PLoS ONE: Arg-Gly-Asp (RGD) -modificerede E1A /E1B Dobbelt Mutant Adenovirus Forbedrer antitumoraktivitet i prostata cancer celler in vitro og in Mice

Abstrakt

CAR er et transmembrant protein, som udtrykkes i forskellige epitel- og endotelceller. CAR medierer adenoviral infektion, samt adenovirus-medieret onkolyse af AxdAdB-3, et E1A /E1B dobbelt-begrænset onkolytisk adenovirus, i prostatacancerceller. Denne undersøgelse vurderede endvidere den terapeutiske effektivitet af AxdAdB-3 med Arg-Gly-Asp (RGD) -Fiber modifikation (AxdAdB3-F /RGD), som gør det muligt integrin-afhængig infektion, i prostatacancer. Følsomhed af prostatacancerceller LNCaP, PC3, og DU145 til adenovirusinfektion var forbundet med CAR udtryk. Alle de prostatakræft-cellelinier udtrykte integrin α

Vp

3 og α

Vp

5. AxdAdB-3 var mere cytopatisk i CAR-positive prostata kræftceller end i CAR-negative celler, hvorimod AxdAdB3-F /RGD forårsagede potent onkolyse både CAR-positive og CAR-negative prostata kræftceller. I modsætning hertil blev AxdAdB3-F /RGD ikke cytopatisk mod normale prostata epitelceller, RWPE-1. Intratumoral injektion af AxdAdB3-F /RGD i CAR-negative prostatakræft celle implanteret i nøgne mus hæmmede tumorvækst. Den aktuelle undersøgelse viser, at E1A /E1B double-begrænset onkolytiske adenovirus med en RGD-fiber modifikation forbedrer infektion effektivitet og anti-tumor aktivitet i CAR-mangelfulde prostatacancerceller, mens besparende normale celler. Fremtidige undersøgelser vil evaluere det terapeutiske potentiale AxdAdB3-F /RGD i prostatakræft

Henvisning:. Shen Y-H, Yang F, Wang H, Cai Z-J, Xu Y-P, Zhao A, et al. (2016) Arg-Gly-Asp (RGD) -modificerede E1A /E1B Dobbelt Mutant Adenovirus Forbedrer antitumoraktivitet i prostatakræft celler

In Vitro

i mus. PLoS ONE 11 (1): e0147173. doi: 10,1371 /journal.pone.0147173

Redaktør: Ilya Ulasov, svensk Neuroscience Institute, UNITED STATES

Modtaget: May 10, 2015; Accepteret: December 30, 2015; Udgivet: 22 Jan 2016

Copyright: © 2016 Shen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af en bevilling fra Natural Science Foundation of Zhejiang-provinsen, Kina (# LY12H16031) og fra Health Bureau of Zhejiang-provinsen, Kina (# 2012KYA025) .

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindeligt forekommende malignitet i verden, især i de vestlige lande. Det anslås, at prostatakræft vil forårsage 220,800 nye tilfælde og 27,540 kræft dødsfald i USA i 2015. [1] I Kina, prostatakræft forekomst har været hastigt stigende i de seneste årtier, og mere end 70% af prostata cancer patienter har avanceret eller metastatisk sygdom. [2] til dato hormonbehandling er stadig den mest nyttig terapi til patienter med prostatakræft, men det administreres til en begrænset en tidsperiode og næsten alle prostatacancerpatienter der modtager androgen ablation sidste ende udvikle sig til androgen refraktær sygdom, [3] kendt som kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). Docetaxel kemoterapi er ofte anvendes til behandling af patienter med CRPC, men progressionsfri overlevelse kun varer seks måneder. [4] Selv om romanen androgen receptor hæmmer (Enzalutamide) og cytochrom P450, familie 17, underfamilie Et polypeptid (CYP17) inhibitor ( abiraterone) er blevet rapporteret til mere effektivt at behandle CRPC patienter, kan en sådan behandling kun forbedre overlevelsen for et par måneder. [5, 6] Derfor er et presserende behov for nye og mere effektive behandlingsstrategier for at forbedre prostatakræft prognose.

Tidligere undersøgelser har vist, at en onkolytisk adenovirus var i stand til selektivt at replikere og dræbe kræftceller og samtidig skåne normale celler. Denne oncolytisk viral behandling kunne være klinisk lovende til behandling af humane kræftformer, herunder prostatakræft. [7-9] Vores tidligere undersøgelse viste, at en E1A /E1B dobbelt mutant onkolytiske adenovirus, AxdAdB-3, havde antitumoraktivitet i en ortotopisk, prostatakræft SCID (svær kombineret immundefekt) musemodel. [10] Men AxdAdB-3 viste utilstrækkelige cytopatiske effekter i nogle prostatakræft-cellelinier, som udtrykte lave niveauer af coxsackievirus adenovirus receptor (CAR). [10] CAR er et transmembrant protein, som udtrykkes i forskellige epitel- og endotelceller og funktioner til at mediere adenoviral infektion. Cancerceller med nedsat CAR-ekspression er blevet rapporteret at være resistente over for virusinfektion og adenovirus-medieret genterapi. [11] I prostatacancer, CAR ekspression er ofte fraværende, [12, 13], der kan begrænse brugen af ​​adenovirus-leveret genterapi . En tidligere undersøgelse viste, at indsættelse af Arg-Gly-Asp (RGD) peptid i HI løkke af fiberen knop domæne forbedret adenovirus medieret gentransduktion i CAR-negative celler gennem binding af RGD peptid til integriner på målcellerne . [14] således i denne undersøgelse vurderede vi den terapeutiske effektivitet af E1A /E1B dobbelte mutant onkolytiske adenovirus, AxdAdB-3, med Arg-Gly-Asp (RGD) -Fiber modifikation (AxdAdB3-F /RGD) i prostata cancer

in vitro

i nøgne mus.

Materialer og metoder

cellelinjer og kultur

Menneskelig androgen-afhængige prostatacancer LNCaP (metastaser til lymfeknuderne), human androgen-uafhængig prostatacancer-cellelinier PC3 (metastase til knoglen) og DU145 (metastase til hjernen), og normale voksne prostata epitelceller inficeret med en enkelt kopi af human papillomavirus 18 (navngivet RWPE- 1) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA). LNCaP celler har vildtype p53 og p16 udtryk [15, 16] har PC3 celler muteret p53 men methylerede vildtype p16;. [15, 16], og DU-145 celler har begge muterede p53and p16 [15, 16] Humane embryonale nyre 293 (HEK-293) celler blev opnået fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Cellelinier blev opretholdt i Roswell Park Memorial Institute eller Eagles minimale essentielle medium (for HEK293) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i befugtet 5% CO

2 atmosfære ved 37 ° C. RWPE-1 blev opretholdt i K-SFM komplet medium (Cell Systems, Kirkland, WA, USA) og derefter standset i K-SFM uden serum vækstfaktor før virusinfektion.

Rekombinant adenovirus og celleinfektion

AxCAZ3-F /RGD [17] og AxCAlacZ [18] er E1 udgår replikationsdefekte adenovirusvektorer der udtrykker

Escherichia coli

lacZ-genet under kontrol af den CAG promotor med eller uden et RGD-peptid i HI løkke af fiberen knop domæne. AxdAdB-3 har en mutant replikationskompetent Ad5 indeholdende SXGXE (STGHE) mutation i stedet for LXCXE (LTCHE) Rb-bindende motiv i E1A og sletning af E1B55 KD [19]. For at konstruere AxdAdB3-F /RGD hjælp pWEAxKM-F /RGD, klonede vi de RGD-4C aminosyrer i HI løkke af fiberen knop domæne mellem aminosyreresterne 546 og 547 med en E3 deletion. Aminosyresekvenserne af RGD-mutationen var T 546 CDCRGDCFCP 547. AxdAdB3-F /RGD blev genereret ved co-transfektion af HEK293-celler med pWEAxKM-F /RGD cosmid-DNA, som var blevet fordøjet med

Cla

jeg og

Pac

jeg, sammen med

EcoR

I- og

Ase

i-fordøjet DNA-TPC (terminal proteinkompleks) af AxdAdB3 [17]. De virale vektorer blev leveret af Riken Gene Bank (Tsukuba, Japan) og transficeret ind i HEK293-celler til at producere adenovira og den virale titer blev bestemt ved en standard plaque assay.

I infektion blev celler podet på en 6 brønds plade og dyrket natten over. Den næste dag blev celler inficeret med AxCAlacZ eller AxCAZ3-F /RGD ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 100 i 24 timer. Ekspression af adenovirale hexonprotein i de inficerede celler blev bestemt ved Western blot analyse. I mellemtiden blev celler inficeret med AxCAlacZ eller AxCAZ3-F /RGD adenovira ved en MOI på 100 i 24 timer og niveauer af adenovirale hexonprotein i inficerede celler blev derefter vurderet ved anvendelse af flowcytometri (beskrevet i det følgende afsnit) med et monoklonalt muse anti- hexon antistof (MAB805, Chemicon International, Temecula, CA).

protein ekstraktion og Western blot-

Celler blev lyseret i 100 pi lysepuffer og proteinkoncentrationen blev målt ved BCA-metoden. Derefter blev lige store mængder af proteinprøver i supernatanten separeret under anvendelse af natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) i en 12% SDS-PAGE-gel og derefter overført til en polyvinylidendifluoridmembran (Millipore, Billerica, MA, USA) . Membranen blev derefter inkuberet med et monoklonalt muse-anti-hexon antistof (MAB805, Chemicon International, Temecula, CA, USA) og efterfølgende inkuberet med et anti-muse-IgG-antistof i 1 time efterfulgt af forøget kemiluminescens (ECL; Cell Signaling Technology, MI , CA, USA). Membranen blev derefter udsat for x-ray film og scannes for kvantificering hjælp Billede J Software (National Institute of Heath, Bethesda, MD, USA).

Flowcytometri at bestemme udtryk for CAR og integrin niveauer i celler

Celler blev podet på en plade med 6 brønde og dyrket natten over. For at detektere ekspression af CAR og integrin α

Vp

3 og α

Vp

5 blev cellerne løsrevet anvendelse af et enzym-fri dissociation opløsning og derefter inkuberet med et monoklonalt muse-anti-humant CAR antistof (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA), et monoklonalt muse-anti-humane integrin α

Vp

3-antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), eller et muse monoklonalt anti-humant integrin α

Vp

5-antistof (R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater Salg

CAR og integrin ekspression i prostatacancerceller og normale prostata epitelceller

flowcytometri data viste en høj grad af CAR-ekspression i DU145 celler, et moderat niveau i LNCaP og RWPE-1 celler og et meget lavt niveau i PC3-celler (figur 1). Integrin udtryk var også anderledes i disse cellelinjer, men CAR-negative PC3 cellelinie udtrykte høje niveauer af integrin α

Vp

5 (figur 1).

Celler blev dyrket og immunfarvet med CAR , integrin α

Vp

3, eller α

Vp

5 antistof og derefter udsat for flowcytometrisk analyse. Kolonner, procentdele af celler, der udtrykker CAR, avp3 og αvβ5. Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse for tre uafhængige forsøg.

RGD-fiber modificeret infektion kapacitet adenovira

Efter 24 timers infektion med adenovirus, anvendtes Western blot-analyse til påvisning af ekspression af adenovirale hexonprotein i de inficerede celler (fig 2A). Hexonprotein udtryk var ens i de CAR-positive cellelinjer DU145, LNCaP, og RWPE-1 efter enten AxCAlacZ eller AxCAZ3-F /RGD infektion. Men CAR-negative PC3 cellelinje (udtrykker integrin α

Vp

5) viste høje niveauer af hexonprotein udtryk efter AxCAZ3-F /RGD infektion sammenlignet med celler inficeret med AxCAlacZ (Fig 2A), hvilket indikerer, at RGD -Fiber modifikation forbedret adenovirus (AxCAZ3-F /RGD) infektion kapacitet i CAR-negative prostatacancerceller.

A, RGD-fiber modificeret infektion kapacitet adenovirus. Western blot analyse af hexonprotein ekspression i mock-infektion (1) eller infektion med AxCAlacZ (2) og AxCAZ3-F /RGD (3) i prostatacancerceller. B, Flow cytometri af hexonprotein ekspression i AxCAZ3-F /RGD adenovirus-inficerede celler eller AxCAlacZ adenovirus-inficerede celler. Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse for tre uafhængige forsøg. ** P 0,01 og N.S., ikke statistisk signifikant. C, Cytopatiske virkninger af RGD-fiber modificerede adenovirus på prostata kræftceller. Celler blev inficeret med AxCAlacZ (romber), AxCAZ3-F /RGD (firkanter), AxdAdB-3 (trekanter) og AxdAdB3-F /RGD (cirkler) ved en MOI på 30 for 0, 1, 3, 5 og 7 dage og derefter udsat for en celleviabilitetstest. Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse for tre uafhængige forsøg. ** P 0,01 og N.S., ikke statistisk signifikant.

Vi evaluerede også infektivitet ved fluorescens-aktiveret cellesortering til at detektere den adenovirale hexonprotein i inficerede celler (Fig 2B). CAR-positive DU145 viste LNCaP og RWPE-1 celler lignende udtryk for hexonprotein efter enten AxCAlacZ eller AxCAZ3-F /RGD infektion. I skarp modsætning hertil CAR-negative cellelinje PC3, udtrykker αvβ5 viste udtryk for hexonprotein i celler inficeret med AxCAZ3-F /RGD men ikke med AxCAlacZ, hvilket var i overensstemmelse med resultaterne af Western blot.

cytopatiske virkninger af adenovirus på prostatacancerceller

AxdAdB-3 var mere cytopatisk i CAR-positive prostatacancerceller (LNCaP eller DU145) end i CAR-negative celler (PC3). AxdAdB3-F /RGD forårsagede potent onkolyse både CAR-positive og CAR-negative prostatakræft-cellelinier (fig 2C), hvilket indikerer, at RGD-fiber modificeret adenovirus (AxdAdB3-F /RGD) forøget antitumoraktivitet i CAR-negative næsegrus kræftceller . Imidlertid blev AxdAdB3-F /RGD ikke cytopatisk i HPV-udødeliggjort normal prostata RWPE-1 epitelial cellelinje (figur 2B).

Antitumoraktivitet af AxdAdB3-F /RGD

in vivo

Vi først etablerede prostata kræft PC3 celle xenografter i nøgne mus og derefter direkte indsprøjtet AxdAdB3-F /RGD eller kontrol virus AxdAdB-3 i tumor læsioner gang om dagen i tre dage. Musene blev aflivet på dag 28 og AxdAdB3-F /RGD antitumoraktivitet. Tumorvækst kurve, og tumorvolumen blev målt (Fig 3). Tumorxenografter blev også analyseret for ekspression af viralt hexonprotein (figur 4). Vores data viser, at AxdAdB3-F /RGD signifikant inhiberede vækst af tumorxenografter

i we

vo ved 4 uger efter behandlingen sammenlignet med AxdAdB-3 (P 0,005, Fig 3).

Prostatacancer PC3-celler blev injiceret subkutant i nøgne mus. Efter tumorbyrde nåede ca. 6-7 mm i størrelse virus blev injiceret i tumoren læsion gang om dagen i tre dage og musene blev aflivet på dag 28. Tumorvolumen blev målt efter Dyrene blev behandlet med virus (n = 5 pr gruppe) . Data er præsenteret som middelværdi tumorvolumen ± standardafvigelse. ** P 0,005.

AxdAdB3-F /RGD behandling resulterede i mere omfattende tumor nekrose end AxdAdB-3 (HE farvning, original forstørrelse x 200 i toppanelet, x 400 i midterste panel). Immunhistokemisk farvning af AxdAdB3-F /RGD-behandlede tumorer opdaget adenovirale hexonprotein (nederste panel, original forstørrelse x 400).

Diskussion

Vores nuværende undersøgelse viser, at RGD fiber er i stand til at ændre antitumoraktivitet af E1A /E1B dobbelt mutant adenovirus AxdAdB3-F /RGD i prostata kræftceller

in vitro

i nøgen mus xenograft model. Vores nuværende data indikerer, at AxdAdB3-F /RGD besidder en potent terapeutisk aktivitet i prostatacancer. AxdAdB3-F /RGD forårsagede stærke cytopatiske virkninger i alle testede prostatakræft-cellelinier, uanset CAR ekspression. AxdAdB3-F /RGD inhiberede også væksten af ​​prostatacancer-xenotransplantater i nøgne mus. Men uden RGD modifikation, AxdAdB-3-virus viste kun antitumoraktivitet i CAR-positive prostata kræftceller. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere den samlede sikkerhed af disse adenovira før anvendelse i humane patienter.

Adenoviral infektion kræver binding af viruset til overfladen af ​​de målrettede celler ved binding af knoppen domæne af fiberen til CAR, og derefter efterfølgende internalisering ved interaktion af RGD motiver af penton base med integrinreceptorer α

Vp

3 og α

Vp

5. [14, 20] således CAR spiller en afgørende rolle ved mediering og fremme adenoviral infektion. Normalt cancerceller udtrykker meget lave niveauer af CAR-protein og modstå adenoviral infektion, og er derfor modstandsdygtige over for adenovirus-medieret viral behandling. [11] I den aktuelle undersøgelse, bekræftede vi, at AxdAdB-3-infektion var i stand til at reducere levedygtigheden af ​​prostatacancer DU145 og LNCaP cellelinjer, som udtrykker høje eller moderate niveauer af CAR, men havde begrænsede virkninger af PC3 celler, som udtrykker meget lave niveauer af CAR. Faktisk, prostatacancer cellelinjer og tumorvæv ofte har nedsat eller tab af CAR-ekspression. [12] For at øge infektivitet af onkolytiske adenovirus i CAR-negative prostatacancer, vi modificeret virus med RGD at frembringe en AxdAdB3-F /RGD virus, som signifikant forøget oncolytisk adenoviral aktivitet i prostatacancer.

AxdAdB3-F /RGD er en virus, der indeholder en RGD-peptid, som kan mediere ikke kun CAR-afhængig virus entry men også CAR-uafhængig og RGD-integrin (α

Vp

3 og α

Vp

5) -afhængig virus indrejse i målrettede celler. Kræftceller udtrykker bil eller integrin vil derfor være modtagelige for AxdAdB3-F /RGD infektion. Selv om tab af eller nedsat CAR udtryk forekommer hyppigt i prostatakræft, rigelige udtryk for integrin α

Vp

3 og α

Vp

5 bør lette virusinfektion. [21] Vores nuværende undersøgelse bekræftede denne hypotese og viste, at AxCAZ3-F /RGD forbedret infektion kapacitet i forhold til AxCAlacZ (uden RGD) i CAR-negative PC3 celler. Desuden AxdAdB-3 var mere cytopatisk i CAR-positive celler i forhold til CAR-negative celler; dog AxdAdB3-F /RGD forårsagede potente cytopatiske virkninger både i CAR-positive celler og CAR-negative celler. Også AxdAdB3-F /RGD inhiberede xenograft vækst i nøgen musemodel. Disse data antyder, at RGD fiber modificeret adenovirus forbedrer adenovirusinfektion kapacitet og onkolyse effekt gennem integrin (avp3 og αvβ5) -afhængig post. På grund af sin øgede infektion kapacitet, kunne AxdAdB3-F /RGD ved en lavere viral dosis potentielt undgå nogle uheldige bivirkninger og samtidig øge effektiviteten af ​​viral behandling.

Vores nuværende data viser, at niveauet af CAR og integrin α

Vp

3-ekspression er høj i DU145 og lav i PC3 celler, hvilket svarer til resultaterne i en tidligere undersøgelse af Adams

et

.

al

. [22]. Interessant, vores nuværende undersøgelse viste, at integrin α

Vp

5 udtryk var høj i DU145 og PC3 celler. Dette er i strid med Adams ‘undersøgelse [22], som viste, at integrin α

Vp

5 udtryk er høj i DU145, men lav i PC3 celler. Men i overensstemmelse med vores resultater, niveauer af integrin α

Vp

5 var højere end integrin α

Vp

3 i PC3 celler i Adams ‘rapport. [22]. Men mængden af ​​integrin α

Vp

5 varieret. En anden tidligere undersøgelse [23] viste også, at PC3 og LNCaP celler udtrykte integrin α

Vp

5 på samme niveau, hvilket er i overensstemmelse med vores aktuelle resultater. Således er yderligere undersøgelse er nødvendig for at kontrollere disse data og deres underliggende molekylære mekanismer.

Desuden er vores aktuelle data viser, at AxdAdB3-F /RGD har færre cytopatiske virkninger på HPV-udødeliggjort normal prostata epitelceller. Adams

et

.

al

., [22] rapporterede, at den oncolytiske adenovirale mutant AdΔΔ i prostatakræft modeller (AdΔΔ har en mutation af E1A i CR-2) elimineres binding til pRb, og sletning af de 19 KD E1B forbedret onkolytisk potens. de offentliggjorte undersøgelser har imidlertid vist, at enten E1A eller E1B enkelt mutant var i stand til at replikere i normale celler. [24,25] Vores tidligere undersøgelse viste, at E1A /E1B dobbelte mutant onkolytiske adenovirus, AxdAdB-3, ikke i væsentlig grad inducerer toksicitet sammenlignet til E1A eller E1B enkelt mutant adenovirus i normale cellelinjer afledt fra prostata. [10] Vores nuværende undersøgelse er i overensstemmelse med de tidligere undersøgelser, der viser, at E1A /E1B dobbelte mutant onkolytiske adenovirus var mindre toksisk i forhold til E1A eller E1B enkelte mutanter i normale celler, men havde en lignende onkolytisk effekt i kræftceller. [19, 26] for nylig, kliniske forsøg med onkolytiske adenovirus leverede intratumoralt, intraperitonealt, og intravenøst ​​til behandling af patienter med tilbagevendende eller fremskreden kemoterapi refraktære solide tumorer blev rapporteret at være sikker og potentielt effektivt. [27] således er disse undersøgelser opmuntrende og understøtter brugen af ​​AxdAdB3 /F-RGD som et terapeutisk middel til prostatacancer. Desuden prostatacancer er velegnet til onkolytisk adenoviral behandling på grund af nem levering af adenovirus i det intra-prostata, hvilket tillader høje titre af adenovirus til at inficere tumorceller uden spredning til andre steder. [9] Adenovirus replikering resulterer i frigivelse af afkom virus til at inficere tilstødende tumorceller, hvilket fører til amplifikation af input-virus. Igen, E1A /E1B dobbelte mutant onkolytiske adenovirus er i stand til at replikere i målrettede celler og lysere tumorceller, der har abnormiteter i p53 og /eller p16 /RB /E2F pathways. [19] Prostatacancer har ofte en lang række genetiske mutationer, herunder p53, pRb, og P16 veje, [28], og ville være en ideel organ site for onkolytisk adenovirus terapi.

vores nuværende undersøgelse giver proof-of-principle, og mere arbejde er nødvendigt, før vores resultater kan være oversat til klinisk anvendelse. Vores nuværende data viser, at E1A /E1B double-begrænset onkolytiske adenovirus med RGD-fiber modifikation forbedrer virusinfektion kapacitet og antitumoraktivitet i både CAR-positive og negative prostatacancerceller

in vitro

i nøgen mus xenotransplantater, mens besparende normale celler.