PLoS ONE: Smad2 /3-Reguleret ekspression af DLX2 er forbundet med stråling-induceret Epithelial-Mesenchymale Overgang og Radioresistance af A549 og MDA-MB-231 Menneskelig Cancer Cell Lines

Abstrakt

Kontrollen med radioresistance og metastatiske potentiale af overlevende cancerceller væsentlig for bedring udryddelse kræft ved radiotheraphy. Den distale-mindre homeobox2 (

DLX2

) genet koder for et homeobox transskription faktor involveret i morfogenese og dets deregulering blev fundet i humane solide tumorer og blodkræftsygdomme. Her undersøgte vi rolle DLX2 i association med strålingsinduceret epithelial til mesenkymale overgang (EMT) og stamcelle-lignende egenskaber og dets regulering af Smad2 /3 signaleringen i bestrålede A549 og MDA-MB-231 humane cancercellelinier. I bestrålet A549 og MDA-MB-231-celler, blev EMT induceret som demonstreret ved EMT markør ekspression, phosphorylering af Smad2 /3, og vandrende og invasiv evne. Også bestrålet A549 og MDA-MB-231-celler viste øget cancer stamceller (CSCS) markør. Interessant DLX2 blev overudtrykt ved bestråling. Derfor undersøgte vi rolle DLX2 i stråling-induceret EMT og radioresistance. Den overekspression af DLX2 alene induceret EMT, migration og invasion, og CSC markør udtryk. Den reducerede kolonidannende evne i bestrålede celler blev delvist gendannet ved DLX2 overekspression. På den anden side, udtømningen af ​​DLX2 hjælp si-RNA afskaffet strålingsinduceret EMT, CSC markør ekspression og phosphorylering af Smad2 /3 i bestrålede A549 og MDA-MB-231-celler. Også, udtømning af DLX2 øget stråling følsomhed i begge cellelinier. Endvidere knockdown af Smad2 /3, en central aktivator af TGF-β1 pathway, modvirkede strålingsinduceret DLX2 ekspression, hvilket indikerer, at strålingsinduceret DLX2 ekspression er afhængig af Smad2 /3 signaleringen. Disse resultater viste, at DLX2 spiller en afgørende rolle i radioresistance, strålingsinduceret EMT og CSC markør ekspression, og ekspressionen af ​​DLX2 reguleres af Smad2 /3 signaleringen i A549 og MDA-MB-231-cellelinjer.

Henvisning: Choi YJ, Baek GY, Park HR, Jo SK, Jung U (2016) Smad2 /3-Reguleret ekspression af DLX2 er forbundet med stråling-induceret epithelial-Mesenchymale Overgang og Radioresistance af A549 og MDA-MB-231 menneskelige kræftceller Lines. PLoS ONE 11 (1): e0147343. doi: 10,1371 /journal.pone.0147343

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: April 8, 2015; Accepteret: December 31, 2015; Udgivet: 22 Jan 2016

Copyright: © 2016 Choi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:.. Dette arbejde blev støttet af National Research Foundation Korea (NRF) tilskud finansieret af Sydkorea regering (MSIP) (nr 2013M2A2A7043663)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Strålebehandling er en af ​​de mest almindelige behandlinger for kræft, men en af ​​sine begrænsninger er, at nogle af overlevende kræft celler kan få radioresistance [1] og metastatisk [2] evne efter gentagen strålebehandling. Tilstedeværelsen af ​​epitelial til mesenkymale overgang (EMT) og cancer stamceller (CSCS) er blevet impliceret som en formodet årsag til tumor radioresistance hos patienter [2]. CSCS er en særskilt population af tumorceller med egenskaber af selv-fornyelse og regeneration, og er blevet identificeret i forskellige humane maligne tumorer [3, 4, 5]. CSCS viser typiske kendetegn for EMT [6, 7], og EMT igen forbundet med radioresistance [8, 9]. Af denne grund er forskning og udvikling af prædiktive biomarkører og målrettet terapeutisk strategi til CSC og EMT er særligt vigtige for prognose evaluering og radiosensitivitet forbedring strålebehandling [10, 11]. Repræsentative CSC markører omfatter Oct4, Sox2, Slug /sneglen [12, 13, 14], og de seneste rapporter har identificeret især CD44 som en CSC-relateret potentiel biomarkør for radiotheraphy i lunge- og brystkræft celler [15, 16, 17].

i EMT-processen af ​​kræftceller, er udtryk for de epitel gener såsom E-cadherin og Vinculin hæmmes, mens udtryk for de mesenkymale gener såsom N-cadherin og vimentin forstærkes [18, 19, 20 ]. Som et resultat af EMT, cellerne erhverve metastatiske egenskaber, herunder tab af kontaktinhibering, uorganiseret vækstkontrol og aggressiv invasionsevne [18, 21]. EMT reguleres af transkriptionsfaktorer, herunder Snail, Twist, og ZEB [7, 22, 23, 24]. Matrixmetalloproteinaser (MMP’er) er også vigtige mediatorer af EMT, som spaltes ECM, og som tillader migration og invasion af cancerceller til fjerne steder resulterer i tumormetastase [25]. Salg

I en normal tilstand, TGF-p handlinger som en tumorsuppressor, men er også kendt at forbedre EMT og støtte angiogenese i den sene fase af tumorigenese [26]. For nylig viste flere rapporter om, at IR fremmer EMT via Smad-afhængig TGF-β-signalering i cancercellelinier [6, 27, 28]. I TGF-β-vejen, TGF-p-receptorer genkender ligander og udløse phosphorylering af receptor-associeret Smad proteiner (Smad2 /3), som associerer med Smad4. Smad2 /3/4-komplekser ophobes i kernen og deltage i reguleringen af ​​målgener udtryk [29].

hvirveldyr distal-mindre homeobox2 (DLX2) virker som en homeo-box transskription faktor og har afgørende roller i fosterudvikling, kraniofaciale udvikling, vævshomeostase. Ifølge de seneste rapporter, blev deregulering af DLX2 fundet i humane solide tumorer og blodkræftsygdomme [30, 31, 32], og DLX2 er spekuleret at være involveret i tumor progression via reguleringen af ​​metabolisk stress-induceret nekrose [33]. Endvidere DLX2 selv er et målgen af ​​Smad-afhængig TGF-β-signalering og fungerer som en negativ feedback faktor TGF-β signalering [34]. Disse undersøgelser gjort os til at fokusere på den potentielle rolle DLX2 i erhvervelse af CSC og EMT egenskaber via Smad-afhængige TGF-β-signalering i IR-behandlede cancerceller.

I denne undersøgelse har vi undersøgt, hvilken rolle af DLX2 i forbindelse med stamceller celle-lignende egenskaber og epitelial til mesenkymale overgang (EMT) og dens regulering af Smad2 /3 signalering i bestrålede A549 humane lunge kræftceller og MDA-MB-231 humane bryst kræftceller. Vi rapporterer her, at IR inducerede ekspressionen af ​​DLX2 gennem aktivering af Smad2 /3, og DLX2 fremmes migration og invasion, og radioresistance i A549 og MDA-MB-231-cellelinjer.

Materialer og Metoder

Antistoffer Salg

Antistoffer mod DLX2, Smad2 /3, CD44, β-catenin, N-cadherin og E-cadherin blev indkøbt fra Thermo Scientific (Rockford, IL, USA). Anti-Snail, anti-vimentin og anti-Vinculin antistoffer blev indkøbt fra cellesignalering Technologies (Danvers, MA, USA). En anti-pSmad2 /3-antistof blev indkøbt fra Kerafast, Inc. (Boston, MA, USA). Anti-β-actin-antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).

Cellekultur og Bestråling

A549 (human ikke-småcellet lungekræft cellelinien) og MDA-MB-231 (human brystcancer-cellelinie) blev købt hos Korean cellelinje Bank (Seoul, Korea). Celler blev holdt i RPMI1640 tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone, UT, USA), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. Celler blev løsnet fra dyrkningsskålen ved anvendelse af 0,25% trypsin og fortyndet til 1,5 × 10

5 celler /ml. Celler blev bestrålet med

137Cs y-stråler ved hjælp af en Gammacell 40 exactor (MDS Nordion, Ontario, Canada) på KAERI og derefter re-belagte i petriskåle eller kamre.

Konstruktion af DLX2 overekspression vektor og transfektion

Et indstik af menneskelig DLX2 blev amplificeret fra pCMV-sports6 /DLX2 (Korea human Gene Bank, Seoul, Korea) ved PCR ved hjælp af følgende primere:

EcoRI

(forward): 5 ‘-CGGAATTC ATGACTGGAGTCTTTGAC-3’ og

Xho

I (omvendt): 5′-CTCTGAGT TTAGAAAATCGTCCCCG-3 ‘. DLX2 inserter blev klonet i vektoren pcDNA3-myc, som muliggør ekspression af c-myc-tagget protein i pattedyrceller. pcDNA3-myc /DLX2 eller pcDNA3-myc blev derefter leveret til celler (4 ug /2,5 × 10

5-celler) under anvendelse HilyMax (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, ML, USA) transfektionsreagens i henhold til producentens anvisninger. Efter inkubation i 24 timer blev cellerne løsrevet og bestrålet.

Små-interfererende RNA (siRNA) transfektion

Si-RNA’er målretning DLX2 og Smad2 /3 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, CA, USA). Til transfektion blev celler udpladet og dyrket til 70-90% konfluens. Target si-RNA eller negativ kontrol si-Ct blev derefter leveret til celler (si-DLX2: 50 um /2,5 × 10

5 celler; si-Smad2 /3: 100 pM /2,5 × 10

5-celler) hjælp HilyMax transfektion reagens i henhold til producentens anvisninger. Efter inkubation i 24 timer blev cellerne løsrevet og bestrålet.

RNA-ekstraktionsmetoder og kvantitativ real-time PCR

Efter 24 timer bestråling, total RNA ekstrakter (1 × 10

6 celler ) blev isoleret ved Trizol Reagent (Ambion, Carlsbad, CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. Revers transkription blev udført til cDNA-syntese under anvendelse TOPscript RT DryMIX indeholdende revers transkriptase, RT buffer, dNTP-blanding, Oligo dT (Enzynomics, Seoul, Korea). Kvantitativ realtids-PCR blev udført ved en StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, USA) med SYBR Green reagens (Enzynomics, Seoul, Korea). Primere blev konstrueret under anvendelse af primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), og sekvenserne er vist i tabel 1. Samlet reaktionsvolumen på PCR-blandingen var 20 pi, og reaktionen betingelserne var 15 min af indledende denaturering ved 95 ° C og 40 cykler af 10 sekunder ved 95 ° C, 15 sekunder ved 60 ° C og 20 sekunder ved 72 ° C. Den sammenlignende C

t metode blev anvendt og relativ mRNA-ekspression blev beregnet baseret på normalisering til p-actin. Alle eksperimenter blev gentaget i tre gange uafhængigt af hinanden.

klongenicitetsassayet

løsnede celler blev udsat for forskellige doser af bestråling og inkuberet i 7 dage (A549) og 10 dage (MDA-MB -231) ved 37 ° C. Mediet af alle kulturer blev fornyet hver 3. dag. Kolonierne blev fikseret med 60% methanol og farvet med 0,5% krystalviolet. Kolonier indeholdende 50 celler eller mere blev talt som klonogene celler. De rapporterede overlevelse fraktion værdier er middelværdien af ​​seks gentagelser fra tre uafhængige forsøg.

cellemigrationsassay

For at måle deres migration, bestrålet A549 og MDA-MB-231-celler blev podet i en Transwell (Corning Incorporated, NY, USA) ved en tæthed på 2,5 x 10

4 celler /brønd i 200 pi serumfrit medium og inkuberet i 7 timer (A549) eller 3 timer (MDA-MB-231) ved 37 ° C. Efter inkubering blev mediet fjernet. Celler blev fikseret gennem inkubation med 100% methanol og farvet med 0,5% krystalviolet i 15 minutter. Membranen blev skåret væk fra hvert kammer og migrerede celler på den nedre overflade af filteret blev talt pr filter i tilfældig mikroskopisk indgivet på en 200 ganges forstørrelse (Leica, Heidelberg, Tyskland). De rapporterede værdier er middelværdien af ​​tre uafhængige forsøg.

Cell invasion assay

Evnen af ​​bestrålet A549 og MDA-MB-231-celler at passere gennem Matrigelcoatede filtre blev målt i et Boyden kammer invasion assay. Matrigel blev påført toppen polycarbonat filter (porestørrelse, 8 um). Celleinvasion assays blev udført ved anvendelse af en matrigel invasion assay kit (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev cellerne podet i det øvre kammer med en tæthed på 2,5-5 x 10

4 celler /brønd i 500 pi serumfrit medium og inkuberet i 48 timer (A549), 24 timer (MDA-MB-231 ) ved 37 ° C. Celler, der invaderede den nedre overflade af hver membran blev fikseret med 100% methanol og farvet med 0,5% krystalviolet i 15 minutter. Membranen blev skåret væk fra hvert kammer og invaderede celler på den nedre overflade af filteret blev talt pr filter i tilfældig mikroskopisk indgivet på en 100 ganges forstørrelse (Leica, Heidelberg, Tyskland). De rapporterede værdier er middelværdien af ​​tre uafhængige forsøg.

Western blot-analyse

Efter 24 timer bestråling, totale cellelysater (2 × 10

6 celler) blev fremstillet under anvendelse RIPA-lysepuffer (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) indeholdende 10 mM phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF), 10 mM natriumfluorid (NaF), 1 mM natriumorthovanadat (Na

3VO

4) og en komplet proteaseinhibitorcocktail (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) og proteinindholdet blev målt ved anvendelse af BCA-protein assayreagens (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), med bovint serumalbumin som standard. Lige store mængder protein blev opløst ved 10% SDS-PAGE og overført til en polyvinylidendifluoridmembran (Amersham Hybond, Freiburg, Tyskland). Membranen blev derefter vasket med Tris-bufret saltvand (10 mM Tris og 150 mM NaCl) indeholdende 0,1% Tween 20 (TBST), og blokeret med TBST indeholdende 5% fedtfri tørmælk pulver. Membranen blev inkuberet natten over med primært antistof og blottet blev eksponeret for peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof og udviklet ved hjælp af ECL Western blot-påvisningsreagenser (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA).

Immunofluorescens (IF) farvning

for at analysere den intracellulære lokalisering af F-actin og markørproteiner, A549 og MDA-MB-231 celler frø i Lab-Tek kammer slide 8 godt objektglas (Nunc, NY, USA) og transfektion med si -Ct eller si-DLX2 i 24 timer og derefter inkubation i 24 timer efter IR. Celler fikseret i 4% formaldehyd blev farvet gennem inkubation med primært antistof (kanin polyklonalt anti-N-cadherin /vimentin /E-cadherin /Vinculin antistof, fortyndet 1: 100) til natten over ved 4 ° C. De blev derefter skyllet med PBS, inkuberet med blokerende buffer, og behandles med en Alexa 546-konjugeret anti-kanin-antistof (Molecular Probes, CA, USA) i 3 timer ved stuetemperatur. Endelig blev intracellulær F-actin farvet under anvendelse Alexa-phalloidin-488 (fortyndet 1: 300, Molecular Probes, CA, USA) i 1 time. Den cellekernen blev farvet med TO-PRO-3 (Molecular Probes, Eugene, USA). Farvede celler blev monteret og filmede med en laser konfokalt (Leica, Heidelberg, Tyskland).

Bestemmelse af TGF-β1 i cellekultursupernatanter

A549 og MDA-MB-231 (5 × 10

5 celler /brønd) celler blev udsat for IR hos 8Gy, 4Gy og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Niveauet af TGF-β1 protein i kultursupernatanterne blev målt under anvendelse af en TGF-β1 ELISA-kit (BD Biosciences, San Diego, USA) ifølge producentens anvisninger. Absorbansen ved 450 nm blev målt under anvendelse af en mikropladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). TGF-β1 proteinniveauer blev bestemt ud fra tre forskellige eksperimenter og er udtrykt som pg /ml.

Statistisk analyse

Alle eksperimenter blev udført tre gange. Statistisk signifikante forskelle blev identificeret under anvendelse af Students t-test. Statistisk sandsynlighed for P 0,05 blev betragtet som signifikant. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± standardfejl. af de tre eksperimenter, hver udført i tre eksemplarer.

Resultater

Ioniserende stråling inducerer EMT og øger CD44 og DLX2 udtryk

Vi først analyseret stråling følsomhed menneskelig A549 lungekræft og MDA-MB-231 brystadenokarcinomceller ved klongenicitetsassayet. I dette assay blev celleoverlevelse dosisafhængig faldt med IR (0, 2, 4, 6, 8Gy) i begge cellelinier, men MDA-MB-231-celler var mere følsomme over for IR end A549-celler (fig 1A). De morfologiske ændringer af cellerne efter eksponering for IR blev kontrolleret på A549-celler bestrålet ved 8Gy og MDA-MB-231 celler ved 4Gy. Den bestrålede A549 og MDA-MB-231cells viste spindel-formede og langstrakte morfologier, som er typiske for EMT morfologiske fænotyper sammenlignet med kontrolcellerne (figur 1b). Salg

(A) Fritstående-celler (1 × 10

5cells /ml) blev udsat for forskellige doser af bestråling og inkuberet i 7 dage (A549) og 10 dage (MDA-MB-231) ved 37 ° C. Kolonier indeholdende 50 celler eller mere blev talt som klonogene celler. Den overlevende fraktion blev beregnet ved at dividere udpladningseffektiviteten af ​​behandlede prøve med udpladningseffektiviteten af ​​kontrol. Udpladningseffektivitet blev beregnet ved at dividere antallet af kolonier med antallet af celler udpladet. De rapporterede værdier er middelværdien af ​​seks replikater fra tre uafhængige forsøg. (B) IR inducerer morfologisk ændring i A549 og MDA-MB-231-celler efter 24 timers eksponering (A549-8Gy, MDA-MB-231-4Gy). Forstørrelsen af ​​billedet er × 100. Ct, kontrollere celle; IR, bestrålede celler.

Vi undersøgte næste dosis-og tidsafhængig ændringer i CSC- og EMT-relateret markør udtryk. I overensstemmelse med de tidligere undersøgelser, IR øgede ekspression af TGF-β signalering faktor pSmad2 /3, en CSC markør (CD44), EMT positive markører (N-cadherin, vimentin) og transkriptionsfaktorer der regulerer EMT (Snail, β-catenin ) og fald i ekspressionen af ​​EMT negative markører (E-cadherin, Vinculin) hængigt på IR-dosis eller tid i begge cellelinjer (fig 2A og 2B). Interessant nok blev ekspression af DLX2 også øget ved IR i begge cellelinier. Dosis-respons-eksperimenter viste, at DLX2 induktion blev observeret ved 8Gy i A549 og ved 4Gy eller højere i MDA-MB-231 (Fig 2A og S1 Fig), og tidsforløb viste, at DLX2 proteinniveauer dramatisk blev forøget ved 24 timer efter bestråling i begge cellelinier (figur 2B og S2 fig). Også IR udløst opregulering af mRNA-niveauer af stemness markører (OCT4, Sox2, LIF), transkriptionsfaktorer (Twist, snail) og metastase markører (MMP2, MMP7) i begge cellelinier ved 24 timer efter bestråling med en enkelt dosis af 8Gy for A549-celler eller 4Gy for MDA-MB-231-celler (fig 2C og 2D).

(A) A549 og MDA-MB-231 celler blev udsat for IR hos 0-8Gy og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Lysater blev underkastet western blot-analyse med de mærkede antistoffer. To uafhængige forsøg opnåede lignende resultater. (B) A549 og MDA-MB-231-celler blev høstet på 0/3/6/24 timer efter 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231). Lysater blev underkastet western blot-analyse med de mærkede antistoffer. To uafhængige forsøg opnåede lignende resultater. (C), (D) A549 og MDA-MB-231 celler blev udsat for IR hos 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne isoleret ved Trizol og underkastet real time PCR-analyse med mærkede primere. Alle resultater blev opnået fra tre uafhængige eksperimenter (*** P 0.001, ** P 0,01, * P 0,05 versus CT). Ct, kontrollere celle; IR, bestrålede celler.

Overekspression af DLX2 forbedrer EMT og radioresistance

For at undersøge om DLX2 kan opregulere stråling modstand og metastatisk potentiale, A549 og MDA-MB-231 celler blev forbigående transficeret med pcDNA3-myc vektor, der udtrykker DLX2 eller pcDNA3-myc styrevektor, og vi undersøgte ekspressionen af ​​CSC og EMT markører ved western blot-analyse. Overekspression af DLX2 forøget ekspression af et CSC markør (CD44) og EMT positive markører (N-cadherin, vimentin) og faldt ekspressionen af ​​EMT negative markører (E-cadherin, Vinculin) i begge cellelinier. Bestråling inducerede lignende ændringer af disse markører som DLX2 overekspression. Imidlertid phosphorylering af Smad2 /3 blev faldet lidt (A549) eller ikke ændret (MDA-MB-231) ved overudtrykt DLX2 men steg ved bestråling i begge cellelinier. Overekspression af DLX2 forøget ekspression af Snail i A549, men ikke i MDA-MB-231-celler. Ekspressionen af ​​β-catenin blev ikke ændret ved DLX2 overekspression i begge cellelinier (figur 3A).

(A) Celler blev transficeret med 4 ug pcDNA-myc /DLX2 eller pcDNA-myc og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efter Cellefrigørelse blev cellerne eksponeret for IR hos 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne lyseret, og lysaterne blev underkastet western blot-analyse. To uafhængige forsøg opnåede lignende resultater. (B) Celler blev transficeret med 4 ug pcDNA-myc /DLX2 eller pcDNA-myc og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efter Cellefrigørelse blev cellerne eksponeret for IR hos 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkuberet ved 37 ° C i 6 timer (A549), 3 timer (MDA-MB-231) i Transwell ( migration assay). Fotografierne er repræsentative områder af migrerede celler på membranen. Grafen viser gennemsnittet af migreret celletal fra tre uafhængige eksperimenter ± SE (*** P 0,001 vs. vektor kontrolceller). (C) Celler blev transficeret med 4 ug pcDNA-myc /DLX2 eller pcDNA-myc og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efter Cellefrigørelse blev cellerne eksponeret for IR hos 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkuberet ved 37 ° C i 48 timer (A549), 24 timer (MDA-MB-231) i matrigel ( invasion assay). Fotografierne er repræsentative områder af invaderede celler på membranen. Grafen viser gennemsnit af invaderede celle nummer fra tre uafhængige forsøg ± SE (*** P 0,001 vs. vektor kontrol celler)

For at undersøge metastatiske effekt af DLX2 og IR i A549. og MDA-MB-231-celler, migration og invasion assays blev udført. DLX2-overudtrykt A549 og MDA-MB-231-celler udviste forøget migration evne ved 3 og 4 folder, sammenlignet med vektoren kontrol (Fig 3B). Også eksponeringen for IR (8Gy for A549, 4Gy for MDA-MB-231) steg migrere celle numre med 3,2 folder i begge cellelinier (figur 3B). Disse resultater viste, at DLX2 overekspression og IR væsentligt forbedret cellemotiliteten af ​​A549 og MDA-MB-231-celler. For at undersøge om celleinvasion evne blev ligeledes forbedret ved IR eller DLX2 overekspression, A549 og MDA-MB-231-celler blev påført invasion kamre og antal adhæsive celler blev talt. DLX2-overudtrykt A549 og MDA-MB-231-celler udviste forøget invasiv evne ved 3 og 5.3 folds, (fig 3C). Derudover eksponering for IR øgede invaderende celle antal A549 og MDA-MB-231 celler med 2,5 og 3,6 folder henholdsvis (figur 3C). Disse resultater viser, at overekspression af DLX2 eller IR væsentligt forbedret den vandrende og invasive evne samt udtrykket ændringer i CSC og EMT-relaterede gener i A549 og MDA-MB-231 celler.

Vi afgøres næste hvorvidt DLX2 ville give øget kræftcelle overlevelse efter bestråling. DLX2-overekspression A549 og MDA-MB-231-celler blev bestrålet ved 8Gy og 4Gy henholdsvis og derefter klonogenisk assay blev udført. Den overlevende fraktion af celler transficeret med kontrolvektor faldt efter bestråling sammenlignet med ikke-bestrålede celler. Imidlertid viste DLX2-overudtrykkende celler signifikant højere overlevelsesrate sammenlignet med vektor-transficerede celler efter bestråling (fig 4A og 4B). Hos ikke-bestrålede celler blev kolonidannelse ikke påvirket af DLX2-overekspression (fig 4A og 4B). Disse resultater indikerer, at DLX2-overekspression i det mindste delvist bidrager til radioresistance i A549 og MDA-MB-231-celler.

Celler blev transficeret med 4 ug pcDNA-myc /DLX2 eller pcDNA-myc og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efter Cellefrigørelse blev cellerne eksponeret for IR hos 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkuberet ved 37 ° C i 7 dage (A549), 10 dage (MDA-MB-231) og celle clonogenicity målt ved klongenicitetsassayet i A549 (A) og MDA-MB-231 (B). Fotografierne er repræsentative plade af overlevelse celler. Grafen viser gennemsnittet af tre uafhængige forsøg ± SE (*** P 0,001 vs. IR udsatte celler).

Silencing af DLX2 hæmmer IR-induceret EMT og radioresistance

Dernæst vi undersøgt, om DLX2 lyddæmpning ville undertrykke metastatisk potentiale og radioresistance tillagt ved IR. A549 og MDA-MB-231cells blev transient transficeret med 50 pM siRNA af DLX2 (si-DLX2) eller si-RNA-kontrol (si-Ct) i 24 timer før bestråling (8Gy for A549, 4Gy for MDA-MB-231) . Derefter analyseret vi ekspressionen af ​​CSC og EMT beslægtede gener, trækkende og invaderende evner, og kolonidannende evne. Silencing af DLX2 af siRNA forhindret EMT som demonstreret ved reducerede protein niveauer af EMT positive markører (N-cadherin, Vimentin) (Fig 5A, S3 Fig og S4 Fig) og øget niveau af EMT negative markører (E-cadherin, Vinculin) i bestrålede A549 og MDA-MB-231-celler (fig 5A, S5 fig og S6 fig). Inhibering af DLX2 forhindrede også induktion af transkriptionsfaktorer kritiske for EMT (Sneglen og β-catenin), og en CSC markør (CD44) i bestrålede A549 og MDA-MB-231-celler. Interessant, aktivering af TGF-β signalering faktor, Smad2 /3, blev ikke påvirket af si-DLX2 i bestrålede celler (Fig 5A).

(A) Celler blev transficeret med 50 pM si-DLX2 eller si- Ct og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer, blev cellerne eksponeret for IR hos 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne lyseret, og lysaterne blev underkastet western blot-analyse. To uafhængige forsøg opnåede lignende resultater. (B) Celler blev transficeret med 50 pM si-DLX2 eller si-Ct og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efter Cellefrigørelse blev cellerne eksponeret for IR hos 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkuberet ved 37 ° C i 6 timer (A549), 3 timer (MDA-MB-231) i Transwell ( migration assay). Fotografierne er repræsentative områder af migrerede celler på membranen. Grafen viser gennemsnittet af migreret celletal fra tre uafhængige eksperimenter ± SE (*** P 0,001). (C) Celler blev transficeret med 50 pM si-DLX2 eller si-Ct og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efter Cellefrigørelse blev cellerne eksponeret for IR hos 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkuberet ved 37 ° C i 48 timer (A549), 24 timer (MDA-MB-231) i matrigel ( invasion assay). Fotografierne er repræsentative områder af invaderede celler på membranen. Grafen viser gennemsnit af invaderede celle nummer fra tre uafhængige forsøg ± SE (*** P 0,001).

For at undersøge anti-metastatisk effekt af si-DLX2 i bestrålede celler, migration og invasion assays blev udført. DLX2-inaktivering i MDA-MB-231-celler let reduceret migration evne sammenlign Si-Ct-celler. Også i bestrålede A549 og MDA-MB-231-celler, transfektion af si-DLX2 faldt de vandrende celleantal med 1,7 folder i forhold til si-Ct transfektion (Fig 5B). Disse resultater viser, at silencing af DLX2 af siRNA signifikant inhiberede cellemotilitet af A549 og MDA-MB-231-celler. For at undersøge om celleinvasion evne blev tilsvarende reduceret med DLX2 nedregulering blev bestrålede celler påført på invasion kamre, og antallet af klæbende celler blev talt. Hos ikke-bestrålede celler, DLX2-lyddæmpning hæmmede invasiv evne A549 celler med 1,4 folder, men blev ikke observeret nogen signifikant ændring i MDA-MB-231 celler. I bestrålet A549 og MDA-MB-231-celler, transfektion af si-DLX2 faldt invaderende celleantal af A549 og MDA-MB-231-celler med 2,3 og 2,2 folds, (fig 5C). Disse resultater viste, at nedregulering af DLX2 i bestrålede A549 og MDA-MB-231-celler signifikant hæmmet ekspressionen af ​​gener associeret med CSC og EMT, og vandrende og invasiv evne, som blev induceret ved IR.

Vi analyserede derefter, om DLX2-nedregulering påvirker cancer celleoverlevelse efter bestråling. A549 og MDA-MB-231-celler transficeret med si-DLX2 eller si-Ct blev bestrålet ved 4Gy og 2Gy henholdsvis og derefter kolonidannelse blev undersøgt. Hos ikke-bestrålede celler, DLX2 lyddæmpning resulterede i et mindre fald på overlevende fraktion i begge cellelinier. I bestrålede celler, lyddæmpning DLX2 blyholdig til en yderligere reduktion i celle overlevelse betydeligt omfang (1,5 gange formindskelse for A549 og 1,6 gange formindskelse for MDA-MB-231) (Fig 6A og 6B). Disse resultater viste, at silencing af DLX2 undertrykt IR-induceret EMT potentiale og forbedret stråling følsomhed. Salg

Celler blev transficeret med 50 pM si-DLX2 eller si-Ct og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efter Cellefrigørelse blev cellerne eksponeret for IR hos 4Gy (A549) eller 2Gy (MDA-MB-231) og inkuberet ved 37 ° C i 7 dage (A549), 10 dage (MDA-MB-231) og celle clonogenicity målt ved klongenicitetsassayet i A549 (A) og MDA-MB-231 (B). Fotografierne er repræsentative plade af overlevelse celler. Grafen viser gennemsnittet af tre uafhængige forsøg ± SE (*** P 0,001).

IR-induceret DLX2 udtryk er reguleret af Smad2 /3

IR fremmer EMT via Smad-afhængig TGF-β-signalering i cancercellelinier [6, 27, 28], og DLX2 er et målgen af ​​Smad-afhængig TGF-β-signalering og negativ feedback faktor [34]. Derfor undersøgte vi sammenslutning af TGF-β signalering med IR-induceret DLX2 udtryk. Bestråling af A549-celler (8Gy) og MDA-MB-231cells (4Gy) øget mængden af ​​TGF-β1 udskilt i dyrkningsmediet (fig 7A). Også IR fremmet phosphorylering af TGF-β signalering faktor Smad2 /3 (fig 2A, 2B, 3A, 5A og 7C, S1 Fig og S2 Fig). Imidlertid overekspression af DLX2 snarere faldet lidt phosphorylering af Smad2 /3 (fig 3A). Phosphorylering af Smad2 /3 blev hverken af ​​si-DLX2 i bestrålede A549 og MDA-MB-231-celler (Fig 5A). Derfor vi næste undersøgt, om induktionen af ​​DLX2 ved IR er reguleret af Smad2 /3 signaleringen. Smad2 /3 silencing af siRNA ophævet IR-induceret DLX2 mRNA-ekspression (fig 7B) og DLX2 proteinekspression (fig 7C og 7D). Disse resultater viser, at IR-induceret DLX2 ekspression er afhængig af Smad2 /3 signaleringen.

(A) Niveauerne af immunoreaktiv TGF-β1 blev kvantificeret fra cellekulturmediet ved ELISA som beskrevet i Materialer og metoder (*** P 0,001, ** P 0,01, versus Ct). Ct, kontrollere celle; IR, bestrålede celler. (B) Celler blev transficeret med 100 uM si-Smad2 /3 eller si-Ct, inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Derefter blev cellerne eksponeret for IR hos 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Totalt RNA blev isoleret fra cellerne og underkastet real time PCR-analyse. Grafen repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg ± SE (*** P 0,001). (C) Celler blev transficeret med 100 uM si-Smad2 /3 eller si-Ct og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Derefter blev cellerne eksponeret for IR hos 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efterfølgende blev cellelysaterne underkastet western blot-analyse. Tre uafhængige forsøg opnåede lignende resultater. (D) Protein-niveauer blev kvantificeret ved densitometri. Data er repræsenteret som relative værdier til dem af si-Ct efter normalisering med β-actin (*** P 0.001, ** P 0,01, * P 0,05 versus si-Ct)

diskussion

strålebehandling er et afgørende element i kræftbehandlingen, men nogle af overlevende kræftceller får radioresistance [1] og metastatisk evne [2] på gentagne strålebehandling.