PLoS ONE: Systembiologi Modeling afslører en mulig mekanisme af Tumor Cell Død efter Oncogene Inaktivering i EGFR Addicted Cancers

Abstrakt

På trods af mange beviser der støtter begrebet “onkogen afhængighed” og mange hypoteser rationalisere det, der er stadig mangel på detaljeret forståelse for den præcise molekylære mekanisme underliggende onkogen afhængighed. På denne konto, vi udviklet en matematisk model for epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) associeret signalering netværk, som involverer EGFR-driving proliferation /pro-overlevelse signalveje Ras /ekstracellulær-signal-reguleret kinase (ERK) og phosphoinositol-3-kinase ( PI3K) /AKT, og pro-apoptotiske signaleringsvej apoptose signal-regulerende kinase 1 (ASK1) /p38. I indstillingen af ​​vedvarende EGFR aktivering, simuleringen resultater viser en vedvarende høj grad af proliferation /pro-overlevelse effektorer phospho-ERK og phospho-AKT, og et basalt niveau af pro-apoptotisk effektor phospho-p38. Potentialet af p38-aktivering (apoptotisk potentiale) på grund af det forhøjede niveau af reaktive oxygenspecies (ROS) er i vid udstrækning undertrykkes af den negative krydstale mellem PI3K /AKT og ASK1 /p38 pathways. Ved akut EGFR inaktivering, den overlevelsessignaler henfald hurtigt, efterfulgt af en hurtig stigning i den apoptotiske signal på grund af frigivelsen af ​​apoptotiske potentiale. Samlet set vores systembiologi modellering sammen med eksperimentelle valideringer afslører, at hæmning af overlevelse signaler og samtidig frigivelse af apoptotisk potentiale i fællesskab bidrage til tumoren celledød efter hæmning af afhængige onkogen i EGFR afhængige kræftformer

Henvisning:. Zhou JP , Chen X, Feng S, Luo SD, Pan YL, Zhong L, et al. (2011) Systembiologi Modeling afslører en mulig mekanisme af Tumor Cell Død efter Oncogene Inaktivering i EGFR Addicted kræftformer. PLoS ONE 6 (12): e28930. doi: 10,1371 /journal.pone.0028930

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina

Modtaget: Juni 20, 2011; Accepteret: November 17, 2011; Udgivet: December 14, 2011

Copyright: © 2011 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (20872100, https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default124.htm) og Youth Foundation i provinsen Sichuan (08ZQ026-030, http: //www.qnjj .sc.cn /). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

begrebet “oncogen afhængighed” blev først rejst af Weinstein baseret på de ejendommelige fænomener, at spredning og overlevelse af visse kræftformer stærkt afhængige af kun én onkogen protein eller pathway, på trods af tilstedeværelsen af ​​multiple genmutationer og epigenetiske abnormaliteter [1] – [3]. Nu er en masse beviser har vist sig at understøtte dette koncept, herunder dem fra gensplejsede musemodeller [4], [5], mekanistiske studier i menneskelige kræftceller [6], [7], og især god klinisk terapeutiske effekt af en række antistoffer eller små molekylære lægemidler rettet mod specifikke proteiner i humane cancere rapporteret i de senere år [8] – [10]. I øjeblikket er blevet foreslået flere hypoteser til at forklare fænomenet onkogen afhængighed, herunder genetisk strømlining [11], [12], syntetisk dødelighed [13], onkogen hukommelsestab [14], og onkogen chok [15], [16]. Disse hypoteser giver forskellige forklaringer fra forskellige vinkler til fænomenet onkogen afhængighed. Alligevel er der stadig mangel på detaljeret forståelse for den præcise mekanisme ligger til grund for onkogen afhængighed. Især den molekylære basis for nogle væsentlige fænomener relateret til onkogen afhængighed fortsat uklart, for eksempel, det fænomen, at akut onkogen inaktivering fører til tumorcelledød i onkogenet afhængige kræftformer, samtidig skåne andre celler, der ikke på samme måde afhængig.

det er blevet foreslået, at abnormity af intracellulære kredsløb (signaltransduktion netværk) eller “ledningsdiagram” er den mest grundlæggende årsag, der redegør for fænomenet onkogen afhængighed [2], [17]. Kompleksiteten af ​​intracellulær kredsløb sammen med multi-genetiske mutationer i cancerceller hæmmer forståelsen af ​​molekylære grundlag fundament onkogen afhængighed [18], [19]. Situationen har nu ændret lidt på grund af de seneste fremskridt i systembiologi [20] – [22], især den beregningsmæssige systembiologi [23], [24]. Således er man i øjeblikket i en god position til at anvende sådanne teknologier til at afsløre mulige molekylære mekanismer, der ligger forskellige fænomener knyttet til onkogen afhængighed.

Som det første arbejde med at forstå onkogen afhængighed fra det synspunkt af systembiologi, i denne undersøgelse har vi udviklet en matematisk model for epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) associeret signalering netværk for at undersøge mulige molekylære mekanisme af tumorcelledød efter inhiberingen af ​​afhængige onkogen. Her valgte vi EGFR-associerede signalnet hovedsagelig på grund af følgende årsager: (1) EGFR er et af de vigtigste onkogener og impliceret i mange humane tumortyper, især lungecancere, hoved og hals tumorer [25], [ ,,,0],26]; (2) EGFR signalering netværket er blevet bredt undersøgt eksperimentelt og teoretisk [27] – [30], hvilket indebærer, at mange parametre er tilgængelige i litteraturen, der letter model udvikling. Denne model blev valideret først, og derefter bruges til at simulere den normale tilstand af kræftceller og netværk svar på akut EGFR hæmning.

Resultater

Etablering af den matematisk model af EGFR-associeret signalering netværk

Vi her præsentere en almindelig differentialligning (ODE) baseret matematisk model af EGFR-associeret signalering netværk, som involverer EGFR-kørsel proliferation /pro-overlevelse signalveje Ras /ekstracellulær-signal-reguleret kinase (ERK) og phosphoinositol -3 kinase (PI3K) /AKT, og pro-apoptotiske signaleringsvej apoptose signal-regulerende kinase 1 (ASK1) /p38. De dele af Ras /ERK og PI3K /AKT veje i denne model blev etableret baseret på den kendte Ras /ERK og PI3K /AKT-modeller, herunder f.eks Brightman [31], Birtwistle [30], Schoeberl [29], og Oda [32 ] modeller. Til forfatternes viden, men der er ingen matematisk model af p38 medieret pro-apoptotisk signalvej endnu rapporteret i litteraturen. Vi byggede derfor en model af p38-signalering og indarbejdet det i EGFR signalering netværk. Modellen består af 243 ligninger og interaktioner med 160 distinkte molekylære arter, karakteriseret ved 145 kinetiske parametre og 28 ikke-nul indledende molekylære koncentrationer. De fleste af de kinetiske parametre og indledende molekylære koncentrationer i denne model blev taget fra litteraturen eller er afledt af grundlæggende fysisk-kemiske mængder [29], [30], [33]. Andre blev estimeret ved montering modeloutput til kendte eksperimentelle data med brug af hybrid quasi ensemble modellering algoritme for nylig [34] foreslået af os. De vigtigste og parametre er præsenteret i tabel S1, og indledende molekylære koncentrationer i tabel S2 (se supplerende oplysninger). De vigtige signalveje og nøglekomponenter involveret i vores netværksmodel er vist i figur 1. En kort beskrivelse for dette EGFR-associeret netværk er givet som følger.

Faste linjer med pile indikerer aktiveringen af ​​proteiner eller lipider. Stiplede linjer repræsenterer direkte protein-protein og protein-lipid-interaktioner. Optrukne linjer med stumpe ender repræsenterer inhibering.

I den normale tilstand, er netværket signalering initieres ved binding af epidermal vækstfaktor (EGF) til EGFR, efterfulgt af dimerisering og efterfølgende gensidig trans-phosphorylering på flere tyrosinrester af EGFR; selvom EGFR familie har tre andre medlemmer, herunder ErbB2, ErbB3, ErbB4 og foruden EGFR (ErbB1), som kan danne andre lysdæmpere (enten homo- eller hetero-dimerer) [30], [35], blot EGFR og EGFR-EGFR homo -dimers betragtes i denne model for forenkling. Disse phospho-tyrosin rester fungere som docking sites, der giver receptorer at rekruttere adapter proteiner Shc og Grb2 [36], som derefter kan rekruttere den guanosin nukleotid udveksling faktor SOS. SOS fremmer udskiftning af BNP GTP i Ras og derved aktiverer Ras [37]. Den aktiverede Ras resulterer efterfølgende i aktiveringen af ​​protein kinase Raf [38]; eftersom den direkte aktivator af Raf-kinase ikke er kendt endnu, antager vi, at Raf phosphorylering forårsages direkte af en Ras-GTP-molekyle i denne model. Den aktiverede Raf endelig aktiverer mitogenaktiveret proteinkinase kinase1 /2 (MEK) og ERK i en kaskade måde [39]. Den aktiverede ERK kan phosphorylere opstrøms protein SOS, dermed forårsager dissociation af Grb2-SOS fra receptorkomplekset, som danner en negativ tilbagekoblingssløjfe [40]. Derudover kan Grb2 i cytomembrane også rekruttere Gab1, som forårsager phosphorylering af Gab1 og den deraf rekruttering af PI3K [41]. I cytomembrane, PI3K forvandler phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) til phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP3), som inducerer aktiveringen af ​​AKT gennem samarbejde med 3-phosphoinositid afhængig proteinkinase-1 (PDK1) [42 ]. I denne proces kan phosphatase og tensin homolog (PTEN) og proteinphosphatase 2A (PP2A) specifikt dephosphorylere PIP3 og AKT henholdsvis [43]. Phosphoryleret Raf, MEK og ERK kan dephosphoryleres ved deres specifikke phosphataser [30]

P38, der er tænkt som en vigtig pro-apoptotisk effektor kan aktiveres ved en række miljømæssige påvirkninger og inflammatoriske cytokiner [44]. – [46]. Blandt hvilke, af særlig betydning er stress på grund af reaktive oxygenspecies (ROS). For eksempel Dolado et al. rapporterede, at den onkogene H-Ras-induceret ROS spiller en central rolle ved inhibering af tumor initiering ved at aktivere p38 og dermed resulterer i apoptose i fibroblaster afledt fra musefostre [47]. Desuden talrige undersøgelser har vist, at stimulering af humane cancerceller med EGF, resulterer i en stigning i den intracellulære koncentration af ROS [48] – [50]. Jin og hans kolleger opdaget selv hastigheden af ​​ROS generation induceret af EGF stimulering i A431 [50]. Således er ROS er involveret i vores model som en vigtig opstrøms element af p38 signalvej. ROS udløser aktiveringen af ​​ASK1, som derefter inducerer phosphorylering af mitogenaktiveret proteinkinase kinase3 /6 (MKK) og p38 i en kaskade stil [51]. Specifikke fosfataser af ASK1, MKK og p38 er også inkluderet i denne model. Desuden er det blevet fastslået, at aktiveret AKT kan undertrykke aktivering af p38 via phosphorylering ASK1, som danner en negativ krydstale mellem PI3K /AKT og ASK1 /p38 signalveje. For eksempel, Zhang et al. rapporterede, at AKT kan phosphorylere ASK1 på sted Ser83 at inhibere hydrogenperoxid-induceret ASK1 /p38 signalering aktivering i endotelceller [52]. Yuan og hans kolleger viste sig også at AKT kan inhibere cisplatin-induceret p38-aktivering via phosphorylering af ASK1 [53]. Følgelig er crosstalk AKT-ASK1 mellem PI3K /AKT og ASK1 /p38 signalveje også involveret i vores model.

Modelvalidering

Den etablerede model blev valideret ved at beregne tidsforløb for flere aktiveringsnøgle arter, herunder Ras, ERK, AKT og p38 efter en kort stimulation EGF og sammenligne simulation resultater med andre offentliggjorte eksperimentelle eller simulering undersøgelser af EGFR-signalering. Figur 2 viser de simulerede tidsforløb mønstre af Ras, ERK, AKT og p38-aktivering eksponering til EGF med varierende koncentrationer over 60 minutter. Ved tilsætning af EGF ved t = 0, de samlede koncentrationer af Ras-GTP, phospho-ERK (p-ERK) og phospho-AKT (p-AKT) hurtigt stige til et maksimum inden for 5 minutter med deres toppe afhængig af koncentrationen EGF efterfulgt af rådnende til deres basale niveauer inden for 50 minutter. I mellemtiden observeres en forsinket stigning af phospho-p38 (p-p38), som er toppede efter 15 minutter,. Disse er i overensstemmelse med tidligere eksperimentelle resultater. For eksempel EGF stimulering af PC12-celler resulterer i en hurtig, forbigående aktivering af Ras og ERK [27]. Niveauet af Ras-GTP hurtigt når et maksimum inden for 2 minutters udsættelse for EGF, men falder inden for 10 minutter og vender gradvist tilbage til det basale niveau inden for 60 minutter. Tilsvarende ERK-aktivering er maksimal inden for 5 minutter, og henfalder til mindre end 50% af det maksimale niveau med 30 minutter, og til mindre end 25% inden for 60 minutter. De forbigående aktiveringer af ERK og p38 efter EGF-stimulering blev også observeret i retinale kapillære endotelceller [54]. Efter 5 minutters eksponering af retinale endotelceller til EGF, ERK når en maksimal grad af phosphorylering, der er 20 gange større end for dens kontrol. I de efterfølgende 2 timer, ERK-aktivering henfalder indtil den når en baseline. For p-p38, det øger et niveau næsten tredoblet i forhold til dens kontrol efter 15 minutter, efterfulgt af et fald til dens kontrol niveau.

Koncentration ændringer i (A) aktiv ERK (phospho-ERK), (B ) aktiv AKT (phospho-AKT), (C) aktive Ras (Ras-GTP) og (D) aktiv p38 (phospho-p38) efter forbigående stimulering af EGF i forskellige koncentrationer.

Simulering af vedvarende aktivering af EGFR

Vi derefter simulere vedvarende EGFR aktivering i EGFR afhængige kræftceller. Til dette formål blev receptor internalisering reaktioner fjernet fra modellen, og koncentrationen EGF blev sat til en fast værdi. Figur 3 viser de tidsforløb for ERK, AKT og p38 aktivering. Det er klart, sustained EGFR aktivering sidst resulterer i et stabilt højt niveau af p-ERK og p-AKT efter en hurtig stigning i begyndelsen. Imidlertid p38 aktivering stadig holder på sin basale niveau selv om en påviselig lille top af p-p38 indenfor de første 5 minutter. Samlet, sustained aktivering af EGFR fører til et endeligt resultat af fortsat høje p-ERK og p-AKT, men et lavt niveau af p-p38. Dette stemmer overens med eksperimentelle resultater i EGFR afhængige cancerceller, at ERK og AKT holder i et højt aktivering og p38 har i et lavt niveau af aktivering [16].

Koncentration ændringer i (A) aktive ERK (phospho-ERK), (B) aktiv AKT (phospho-AKT) og (C) aktive p38 (phospho-p38) ved vedvarende stimulering af EGFR på forskellige niveauer.

Simulering af netværket respons ved akut EGFR inaktivering i EGFR afhængige cancerceller

Vi har lige simuleret den normale tilstand af EGFR afhængige cancerceller, nemlig en indstilling af vedvarende EGFR aktivering. I dette afsnit skal vi simulere netværket respons på akut EGFR inaktivering, som efterligner situationen for at bruge de EGFR-hæmmere i EGFR afhængige kræftceller. I denne simulering blev den akutte EGFR inaktivering udføres gennem en forud tildelt begivenhed på et fast tidspunkt, nemlig EGFR-aktivitet blev indstillet til basale niveau. Ændringer i koncentrationen af ​​aktiveret ERK, AKT og p38 efter akut EGFR inhibering er vist i figur 4. Det er klart, den akutte EGFR inaktivering medfører umiddelbart fald i koncentrationen af ​​p-ERK og p-AKT, og en forsinket stigning af p- p38. Simuleringen godt gengivet de eksperimentelle fænomener, akut inaktivering af EGFR onkogene resulterer i hurtig formindskelse af celleproliferation /pro-overlevelse effektorer p-ERK og p-AKT, og efterfølgende indgreb af pro-apoptotiske effektor p-p38 i EGFR afhængige kræftceller [16], [55].

Profil af koncentration ændringer i (A) aktiv ERK (phospho-ERK), (B) aktiv AKT (phospho-AKT) og (C) aktive p38 (phospho -p38). Den virtuelle begivenhed af EGFR-hæmning blev udført til tiden 0 timer.

Følsomhedsanalyse afslører kritiske faktorer er ansvarlige for p38 aktivering

Følsomhedsanalyse har længe været brugt i systembiologi at undersøge, hvordan variation af værdien af ​​den simulerede produktionen af ​​en matematisk model kan fordeles til forskellige kilder til variation i indgangen på en model, som kan anvendes til at identificere kritiske proteiner, der dominerer produktionen af ​​et effektor-protein [29]. Her p-ERK, blev p-AKT og p-p38 tages som output variabler for følsomhedsanalysen. Figur 5 viser det normaliserede tid integreret følsomhed for arter med ikke-nul værdier i EGFR signalering netværket model. Naturligvis, de mest følsomme knudepunkter for ERK-aktivering er MEK og Raf foruden den incurious ERK og EGF; ERK og EGF er de trivielle løsninger siden ERK er den direkte forløber for p-ERK, og EGF er initiativtager til netværket respons (for enkelhed, vil disse incurious følsomme knudepunkter ignoreres senere). For AKT aktivering, de mest følsomme knudepunkter omfatter Grb2, PIP2, Gab1, PI3K, PDK1, SOS, og PTEN. Og dem, for aktivering af p38 omfatter hovedsagelig ASK1, MKK, RacGDP, PP2A, AKT, PDK1 og SOS.

Normaliserede tid-integrerede følsomheder af ERK, AKT og p38 phosphorylering (p-ERK, p-AKT, og p-p38) til hver nonzero arter i EGFR-associerede netværksmodel.

følsomhedsanalyse ovenstående afslører de kritiske regulatorer i netværket for overlevelse effektorer p-ERK og p-AKT, og pro-apoptotisk effektor p-p38. Vi observerede også, at de største positive og negative værdier af følsomhed alle svarer til output variable p-p38. For eksempel, AKT, der har den største negative værdi af følsomheden over for den pro-apoptotiske effektor p-p38 kan spille en vigtig rolle regulering negativ i celle apoptose. ASK1, MKK og RacGDP, som alle er de centrale elementer i ROS /ASK1 /MKK /p38 signalering kaskade, har de største positive værdier af følsomhed, hvilket indebærer en vigtig positiv rolle ROS associeret signalering i celle apoptose. Disse resultater kan også være relateret til følsomheden af ​​tumorceller til drab virkninger af målrettede lægemidler. For at teste denne hypotese, ændrede vi det oprindelige netværk ved at fjerne enten den krydstale AKT-ASK1 eller ROS, og derefter igen simuleret netværket responser i indstillingerne for vedvarende EGFR aktivering og akut EGFR inaktivering. Figur 6A viser simuleringen resultater, når du fjerner krydstale AKT-ASK1. Det er klart, høje niveauer af p-ERK og p-AKT i fastsættelsen af ​​vedvarende EGFR aktivering og en hurtigt fald på akut EGFR hæmning (se figur 6A) blev observeret, som er meget lig de modellering opnåede resultater på det oprindelige netværk. Men efter fjernelse af krydstale AKT-ASK1, p-p38 holder i et højt niveau i tilfælde af enten vedvarende EGFR aktivering eller akut EGFR hæmning, hvilket indebærer en stærkere apoptotisk kapacitet. Figur 6B viser modelresultaterne, når du fjerner ROS. Svarende til tilfældet ved fjernelse AKT-ASK1, monitorerede vi stadig høje niveauer af p-ERK og p-AKT i fastsættelsen af ​​vedvarende EGFR aktivering og en hurtigt fald ved akut EGFR inhibition. Imidlertid ROS fjernelse resulterede i et lavt niveau af p-p38 i tilfælde af enten vedvarende EGFR aktivering eller akut EGFR inaktivering. Disse data viser, at fjernelse af ROS fører til tab af apoptotiske kapacitet.

Den virtuelle tilfælde af EGFR inhibering blev udført ved tiden 0 timer. (A) Virkningerne af fjerne krydstale AKT-ASK1 af koncentrationen ændringer i p-ERK, p-AKT og p-P38. (B) Virkningerne af ROS fjernelse af koncentrationen ændringer i p-ERK, p-AKT og p-P38.

Kollektivt, simuleringen resultaterne her tyder på, at der er en stærkere apoptotisk potentiale eksisterende i den normale tilstand af cancerceller, som undertrykkes af den negative krydstale AKT-ASK1 mellem PI3K /AKT og ASK1 /p38 signalveje. Frigivelsen af ​​den apoptotiske potentiale på grund af det svindende væk af negativ krydstale AKT-ASK1 upon EGFR inaktivering kunne være en vigtig faktor forårsager celledød, foruden inhibering af proliferation /pro-overlevelse signalering. Især kunne det hurtig frigivelse af ophobet apoptotisk potentiale være en væsentlig grund, der fører til følsomheden af ​​tumorceller til drab virkninger af lægemidler, der er målrettet den afhængige onkogen.

Eksperimentelle beviser for eksistensen af ​​ROS og apoptotiske potentiale i EGFR-afhængige cancerceller

den ovenfor beskrevne model er noget kunstig, som ikke kan svare tæt sammen med den faktiske EGFR afhængige kræftceller. Derfor udførte vi også en række forsøg for at undersøge en række centrale spørgsmål i forbindelse med vores modellering. To ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinier HCC827 og NCI-H460 (H460) blev udvalgt til forsøgene; HCC827 er en typisk EGFR afhængige cancercellelinie, og H460 er ikke EGFR afhængige, hvilket er til sammenligning. Det første eksperiment blev udformet for at undersøge ROS-niveauer i de to NSCLC cellelinier. Den intracellulære ROS niveau blev vist ved 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) [56], en ROS responsiv molekylær probe, og visualiseret ved anvendelse af et omvendt fluorescensmikroskop. Som vist i figur 7, blev opdaget et meget højt niveau af ROS i EGFR-afhængige HCC827 celler, hvorimod ROS næppe kunne opfattes i H460 celler. Dette fund afspejler en kendsgerning, at HCC827 lider et stort ROS stress, eller med andre ord, HCC827 bærer en stærkere apoptotisk potentiale. Alligevel HCC827 stadig holder kraftig spredning evne, hvilket tyder på, at den apoptotiske potentiale er godt undertrykt.

ROS probe signaler samt DAPI nukleare lokalisering i HCC827 og H460 blev præsenteret alene eller flettes (Flet).

Efterfølgende western blot-analyse og flow-cytometri (FCM) assays blev anvendt til at undersøge, om aktiveringen af ​​p38 samt apoptose af cancerceller kan udløses gennem AKT inhibition. Vi behandlede HCC827 og H460 celler med 1 pM wortmannin; wortmannin er en inhibitor af PI3K /AKT signalering. Som vist i figur 8A, kan wortmannin behandling af HCC827 celler forårsage næsten fuldstændig inhibering af AKT og stor akkumulering af p-p38 inden for 4 timers behandling. For H460 celler, kan wortmannin behandling også forårsage næsten fuldstændig inhibering af AKT, men meget lille akkumulering af p-p38 uden at ændre det intracellulære ROS niveau (fig S1). Resultaterne af FCM assays (figur 8B) viser, at wortmannin behandling kan resultere i stigninger i apoptose satser både HCC827 og H460 celler. I sammenligning med H460, HCC827 celler udviste meget mere apoptose efter 10 pM wortmannin behandling. Disse eksperimenter viser, at inaktivering af overlevelse effektor p-AKT fører til hurtig frigivelse af akkumuleret apoptotisk potentiale i EGFR-afhængige cancerceller, hvilket kan være en vigtig årsag, der fører til følsomheden af ​​tumorceller over for lægemidler, der er målrettet den afhængige onkogen EGFR .

(A) Immunoblotting med angivne antistoffer at vise phosphorylering af AKT og p38 i HCC827 og H460 celler behandlet med 1 pM wortmannin (WM). (B) apoptose af HCC827 og H460-celler med eller uden 10 pM wortmannin (WM) behandling i 24 timer. De apoptose satser er givet som procenter.

Da vi har vist, at der findes apoptotiske potentiale på grund af ROS stress i EGFR-afhængige kræftceller, vi yderligere postulerer, at servitut af ROS stress kan desensitize kræft celler til målrettet behandling. For at teste denne hypotese, behandlede vi HCC827 celler med c-vitamin, en antioxidant, der kan anvendes til delvis afbøde ROS stress. Derefter FCM og Western blot blev udført for at teste celleapoptosen eksponering for EGFR-inhibitor gefitinib. Som vist i figur 9A, kan c-vitamin formindske apoptose af HCC827 celler behandlet med gefitinib sammenlignet med kontrollen, hvor der ikke c-vitamin blev anvendt. Figur 9B viser resultaterne af Western blot analyser, der viser, at afbødning af ROS faktisk reduceret p-p38 niveauet i HCC827 celler behandlet med gefitinib. Samtidig har vi også bemærket, at lindring af ROS faldt de p-ERK og p-AKT niveauer så godt. En mulig forklaring kunne være, at ROS stress kan fremme proliferation /overlevelse, foruden at inducere apoptose [57] – [59], dermed afbødning af ROS følge heraf fører til et fald af p-ERK og p-AKT. Vi anerkender, at det ikke fik refleksion fra vores modellering resultater siden vores matematiske model ignoreret signaleringen fra ROS til Erk /AKT, som ikke er kendt på nuværende tidspunkt. Desuden blev et MTT-assay udført for at teste levedygtigheden af ​​HCC827 celler. Resultatet viser, at C-vitamin kan mindske cytotoksicitet gefitinibs i HCC827 celler (Figur 9C). Disse resultater tyder på, at følsomheden af ​​HCC827 celler til EGFR inhibitor gefitinib er nedsat på grund af begrænsning af apoptotiske potentiale.

HCC827 celler blev behandlet med c-vitamin (vc), gefitinib (GEF), eller deres kombination (GEF + ve). (A) Flowcytometri detektere apoptose af HCC827 celler under hver behandling i 24 timer. De apoptose satser behandlinger gives som procenter. (B) immunoblotting med viste antistoffer til at vise phosphoryleringen af ​​ERK, AKT og p38 i HCC827 celler behandlet med angivne midler. 1 pM gefitinib, blev 1 uM c-vitamin eller deres kombination anvendes. (C) Cellen levedygtighed eksponering HCC827 celler til angivne agenter målt ved MTT. 1 nM gefitinib, blev 10 nM vitamin c eller deres kombination anvendes.

Diskussion

Begrebet “onkogen afhængighed” er nu blevet accepteret af flere og flere forskere gennem det seneste årti . Ikke desto mindre mekanisme, der ligger onkogenet afhængighed er langt fra forstået. I denne undersøgelse har vi udviklet en matematisk model af EGFR-associeret signalering netværk. Vi anerkender, at det etablerede netværk modellen ikke inkluderer alle de signalveje og komponenter, der regulerer overlevelse og apoptose af cancerceller; etablering af et komplet netværk model er upraktisk på nuværende tidspunkt. Fra et andet synspunkt, ignorere andre alternative signalveje kan give en heldig lykketræf, at den etablerede model flere lukker til EGFR afhængige tilstand.

Simuleringer med den validerede EGFR-associerede netværksmodel sammen med den eksperimentelle validering afsløre eksistensen af ​​apoptotisk potentiale. Den apoptotiske potentiale kunne induceres af forskellige spændinger, typisk fx ROS. Kræftceller viser ofte forhøjede niveauer af intracellulær ROS [60], [61]. Mange faktorer kan bidrage til ROS-generering [61]. Aktiveringen af ​​onkogen EGFR kan bringe på ROS-generering via den sekventielle aktivering af PI3K, Rac og NADPH oxidase [48]. Desuden kan hypoxi-reperfusion i tumormikromiljøet føre til ROS produktion, som igen kan starte en viskøs cyklus af mitochondriebeskadigelse og længere ROS-generering [62]. I normale celler kunne ROS afhjælpes ved at engagere glycolyse og nedregulering mitokondriefunktion [63]. Cancerceller har ofte mangel i ROS reduktion system på grund af genetiske ændringer, som hindrer clearing af ROS [61]. Ophobningen af ​​ROS normalt resulterer i apoptose gennem den sekventielle ROS /ASK1 /p38-aktivering [47], [64]. Ikke desto mindre er aktiveringen af ​​pro-apoptotisk effektor p38 inhiberet af negative krydstale AKT-ASK1 i cancerceller [52], [65]. Når afbødning af negative krydstale AKT-ASK1, gennem for eksempel inaktivering af AKT, den apoptotiske potentiale kan frigives, dermed inducerer celle apoptose [53].

Den hurtige frigivelse af ophobet apoptotisk potentiale efter onkogen hæmning er en vigtig årsag, der fører til følsomheden af ​​tumorceller til drab virkninger af lægemiddel, der er målrettet den afhængige onkogen, som er den vigtigste kendetegnende for onkogen afhængighed. Det betyder dog ikke, at den samlede apoptotiske resultat som reaktion på onkogen inaktivering er bidraget kun af apoptotiske potentiale. Det er blevet erkendt, at EGFR kan producere pro-apoptotisk resultat gennem aktivering nogle nedstrømseffektor veje, der er blevet knyttet til pro-apoptotiske resultater. For eksempel kan EGFR binde direkte til den såkaldte “død ligand” FAS /CD95 [66], derfor medfører apoptotisk resultat. De efterfølgende Ras kan være pro-apoptotiske via en interaktion med det effektor målet Nore1 [67].

Fund i denne undersøgelse kan også have kliniske implikationer i målrettede behandlinger mod kræft samt i anti-cancer lægemiddeludvikling. For eksempel kan udelukkende til brug for ERK eller AKT-inhibitor ikke bringe en god terapeutisk virkning, selv med patienter med EGFR-afhængige kræftformer. Faber et al. [68] har vist, at PI3K /AKT inhibition ikke fremmede væsentlig apoptose i EGFR afhængige cancere. Men blokade både PI3K /AKT og Ras /MEK samtidigt ført til apoptose til lignende niveauer som de EGFR-hæmmere. Endvidere kan anvendelse af midler, der nyder godt forøgelsen af ​​apoptotiske potentiale yderligere forøge følsomheden af ​​tumorceller til målrettede lægemidler. For eksempel er det blevet rapporteret, at ROS-genererende midler har selektivt drab virkninger i målrettede-terapi-resistent cancere [69], [70]. Omvendt kan midler, som kan medvirke til at afbøde apoptotisk potentiale formindske følsomheden af ​​tumorceller til EGFR inhibitorer [59], som bør undgås at anvende klinisk. Endelig er denne undersøgelse antyder også, at en god anti-cancer target bør have en karakter, dens funktionelle inhibering bør være til gavn frigivelsen af ​​akkumulerede apoptose potentiale i cancerceller, udover blokaden af ​​overlevelse.

Sammenfattende vores systembiologi modellering viser, at der er en stærkere apoptotisk potentiale eksisterende i EGFR-afhængige kræftformer, som i høj grad undertrykt af den negative krydstale mellem PI3K /AKT og ASK1 /p38 signalveje. Hæmning af overlevelse signaler og samtidig frigivelse af ophobet apoptotisk potentiale bidrager i fællesskab til tumoren celledød efter hæmning af afhængige onkogen i EGFR afhængige kræftformer. Samlet set er dette det første forsøg på at forstå “onkogen afhængighed” fra systembiologi synspunkt. Yderligere indsigt i de mekanismer, der ligger bag onkogen afhængighed fra systembiologi synspunkt er fortsat stærkt påkrævet. Eventuelle fremskridt på dette område i sidste ende vil gavne den målrettede kræftbehandling samt anti-cancer lægemiddeludvikling.

Materialer og metoder

Model Development

Netværket Modellen er udviklet ved hjælp af Matlab (MathWorks, MA, USA, https://www.mathworks.com). Oplysningerne for alle signalveje og topologi af netværket blev indsamlet fra forskellige offentliggjorte værker. Molekylære interaktioner i modellen blev beskrevet ved et sæt af koblede ODE’er, som blev afledt baseret på love Mass Action.