Immunoaffinitets- berigelse analyse af protein methylering

Protein methylering er en posttranslationel modifikation, der oftest opstår på arginin og lysinrester. Når methyltransferaser bliver slået ud i mus, kan det resultere i embryonale letalitet eller tidlig død, hvilket indikerer den vitale biologiske rolle denne gruppe af enzymer. Referatet af methylerede peptid nummer identificeret i et enkelt forsøg er 249 arginin methylering sites.

Her har vi udviklet meget specifikke antistoffer mod arginin og lysin methylering. Efter immunoaffinitets- berigelse og massespektrometri analyse identificerede vi over 1000 arginin methylering steder i humane cellelinie og mus væv og 160 lysin methylering steder i human cellelinie HCT116.

For det første, vi udviklede antistoffer mod denatureret lysin, ved hjælp af et peptid bibliotek, der havde en enkelt modificeret lysin i et peptidbibliotek indeholdende aminosyrer i omgivende positioner.

Dernæst vi trække ned den methylerede peptid og analyse dem med LC /MS /MS. Og så har vi klassificeret arginin methylering formular mønster mus hjerne og embryo.

Til sidst har vi mærket det totale protein med dimethylering in vitro. Brug denne kunstige prøve, vi identificeret mere end tusinde methyleret peptid imidlertid den normale prøve har færre end 100 lysin methylering, hvilket antyder, at denne modifikation er begrænset til en lille delmængde af proteiner.

Methylering af arginin og lysin proteinrester blevet kendt for i mange år, er udfordringen for området mangler værktøjer og metoder for at studere disse ændringer. Denne undersøgelse giver et kraftfuldt værktøj til at få indsigt i området af protein methylering.

MC4R er en G-protein koblet receptor, der binder? -melanocyte Stimulerende hormon (a-MSH). I murine modeller er blevet fundet MC4-receptorer at være involveret i spiseadfærd, regulering af stofskiftet, seksuel adfærd, og mandlig erektil funktion. Både i gnavere og mennesker, melanocortin-4-receptorer (MC4Rs) undertrykke appetitten og forebygge fedme. Aktivering af melanocortin-4-receptorer (MC4Rs) fastholder fodring og forhindrer fedme.

Vi slettet og re-udtrykte MC4Rs fra CRE-udtrykkende neuroner og observerede fænotype. Som de vigtigste MC4R-udtrykkende neuroner er glutamaterge, er det næsten en sikkerhed for, at de frigiver glutamat og excite deres nedstrømsmål neuroner.

Dernæst viser vi, at MC4Rs på glutamaterge neuroner er nødvendigt for at undgå hyperfagi og fedme. Derefter har vi genopbygge MC4Rs kun i SIM1 neuroner reddet? 60% af fedme og 100% af hyperfagi af MC4R-nul-mus. Dette resultat indikerer, at MC4Rs på SIM1 neuroner reguleret i fodring. Fordi transskription faktor SIM1 er nødvendig for PVH udvikling.

Til resumé, vi viser, at de MC4R udtrykkende neuroner regulerer fodring er SIM1 +, som ligger i PVH, glutamaterge og ikke GABAerge, og ikke udtrykker oxytocin, corticotrophin -releasing hormon og vasopressin. Vi identificerer downstream fremskrivninger fra disse glutamaterge neuroner til den laterale parabrachiale kerne, som kunne mægle appetit undertrykke virkninger.