kun gener til stede i mindst 5/7 databaser (209 gener) og deregulerede i mindst 3/7 (111 gener) blev inkluderet i analysen. Heat-map repræsentation af (A) 72 overudtrykte og (B) 39 fortrængte gener i PC346DCC. (C) dereguleret gener udvalgt til yderligere qPCR analyser. Farvesammensætning som beskrevet i fig. 1. Grå firkanter angiver manglende data, enten som følge af lave ekspressionsniveauer, dårlig datakvalitet eller fravær af prober til den respektive transkript i arrayet platform, der anvendes til undersøgelsen. PC-NAP: prostatakræft minus normal tilstødende prostata; MET-PC: metastase minus primær prostata tumorer; HR-HN:. Hormon-terapi refraktær minus hormon-naive tumorer

TWIST1, DKK3 og VAV3 som markører for sygdom diagnose og prognose

Baseret på deres anerkendte patologiske funktioner og konsekvent deregulering i flere PCA databaser, twist homolog en (TWIST1), vav 3 guanin nukleotid udveksling faktor (VAV3) og dickkopf homolog 3 (DKK3) blev udvalgt for deres potentielle rolle i bypass af AR vej. På denne måde TWIST1 og VAV3 er formodede onkogener involveret i væksthormon signalering, som afsløret ved Ingenuity Pathway Analysis (fig. 3C). På den anden side, DKK3 er en tumor suppressor, viser stærk nedregulering i datasættene fra Chandran

et al.

, Lapointe

et al.

Og Varambally

et al.

(fig. 4C). Betragtninger TWIST1 viste konsekvent opregulering i primære og metastatiske PCA datasæt fra Varambally

et al.

, Yu

et al.

, Lapointe

et al.

Og Chandran

et al.

, VAV3 blev nedreguleret i primære tumorer efterfulgt af opregulering i metastaser (fig. 4C).

Kvantitativ RT-PCR blev udført på et uafhængigt sæt prostata prøver, opnået ved radikal prostatektomi eller transuretral resektion af prostata af patienter, der drives ved Erasmus MC klinik. Dette panel indeholdt 21 godartet prostata vævsprøver og 74 adenocarcinomer på forskellige sygdomstilstande stadier. Kvantitativ PCR-analyse viste (henholdsvis P-værdi = 0,0001 og 0,002,) opregulering af TWIST1 i primære PCA prøver og lymfeknudemetastase. Ingen forskel blev observeret mellem hormon-refraktær (HRPC) og hormon-naive tumorer (HNPC) (fig. 5A). DKK3 udtryk var faldet betydeligt i PCa og lymfeknude metastaser (P-værdi ≤0.0001), selv om der blev observeret nogen forskel i progression fra orgel-begrænset til metastaserende eller hormon-refraktær sygdom (fig. 5B). VAV3 udtryk faldt gradvist i løbet af PCa progression, med de laveste niveauer observeret i metastatiske prostata tumorer (P-værdi = 0,0001 for Post lineær-trend test) og hormon-refraktær prøver (P-værdi = 0,005 for HNPC vs. HRPC;. Fig 5C ). Lymfeknude prøver blev fjernet fra VAV3 analysen i fig. 5C, fordi VAV3 blev højt udtrykt i normale lymfeknude sammenlignet med normale prostatavæv (data ikke vist). I disse indstillinger, kan tilstedeværelsen af ​​rester af normal lymfeknude væv føre til overvurdering af den reelle VAV3 mængde i lymfeknudemetastaser. Kaplan-Meier-analyse viste en direkte korrelation mellem VAV3 ekspression og metastase overlevelse (p-værdi = 0,004 for Logrank trend test. Figur 5D).

prostatatumor prøver blev opnået ved radikal prostatektomi eller transuretral prostata af patienter, der drives ved Erasmus MC klinik. Dette panel indeholder 21 godartede prostata vævsprøver og 74 adenocarcinomer på forskellige sygdomstilstande stadier. (A) TWIST1; (B) DKK3; (C) VAV3 ekspression i prostataprøver; (D) VAV3 metastase overlevelse analyse. NAP: normal tilstødende prostata; PC: primær prostatacancer; LNmet: lymfeknudemetastase; PC-Met: ikke-progressive orgel-indskrænke prostatakræft; PC + Met: primær tumor fra progressiv prostatacancer, enten haft eller udviklet metastaser under efterfølgende opfølgning; HN: hormon-naive; HR: hormon-terapi ildfaste materialer; (*) P-værdi ≤0.0001 og (**) p-værdi ≤0.005 hjælp Mann-Whitney tosidet test. (***) P-værdi ≤0.0001 med Post lineær-trend test.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi brugte microarray analyse for at identificere forskelle i genekspression mønster af androgen-responderende PC346C cellelinje og dens terapi-resistente underlinjer: PC346DCC, PC346Flu1 og PC346Flu2. Denne analyse opdaget 487 udskrifter forskelligt reguleret i hormon-terapi ildfaste celler versus forældrenes PC346C. Mange af disse var fælles for alle terapi-resistent underlinjer trods de forskellige AR pathway modifikationer, hvilket tyder lignende vækstfremmende tilpasninger (fig. 1). Disse delte gener kunne opdeles i fire hovedkategorier: regulering af cellecyklus progression og spredning, udvikling og cellulær differentiering (CLEC3B, KCNJ8, ADAM29, DNMT3A), fedtsyre og steroid (ex HPN, NDN, ATR, ABL2, DHRS2.)