PLoS ONE: α2,3-sialyltransferase ST3Gal III modulerer kræft i bugspytkirtlen Cell motilitet og vedhæftning in vitro og øger dens metastatiske potentiale I Vivo

Abstrakt

Baggrund

Cell overflade sialyleringen fremstår som en vigtigt træk ved cancercelle metastase. Sialyltransferase ekspression er blevet rapporteret at blive ændret i tumorer og kan være årsag til dannelse af sialylerede tumorantigener. Vi har fokuseret på påvirkningen af ​​alfa-2,3-sialyltransferase ST3Gal III i vigtige trin i bugspytkirtlen tumorigen proces.

Metode /vigtigste resultater

ST3Gal III overekspression pancreas adenocarcinom cellelinjer Capan- 1 og MDAPanc-28 blev dannet. De viste en forøgelse af tumor-associeret antigen sialyl-Lewis

x. Transfektanterne »E-selectin bindingskapacitet var proportional med celleoverfladen sialyl-Lewis

x niveauer. Cellular migration positivt korreleret med ST3Gal III og sialyl-Lewis

x niveauer. Desuden milten injektion af ST3Gal III transficerede celler i athymiske nøgne mus viste et fald i overlevelse og højere metastasedannelse sammenlignet med mock celler.

Konklusion

Sammenfattende overekspression af ST3Gal III i disse pancreas adenocarcinom cellelinjer understreger den rolle, dette enzym og dets produkt i vigtige trin i tumorprogression såsom vedhæftning, migration og metastase dannelse

Henvisning:. Pérez-Garay M, Arteta B, Pagès L, de Llorens R, de Bolos C, Vidal-Vanaclocha F, et al. (2010) α2,3-sialyltransferase ST3Gal III modulerer kræft i bugspytkirtlen Cell motilitet og vedhæftning

In Vitro

øger dens metastatiske potentiale

In Vivo

. PLoS ONE 5 (9): e12524. doi: 10,1371 /journal.pone.0012524

Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: May 7, 2010; Accepteret: 31 Juli 2010; Udgivet 1. september, 2010

Copyright: © 2010 Pérez-Garay et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af La Marato de TV3 fundament (tilskud 050.932, tildeles RP), spansk Ministerio de Ciencia e Innovacion (bevilge BIO 2007-61.323, tildelt RP), regeringen i Catalonien (tilskud 2005SGR00065, tildeles RL), Comisión tværministerielle de Ciencia y Tecnología (CICYT) af den spanske regering i Madrid (nr. SAF2006-09341, tildelt FVV) og Baskerlandet regering (nr. IT-487-07 tildelt FVV). M.P.-G. tak Fundació La Marato for en pre-ph.d.-stipendium og University of Girona for en kortsigtet mobilitet fællesskab. De finansieringskilder har ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Cell overflade sialyleringen fremstår som et vigtigt element i kræftcelle metastaser. Sialinsyrer og deres derivater er allestedsnærværende på terminale positioner af glycokonjugater. Disse sure sukkerarter bibringe netto negativ ladning og er i stand til at modulere en lang række begivenheder i celle-celle, celle-matrix og celle-molecule interaktioner [1]. Overførslen af ​​de sialinsyrer fra cystidine-5-monophospho-N-acetylneuraminsyre (CMP-NeuAc) til de terminale stillinger af carbohydratgrupper af glycoprotein og glycolipider katalyseres af sialyltransferaser [2]. Salg

Menneskelige sialyltransferaser er en familie af 20 forskellige intracellulære, Golgi membranbundne glycosyltransferaser; grupperet i tre underfamilier [3]. Alpha-2,6-sialyltransferaser medierer overførslen af ​​sialinsyre med en a-2,6-binding til terminal Gal (ST6Gal I-II) [4], [5] eller GalNAc-rester (ST6Gal NAc I-VI). Alpha-2,8-sialyltransferaser medierer overførslen af ​​sialinsyre med en a 2,8-binding (ST8 Sia I-IV). Alpha-2,3-sialyltransferaser medierer overførslen af ​​sialinsyre med en a 2,3-binding til terminale Gal-rester. ST3Gal I-II og IV katalysere overføringen til Gal-rest placeret på terminale Galβ1-3GalNAc strukturer; ST3Gal IV og VI overførsel sialinsyre (med alfa 2,3-binding) til Gal-rest placeret på terminale Galβ1-4GlcNAc strukturer; ST3Gal V virker på Gal rest placeret på terminal Galβ1-4Glc-Cer strukturer og endelig, ST3Gal III katalyserer overførslen af ​​sialsyre med en alpha 2,3-binding til terminal Gal rester placeret på enten Galβ1-3GlcNAc eller Galβ1-4GlcNAc strukturer [6].

Ændringer i specifikke sialyltransferase ekspression er blevet rapporteret at blive ændret i flere tumorer og kan være årsag til dannelse af sialylerede tumorantigener, såsom sialyl-Lewis X, sialyl- Lewis a, sialyl-T og sialyl- Tn. I ekstrahepatisk galdegang carcinom ST3Gal III-niveauer korreleret med tumor udvikling, differentiering og metastase [7]. I brystcancer, den mest udtrykte sialyltransferase var ST3Gal III, som positivt korreleret til tumorstørrelse og antallet af axilary knudepunkter; og desuden høj ST3Gal III /ST6Gal I forholdet blev korreleret med en kortere samlet overlevelse og dårlig prognose [8], [9]. Desuden har ST6GalNAc V nylig blevet rapporteret at mediere hjernemetastaser af brystcancerceller [10]. I blærekræft ST3Gal I spiller en stor rolle i sialylering af T-antigen og dets overekspression synes at være en del af den oprindelige oncogen transformation [11]. I livmoderhalsen pladecellecarcinom, blev ST6Gal I- og ST3Gal III ekspressionsniveauer signifikant forøget i patienter med lymfeknudemetastaser sammenlignet med dem uden metastaser [12], [13] og ST3Gal III, ST3Gal IV og ST6Gal I blev øget i cervikal intraepitelialneoplasi . I human renal carcinoma en nedregulering af ST3Gal IV mRNA kan være en af ​​de faktorer, der er forbundet med sin malign progression [14]. I tyktarmskræft ST6Gal I og ST3Gal III øget deres ekspression i carcinoma prøver [15]. ST3Gal III blev fremtrædende steget i kræft væv sammenlignet med ikke-malign kolorektal slimhinde [16] og en højde på ST6Gal I-aktivitet blev observeret i maligne og overgangsordning væv [17]. I mavekræft, høje niveauer af ST3Gal III a i tumorvævet korrelerede med sekundær tumor tilbagefald [18].

Selvom alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal III-ekspression korrelerer med tumor malignitet i flere carcinomer sin mekanistiske rolle er ikke fuldt vurderet. ST3Gal III er involveret i biosyntesen af ​​sialyl-Lewis-antigener, der er overudtrykt i pancreas adenocarcinom (PDAC) [19], [20], [21], [22], [23], [24], og korrelerer med dets dårlig prognose [25], [26], [27], [28]. I det foreliggende arbejde, har vores mål været at undersøge den specifikke indflydelse af alfa-2,3-sialyltransferase ST3Gal III i nogle af de vigtige trin af PDAC progression såsom adhæsion, migrering og metastase. Til det har vi valgt to pancreas adenocarcinom cancercellelinier Capan-1 og MDAPanc-28, med forskellig ST3Gal III og sialyl-Lewis-antigen ekspressionsniveauer, og omsatte ST3Gal III overudtrykkende kloner. ST3Gal III forøget ekspression var relateret til en stigning sialyl-Lewis

x overfladen og ledes til et forbedret E-selectin bindingskapacitet og celle migration. Endvidere milten injektion i athymiske nøgne mus af ST3Gal III overepressing celler viste et fald i mus overlevelse og højere metastasedannelse. Sammenfattende forøget ekspression af ST3Gal III i disse pancreas adenocarcinom cellelinjer fremhæver den rolle, dette enzym og dets produkt i vigtige trin i tumorprogression såsom vedhæftning, migration og metastase.

Resultater

stabil overekspression af ST3Gal III i Capan-1 og MDAPanc-28 celler

for at udforske den mekanistiske rolle ST3Gal III i pancreas adenocarcinom progression, rotte ST3Gal III-gen, der udviser næsten identisk acceptor specificitet og enzymatisk aktivitet som menneske ST3Gal III-gen [29], blev anvendt. Således blev Capan-1 og MDAPanc-28-celler transficeret med pcDNA 3.1 vektor, der koder rotte-ST3Gal III-gen. Parentale celler blev samtidig transficeret med den tomme pcDNA3.1-vektoren. Adskillige stabile cellekloner blev selekteret i nærvær af Geneticin og ST3Gal III mRNA-overekspression blev analyseret ved semikvantitativ PCR (data ikke vist). ST3Gal III mRNA overekspression kloner, C31 og C32 (for Capan-1 model) og M33 og M34 (for MDAPanc-28 modellen) blev udvalgt til yderligere undersøgelser. Som kontroller, parentale cellelinier (Capan-1 og MDAPanc-28) og mock-transficerede kloner (CP for Capan-1 og MP for MDA-Panc 28) blev anvendt. ST3Gal III-mRNA-ekspression blev kvantificeret ved kvantitativ PCR (qPCR) (figur 1). Capan-1 parentale celler havde tre gange højere (

P 0,001

) ST3Gal III udtryk end MDAPanc-28 stamcellerne. Med hensyn til Capan-1 model, ST3Gal III mRNA-ekspression var 140 gange højere (

P 0,001

) i C31-klon og 100 gange højere (P 0,001) i C32-klon end i Capan-1 og CP kontrolceller. For MDAPanc-28 model, ST3Gal III mRNA-ekspression var 7 gange højere (

P 0,001

) i M34-klon og 3,6 gange højere (P 0,001) i M33-klon end i både kontrol- celler, MDAPanc -28 og MP. Evaluering af generel sialyltransferase aktivitet blev udført ved Glycosylering immunosorbent assay (GISA) som tidligere beskrevet [24]. Som forventet blev en generel sialyltransferaseaktivitet stigning påvist i de transfekterede celler i forhold til deres tilsvarende kontrol, er omkring 3,2 gange højere i Capan-1 ST3Gal III overekspression kloner

versus

CP og Capan-1 og 1,3 gange højere i MDAPanc-28 ST3Gal III overekspression kloner

versus

MP og MDAPanc-28

MDAPanc-28 stamcellerne, MP:. MDAPanc-28 mock celler, M34 og M33: MDAPanc-28 celler transficeret med ST3Gal III-gen. Capan-1: parentale celler, CP: Capan-1 mock celler, C31 og C32: Capan-1 celler transficeret med ST3Gal III-gen. Data repræsenterer middelværdien ± SD af 3 separate forsøg, hver i seks replikater (n = 18). * Signifikant forskellig (

P 0,001

).

ST3Gal III forøget de novo udtryk for SLex ved enzymatisk konkurrence

Cell overflade glycan udtryk mønster for begge modeller var studeret ved flowcytometri under anvendelse af specifikke monoklonale antistoffer mod Lewis-antigener og specifikke lectiner (resultater vist i figur 2). Analysen af ​​type II Lewis-antigener i Capan-1 model (figur 2A) afslørede, at Capan-1 og CP-celler havde høj-mellem niveauer af Le

x, SLE

x og H2 antigener og høje niveauer af Le

y antigen. Sammenlignet med kontroller, C31 og C32-kloner viste en stor stigning i SLE

x udtryk på bekostning af helt miste udtryk af ikke-sialylerede antigener (Le

x, H2 og Le

y). Desuden ledsager stigningen i SLE

x, blev der observeret et fald i α2,6-sialinsyre, opdaget af

almindelig hyld agglutinin

(SNA).

Maackia amurensis agglutinin

(MAA) viste ikke forskelle blandt kloner sandsynligvis på grund af det faktum, at ikke er i stand til at binde til SLE

x struktur (data ikke vist). Type I Lewis antigener SLE

a, Le

a, Le

b og H1 blev ikke påvist i Capan-1 model (data ikke vist). Således er disse resultater fremgår en multipel enzymatisk konkurrence for type II kæder. Analysen af ​​MDAPanc-28 (figur 2B) model viste, at MDAPanc-28 og MP kontrolceller havde meget lav SLE

x ekspression og høj α2,6-sialinsyre ekspression og manglede også type I Lewis-antigener. Når M33 og M34-kloner blev sammenlignet med kontroller, en stigning i SLE

x med en samtidig reduktion i α2,6-sialinsyre også blev detekteret. Som ovenfor har MAA ikke vise forskelle mellem kloner sandsynligvis fordi den ikke anerkender SLE

x (data ikke vist). Da ST3Gal III transficerede kloner C31 og C32 opførte sig på samme måde i Capan-1 model samt M33 og M34 ST3Gal III transfekterede kloner i MDAPanc-28 model, den følgende

in vitro

in vivo

blev udført kun med de højeste ST3Gal III og SLE

x udtrykker kloner: C31 til Capan-1 model og M34 for MDAPanc-28 model

figur 2A.. Capan-1 (kontinuerlig prik omrids: ………), CP (afstand dot omrids:…..), C31 (fed kontur: _______), C32 (almindeligt omrids: ______). Figur 2B. MDAPanc-28 (kontinuerlig prik omrids: ………), MP (afstand dot omrids:…..), M34 (fed kontur: _______), M33 (almindeligt omrids: ______). Eksperimenter blev udført for triplo. Repræsentative cytometri histogrammer er vist. Anti-Le

x MAb binder til Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc-; anti-SLE

x MAb binder til NeuAcα2-3Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc-; anti-H2 MAb binder til [Fucα1,2] Galβ1,4GlcNAc-; anti-Le

y MAb binder til [Fucα1,2] Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc-; SNA lektin (

almindelig hyld

agglutinin) binder til NeuAcα2-6Galβ- strukturer.

ST3Gal III forbedret bugspytkirtlen adenocarcinomceller vedhæftning til rh-E-selectin

E -selectin er et celleadhæsionsmolekyle udtrykkes på aktiverede endotelceller, som genkender og binder til specifikke kulhydratdeterminanter, såsom SLE

x og SLE

en stede på overfladen glycokonjugater [30]. Bindingsassays til rh-E-selectin blev udført for at undersøge, om den anderledes mønster af Lewis antigenekspression var i stand til at inducere ændringer i adhæsion (resultater vist i figur 3). Begge modeller viste forskellige vedhæftning mønstre til rh-E-selectin. MDAPanc-28 parentale celler udviste lavere adhæsion til rh-E-selectin end Capan-1 parentale celler, som var i overensstemmelse med det lavere ekspressionsniveau af ST3Gal III og SLE

x af MDAPanc-28 sammenlignet med Capan-1-celler. I Capan-1 model (figur 3A) ST3Gal III overudtrykkende klon, C31, tredoblet adhæsionen (

P 0,001

) til Rh-E-selectin i forhold til tilsvarende kontroller Capan-1 og CP. For at bekræfte, at SLE

x ekspression induceret af ST3Gal III forårsagede opreguleret E-selectin binding blev cellerne tidligere inkuberet med anti-SLE

x monoklonalt antistof (MAb) og binding til E-selectin blev inhiberet . I MDAPanc-28 model (figur 3B), ST3Gal III overudtrykkende klon, M34, firedoblet (

P 0,001

) vedhæftningen til rh-E-selectin i sammenligning med de tilsvarende kontroller MDAPanc-28 og MP . Når celler tidligere var inkuberet med anti SLE

x MAb bindingen til E-selectin blev fuldstændig ophævet. Disse resultater viste, at der i disse modeller, ST3Gal III niveauer modulerede

in vitro

binding til rh-E-selectin via SLE

x udtryk.

Capan-1 variant celler (figur 3A) og MDAPanc-28 variant celler (figur 3B), der tidligere var inkuberet med PBS-1% BSA (lyse søjler) eller anti-SLE

x MAb (mørke søjler), blev tilsat til 96-brønds mikroplader overtrukket med rh E -selectin eller PBS-1% BSA (negativ kontrol). Adhærerende celler blev estimeret med en MTT-baseret kolorimetrisk analyse. Resultater udtrykkes som den specifikke binding til E-selectin (OD 570 nm af celler afgrænset til E-selectin – OD 570 nm af celler bundet til PBS-1% BSA)

versus Salg celler tidligere inkuberet eller ikke med anti -SLe

x MAS. Data repræsenterer middelværdien ± SD af 3 separate forsøg, der hver i fem gentagelser (n = 15). * Signifikant forskellig (

P 0,001

).

Effekten af ​​forskellige cytokiner på vedhæftningen af ​​bugspytkirtelkræftceller til nedsat sinusformet endotel (HSE) celler

fordi ST3Gal III og SLE

x ekspressionsniveauer var direkte proportional med

in vitro

rh-E-selectin vedhæftning, binding af bugspytkirtelkræftceller til primære dyrkede HSE-celler blev evalueret. Den Capan-1 model blev valgt til dette eksperiment på grund dens højere vedhæftning til rh-E-selectin. Først bestemte vi specifik adhæsion af Capan-1 parentale celler til Hsec stimuleret med TNF-α, IL1-β eller lipopolysaccharid (LPS) i 16 timer før assayet (resultater vist i figur 4A). Behandling med TNF-α og IL1-β øget antallet af adhærente celler, og IL1-β viste sig at være de bedste stimuli for vores model. Når inkubation med anti-E-selectin MAb, blev stigningen i vedhæftning helt ophævet. Disse data viste, at HSE celle cytokin forbehandling, især IL-1β, fremmet deres E-selektinekspression, hvilket forårsagede en stigning på Capan-1 vedhæftning

HSE-celler blev inkuberet med. Sel = Anti-muse CD62 E (E-selectin) MAb eller IgG = Isotype-matchet kontrol antistof. Parentale Capan-1-celler blev mærket med calcein og tilsat til HSE-kontrolceller, TNF-α stimulerede HSE-celler, LPS-stimulerede HSE-celler eller IL-1β stimulerede HSE-celler. Resultater er udtrykt som% Specifik adhæsion til HSE-celler [78]. Data repræsenterer middelværdien ± SD af 3 separate forsøg, hver i tre gentagelser (n = 9). * Signifikant forskellig (

P 0,001

), når man sammenligner anti-E-selectin inkuberes Hsec at kontrollere celler. # Signifikant forskellige (

P 0,001

), når man sammenligner behandlinger. Tumor celleadhæsionsassay til primære dyrkede HSE-celler (figur 4B). Capan-1-varianten celler blev mærket med calcein og tilsat til IL-1β stimulerede HSE-celler eller (-) ikke stimulerede HSE kontrolceller. Sel = Anti-murint CD62 E (E-selectin) MAb blev tilsat til IL-1 HSE-celler eller – HSE-celler før tumorcelle tilsætning. * Signifikant forskellig (

P 0,001

), når man sammenligner Capan-1, CP, og C31-celler. # Signifikant forskellige (

P 0,001

)., Når man sammenligner hver klon (Capan-1, CP og C31) vedhæftning til de forskellige HSE celle behandlinger

ST3Gal III øgede tumorcelleadhæsion til HSE-celler

Derefter bestemte vi adhæsionen af ​​forskellige ST3Gal III og SLE

x niveauer udtrykker Capan-1-celler til IL-1p forbehandlede eller kontrollere HSE-celler (resultater vist i figur 4B). Capan-1 og CP kontrolceller udviste en basal adhæsion til HSE-celler, der væsentlig større i IL-1p forbehandlede HSE-celler og vendte tilbage til basale niveauer i anti-E-selektin MAb præinkuberet HSE-celler. C31 viste en basal adhæsion til HSE-celler (højere end Capan-1 og CP kontrol celler), som i væsentlig grad steget i IL-1 forbehandlede HSE-celler og også vendt tilbage til basale niveauer i anti-E-selectin MAb forinkuberet HSE-celler. Disse data viste, at E-selectin spiller en vigtig rolle mediere adhæsion til HSE-celler, skønt en ikke-E-selectin afhængige basal adhæsion (højere for C31 end for kontrolceller) eksisterede. Desuden høj ST3Gal III og SLE

x udtrykke C31-celler havde en højere adhæsion til HSE-celler end medium ST3Gal III og SLE

x udtrykkende kontrolceller.

ST3Gal III-ekspression øget cellemigration

for at undersøge om ST3Gal III overekspression kloner kan føre til erhvervelse af en mere vandrende celle fænotype, vi evalueret cellevandring på kollagen type-i ved hjælp af en transwell migration assay (resultaterne vist i figur 5). Begge celle modeller viste forskellige vandrende kapaciteter, med Capan-1 model er ni gange mere vandrende end MDAPanc-28 model. Med hensyn til Capan-1 model (figur 5A), den ST3 Gal III og SLE

x overekspression klon C31 udstillet dobbelt (

P 0,001

) migration muligheder end kontrol celler Capan-1 og CP. På MDAPanc-28 model (figur 5B), ST3Gal III og SLE

x overudtrykkende klon M34 forøget migration af fire i forhold til kontrolcellerne MDAPanc-28 og MP. Resultaterne viste en positiv korrelation mellem ST3Gal III og SLE

x niveauer og vandrende kapaciteter.

Capan-1 variant celler (Capan-1, CP og C31)

(

Figur 5A

)

MDAPanc-28 variant celler (MDAPanc-28, MP og M34)

(

Figur 5B

)

blev udsået på 8 um-porer-type i-collagen coatede skær, placeret på toppen af ​​brønde, der indeholder DMEM-1% FBS og inkuberet ved 37 ° C (6 timer for Capan-1 model og 18 timer for MDAPanc-28 model). Ikke-migrerede celler blev fjernet og migrerede celler fikseret, farves og tælles. Resultater udtrykkes som migrerede celler pr. Data repræsenterer middelværdien ± SD af værdierne opnået i 3 separate forsøg, (n = 9). * Signifikant forskellig (

P 0,001

).

ST3Gal III overekspression øger tumorudvikling og formindsker overlevelse i athymiske nøgne mus

Siden

in vitro

ovenfor beskrevne resultater foreslog en vigtig rolle for ST3Gal III-gen i tumorprogression,

in vivo Salg assays blev udført for at undersøge, om ST3Gal III kan være vigtigt i tumormetastase. Først blev dannelsen af ​​metastaser og overlevelse af athymiske nøgne mus efter milten injektion med forskellige mængder af de Capan-1 og MDAPanc-28 parentale celler analyseret. I vores hænder, når 1,5 × 10

6, 3 × 10

6 og 5 × 10

6 Capan-1-celler blev injiceret, den nøgne mus døde af emboli dannelse, sandsynligvis på grund af Capan-1 størrelse og aggregering kapacitet. Injektionen af ​​1 × 10

6 Capan-1 celler ikke danner emboli og genererede milt tumorer, dog uden metastatisk fokuserer. Da MDAPanc-28 celler er 4-5 gange mindre end Capan-1 celler, 7 × 10

6 MDAPanc-28-celler blev injiceret intramilt i nøgne mus, som har frembragt lille makroskopiske metastatisk fokuserer i 2/3 af musene, 20 -22 uger senere. Derfor blev MP og M34-celler valgt at studere indflydelsen af ​​ST3Gal III overekspression i metastase-dannelse og nøgne mus overlevelse. Eksponentielt voksende 7 × 10

6 levedygtige MP og M34-celler, der deler de samme morfologiske karakteristika, blev injiceret i milten af ​​athymiske nøgne mus (n = 8 /gruppe) og overlevelse analyse blev udført under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden ( Figur 6). Mus injiceret med ST3Gal III overudtrykker celler (M34) viste et stort fald i overlevelse (

P = 0,019

) sammenlignet med mus injiceret med kontrol MP-celler. Det meste af M34 injicerede mus (5/8) døde efter 103-110 dage efter injektion, mens MP injicerede mus overlevede indtil afslutningen af ​​undersøgelsen (190 dage). Alle M34 injicerede mus blev obduceret, og analysen viste milt tumorer i 62,5% af dem (5/8) og flere makroskopiske metastatisk fokuserer på tarmen, mellemgulv, nyre, ganglier eller binyrer i 75% af musene (6/8) . Alle MP injicerede mus blev obduceret (dag 103, 138, 161 og 190 efter injektion) og ingen af ​​dem (8/8) viste tegn på enten milt tumorer eller makroskopisk metastaser. Således overekspressionen af ​​ST3Gal III i MDAPanc-28-celler, som fører til en højere ekspression af SLE

x og en højere adhæsion og migration, kunne korreleres direkte med et fald i overlevelse, når de injiceres i nøgne mus. Endvidere udstyret celler med en større tumordannelse kapacitet og metastatisk potentiale, når intramilt injiceres.

Celler (7 × 10

6) blev intramilt injiceret i nøgne mus på dag 1 af forsøget. Mus blev dagligt undersøgt og aflivet, når de kiggede syge. Forskellene mellem grupperne blev vurderet af den lange rank test (

P

= 0,019, n = 7-8 /gruppe).

Diskussion

Vores tidligere undersøgelser viste, at alpha-2,3-sialyltransferase aktivitet korreleret til sialyl-Lewis-antigen udtryk på kræft i bugspytkirtlen celleoverflader [24]. Vi deri udvidet vores undersøgelser til specifikt studere mekanistisk rolle ST3Gal III i købet af lim, vandrende og metastatiske kapaciteter i bugspytkirtlen adenocarcinom kræft cellelinjer. Vi har fundet, at: 1) ST3Gal III mRNA ekspressionsniveauer korreleret med SLE

x overfladeekspression; 2) ST3Gal III induceret sialylering øget kræft i bugspytkirtlen vedhæftning til rh-E-selectin og IL1-p pre-stimulerede HSE-celler, via SLE

x-E-selectin interaktion; 3) en positiv sammenhæng mellem migration og ST3Gal III og SLE

x udtryk; og 4) i milten injektion af ST3Gal III overudtrykker cellelinier i athymiske nøgne mus inducerede en forøgelse af tumorigenese og et fald i overlevelse.

ST3Gal III overudtrykker kloner (C31, C32, M33 og M34) viste en stigning i SLE

x ekspression sammenlignet med de tilsvarende kontroller (utransficerede celler, Capan-1 og MDAPanc-28, og celler transficeret med tom vektor, CP og MP). Selv om type I-substrat anses ST3Gal III foretrukne acceptor, Type II substrat er også en god acceptor. De enzymatiske undersøgelser for at karakterisere ST3Gal III-aktivitet viste, at type I og type II-acceptor substrater førte til helt ens V

max værdier, mens K

m værdier var meget højere for type II. Som følge heraf kan iblandes var omtrent to gange for type I end for type II strukturer [31]. Lignende resultater blev opnået i senere værker på studerer naturlige [32], [33] eller syntetiske acceptorer særlige [34], [35], [36], [37], [38]. Under hensyntagen til at cellelinierne anvendt i denne undersøgelse ikke udtrykker type I Lewis-antigener og at ST3Gal III kan virke på både type I- og II-substrater, overekspression af ST3Gal III handlede på type II forstadier, der fører til en forøget ekspression af SLE

x. For nylig, og efter aftale med vores resultater, er det blevet beskrevet, at overekspression af ST3Gal III i gastrointestinale carcinomceller resulterede også i SLE

x afgørende stigning [39]. Desuden disse forfattere beskrev, at mRNA niveauerne af ST3Gal III korreleret med øget SLE

x ekspressionsniveauer i sammenflydende celler, men ikke med mRNA niveauerne af ST3Gal IV og ST3Gal VI, som er de enzymer, der er blevet rapporteret til at handle fortrinsvis om type II kæder. Tilsammen disse data styrke den rolle, ST3Gal III i biosyntesen af ​​SLE

x i disse carcinomaceller. Sammen med SLE

x stigning, et fald i α2,6-sialinsyre blev observeret i begge modeller. Desuden C31 og C32 viste et fuldstændigt tab af ikke-sialylerede type II Lewis-antigener (Le

x, H2 og Le

y). Disse resultater er sandsynligvis forklares ved multipel enzymatisk konkurrence for type II kæder. På den ene side var der konkurrence mellem alfa-1,2-fucosyltransferaser, alfa-1,3 (4) fucosyltransferaser og alfa-2,3-sialyltransferaser [23], [40], [41], og på den anden mellem alfa-2,3-sialyltransferaser og alfa-2,6-sialyltransferaser [6], [31], [42].

De molekylære mekanismer, der regulerer bugspytkirtlen tumormetastaser stadig dårligt forstået. Et afgørende skridt er fastgørelse af tumorceller til aktiverede endotelceller, som involverer deres vedhæftning til endotel selectiner der genkender oligosaccharid determinanter udtrykt på cancerceller overflade. Sle

x er blevet rapporteret til at deltage i de første trin af ekstravasation gennem interaktion med E-selectin ved at lette rullende og fastgørelse af tumorceller til endotelceller [27], [28], [43], [44 ], [45]. En direkte korrelation mellem ST3Gal III-niveauer, SLE

x niveauer og coloncancer celleadhæsion til IL-1β aktiverede humane navlevene-endotelceller (HUVEC) er blevet beskrevet [46]. Sle

x udtrykker tyktarmskræft celler er blevet også rapporteret at holde sig til hepatiske sinusformede endotelceller via E-selectin-SLE

x interaktion [47]. Desuden rapporterede flere værker en sammenhæng mellem SLE

x, og vedhæftningen til cytokin stimuleret HUVEC i H7721 leverkarcinom [48], [49], [50], [51] og i lunge adenocarcinom celler [52]. I overensstemmelse med disse data, viste vores resultater en direkte sammenhæng mellem pancreasadenocarcinom vedhæftning til

in vitro

rh-E-selectin og ST3Gal III-niveauer i pancreas tumorceller via SLE

x. Desuden, når studerer vedhæftningen af ​​pancreas adenocarcinom celler til hepatiske sinusformede endotelceller, ST3Gal III og SLE

x overekspression C31 celler viste en forbedret evne til at holde sig til IL-1β stimulerede HSE-celler sammenlignet med kontroller. HSE celle forbehandling med IL1-β og TNF-α cytokiner signifikant forøget Capan-1-celleadhæsion til HSE-celler og vendte tilbage til basale niveauer i anti-E-selektin præinkuberet HSE-celler. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere arbejde rapporterer, at E-selektinekspression er lav eller fraværende i HSE-celler under normale forhold, men kan være op-reguleret af cytokiner [53], som hepatocytter [54] eller som en reaktion på metastatiske tumorceller [ ,,,0],55]. Adhæsion af ST3Gal III og SLE

x overudtrykker C31-celler til ikke-stimulerede HSE-celler var signifikant større sammenlignet med kontrolceller Capan-1 og CP. Denne adhæsion blev ikke gendannes, når præ-inkubering HSE-celler med anti-E-selectin, hvilket kunne forklares ved en ikke-E-selectin afhængig, men SLE

X-medieret, pancreascancer celleadhæsion til ikke-stimulerede HSE-celler . Denne interaktion kan være medieret af andre SLE

x bindende celleadhæsionsmolekyler såsom P-selectin [55], [56] eller I-typen Lectiner. Faktisk er en tidligere undersøgelse rapporteret bindingen af ​​ST3Gal III overudtrykker coloncancer celler til ikke-aktiveret HUVEC, hvilket tyder denne ikke-E-selectin afhængig SLE

x medieret adhæsion kan skyldes I-type lectiner [46].

Så vidt vi ved, er dette den første rapport om en positiv sammenhæng mellem celle migration og ST3Gal III og SLE

x ekspressionsniveauerne i pancreas adenocarcinom celler. Trods der ikke foreligger undersøgelser vedrørende bugspytkirtelkræftceller, nogle undersøgelser understøtter vores resultater. Når tumorcelleoverfladen α2,3-sialinsyre-ekspression på MDA-MB-231 brystcancercellelinje var deprimeret (ved inhibering cellulær α2,3-sialyltransferase aktivitet med soyasaponin I), cellemigration faldt betydeligt [57]. ST3Gal III overekspression på gliom-cellelinje U-374 forøgede α2,3-koblet sialinsyre-ekspression på celleoverfladen og resulterede i en mere

in vitro

invasiv fænotype [58]. Desuden viste H7721 leverkarcinom celler en direkte sammenhæng mellem mængden af ​​overfladen SLE

x udtryk og migration [50], [51], [59]. Desuden SLE

x var afgørende for H7721 migration, da migration blev inhiberet af anti-SLE

x MAb og efter sialinsyrerest elimination [60]. Cell migration er en flertrins proces, der spiller en central rolle i metastaser. Den første reaktion af migrerende celler til en migration-fremmende middel er at polarisere og udvide fremspring. Disse fremspring er stabiliseret af ekstracellulær matrix adhæsionsmolekyler, såsom integriner, og tjene som trækkraft sites for migration som cellen bevæger sig fremad over dem [61]. Der er en hastigt voksende mængde af beviser, der viser, at sialyleringen påvirkninger migration kapaciteter ved at modulere integrinfunktion [58], [62], [63], [64]. Således har vi hypotesen, at ST3Gal III kunne påvirke celle migration ved at ændre integrin sialyleringen. En stigning i α2,3-sialinsyre på C31 og M34 celleoverfladen kunne også ændre sialylering niveauer af deres integriner, modulere deres ekstracellulære matrix adhæsion.