PLoS ONE: Positive Feedback forordning mellem Phospholipase D og Wnt Signaling Fremmer Wnt-Driven Anchorage-Uafhængig Vækst af kolorektal cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Aberrant aktivering af den kanoniske Wnt /β- catenin vej forekommer i næsten alle kolorektal kræft og bidrager til deres vækst, invasion og overlevelse. Phopholipase D (PLD) er blevet impliceret i progression af colorektal carcinoma Men en forståelse af de mål og regulering af denne vigtige vej stadig ufuldstændig og desuden er forholdet mellem Wnt signalering og PLD ikke kendt.

Metode /Principal resultaterne

Her viser vi, at PLD isozymer, pLD1 og PLD2 er direkte mål og positiv feedback regulatorer af Wnt /β-catenin signalering. Wnt3a og Wnt mimetika markant forøgelse af ekspressionen af ​​plds på transskriptionsniveau i HCT116 kolorektal cancer celler, hvorimod silencing af β-catenin-genekspression eller anvendelse af en dominant negativ form af T-celle faktor-4 (TCF-4) inhiberede ekspression af plds . Desuden blev både pLD1 og PLD2 stærkt induceret i colon, lever og mave væv fra mus efter injektion af LiCI, et Wnt mimetikum. Wnt3a stimulerede dannelsen af ​​β-catenin /TCF-komplekser til to funktionelle TCF-4-bindende elementer inden for PLD2 promotoren som vurderet ved kromatin immunpræcipitationsassay. Undertrykke PLD hjælp gendæmpning eller selektiv inhibitor blokeret evne β-catenin til transkriptionelt aktivere PLD og andre Wnt målgener ved at forhindre dannelsen af ​​β-catenin /TCF-4-kompleks, hvorimod taktik at hæve intracellulære niveauer af phosphatidsyre, produktet af PLD-aktivitet, øget disse virkninger. Her viser vi, at PLD er nødvendig for Wnt3a-drevne invasion og forankringsuafhængig vækst kolon kræftceller.

Konklusion /Betydning

PLD isozym fungerer som en roman transkriptionel mål og positiv feedback regulator af Wnt signalering, og derefter fremmer Wnt-drevet forankringsuafhængig vækst af kolorektal cancer celler. Vi foreslår, at terapeutiske indgreb rettet mod PLD kan give en klinisk fordel i Wnt /β-catenin-drevne maligniteter

Henvisning:. Kang DW, Min DS (2010) Positive Feedback forordning mellem Phospholipase D og Wnt Signaling Fremmer Wnt- Driven Anchorage-Uafhængig vækst af kolorektal kræftceller. PLoS ONE 5 (8): e12109. doi: 10,1371 /journal.pone.0012109

Redaktør: Sudha Agarwal, Ohio State University, USA

Modtaget: April 3, 2010; Accepteret: 5 juli 2010; Udgivet: 12. august 2010

Copyright: © 2010 Kang, Min. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Korea Healthcare Technology R D Project, Ministeriet for sundhed, velfærd og familiespørgsmål, Republikken Korea (A080287). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer er en af ​​de mest almindelige ondartede sygdomme, der forekommer i en væsentlig procentdel af befolkningen. Mere end 80% af sporadiske og arvelige kolorektal kræft kan skyldes afvigelser i Wnt /β-catenin signalvej [1] – [3]. Således ændringer i Wnt /β-catenin pathway definerer en central begivenhed i patogenesen for tyktarmskræft. β-Catenin er en transkriptions-coaktivator af T-celle faktor (TCF) /lymfoid enhancer faktor (LEF) transkriptionsfaktorer. β-catenin stabilitet reguleres af en multiproteinkompleks der omfatter adenomatøs polyposis coli (APC), glycogensynthasekinase 3β (GSK3p), og axin. Phosphorylering af β-catenin af GSK3p målretter β-catenin til ubiquitinering og proteasom nedbrydning [4]. Således aktivering af pathway undertrykker β-catenin-nedbrydning, hvilket resulterer i kerneakkumulering af β-catenin. I kernen, akkumulering af TCF /β-catenin fører til transkriptionel aktivering af multiple målgener, som derefter kan bidrage til udvikling af cancer [5], [6]. Således identifikation af direkte mål for Wnt /β-catenin signalvej er potentielt vigtigt at forstå den centrale rolle, som Wnt /β-catenin /TCF afhængig kanoniske vej i tumorigenese.

Phospholipase D (PLD) katalyserer hydrolyse af phosphatidylcholin (PC) til generering af phosphatidinsyre (PA), der virker som en anden messenger i mange fysiologiske responser [7]. To pattedyr PC-specifikke PLD isozymer udpeget som pLD1 og PLD2 er blevet klonet. PLD har vist sig som en kritisk regulator af celleproliferation og overlevelse, hvis dysregulering forekommer under udviklingen af ​​en række humane tumorer [8]. Forhøjet udtryk for pLD1 og PLD2 er blevet rapporteret i kolorektal cancer væv [9]; især har PLD2 udtryk niveau og dens tilknytning til klinisk-patologiske træk for nylig blevet undersøgt i kolorektal cancer [10]. Ekspressionsniveauer af PLD2 korrelerer signifikant med tumorstørrelse og overlevelse af patienter med colorectal carcinom [10]. Den PLD2 punktmutation er også blevet fundet i brystcancer [11]. Celler, der overudtrykker PLD isozymet forbedre matrixmetalloproteinase-2-ekspression og tumorcelleinvasion og danne metastaser i syngene mus [12], [13]. Disse resultater antyder, at PLD spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​colorektal carcinom, og kunne være et mål for cancerterapi. Vi har for nylig rapporteret om betydelig co-overekspression af PLD isozymer med β-catenin i human kolorektal cancer [14]. Brug af to RNA-interferens (RNAi) -baseret tab-af-funktion skærme, de onkogener, der modulerer β-catenin-afhængig transskription og regulere coloncancer celleproliferation er blevet identificeret [15].

Blandt et af generne identificeret i denne skærm var pLD1, og undertrykkelse af pLD1 hæmmede både β-catenin transkriptionel aktivitet og tyktarmskræft celledeling betydeligt. I den foreliggende undersøgelse, vi demonstrerer virkningen af ​​PLD isozymerne som nye mål og positiv feedback regulatorer af Wnt signalering. Således identifikation af et Wnt-β-catenin-TCF-regulerede PLD aksen giver nye mekanistiske indsigt i kræft.

Materialer og metoder

Cellelinjer og reagenser

Menneskelig kolorektal kræftceller (HCT116, HCA-7, Colo-741, RKO) og brystcancerceller (Hs578T) blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA) og blev dyrket i overensstemmelse med standardprotokoller. Oprenset rekombinant Wnt3a blev indkøbt fra R -1930 /+ 1), transskriberet fra exon 2, blandt to alternative udskrifter af pLD1 skal transskriberet på to forskellige transskription steder (exon 1 og exon 2). Den PCR-metode blev anvendt til kloning af serielt udgår PLD2 promotorkonstruktioner i pGL4-14b reporter vektoren ved Kpn I og Bgl II-stedet. Sekvensen af ​​oligonukleotider anvendt som primere i PCR-amplifikationer er vist i tabel S1.

Mutationer af TCF-4-binding elementer på PLD2 promotoren blev dannet ved anvendelse af Quick Change steddirigeret mutagenese kit ifølge producentens anbefalinger (Stratagene; tabel S2). TOPflash og FOPflash luciferase plasmider indeholdende flere kopier af TCF /LEF respons elementer blev anvendt til måling af TCF aktivitet. Dominant-negative TCF-4 (ΔN30 TCF-4) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Tesshi Yamada (National Cancer Center Research Institute). Konstitutiv aktiv mutant af β-catenin (S37A β-catenin) og vildtype TCF-4 ekspressionsvektorer blev venligst stillet til rådighed af Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University). shRNA for β-catenin blev venligst stillet til rådighed af Dr. H. Clevers (Utrecht,. Holland). SiRNA’er for kontrol, pLD1, og PLD2 blev indkøbt fra Dharmacon Research Inc (Lafayette, Colo). siRNA sekvenser for plds er som følger:. menneskelig pLD1 (nukleotider, 1571 til 1591, AAGGUGGGACGACAAUGAGCA) og humane PLD2 (nukleotider, 1378-1396, ACAUAAAGGUGAUGCGUCA)

Transient transfektion og reportergenassay

at følge producentens instruktioner, ekspressionsplasmider eller siRNA blev transient transficeret ind i celler ved anvendelse LipofectAmine Plus (Invitrogen) eller Polyfect (Qiagen) reagenser. Transfektion og luciferase assays blev udført som tidligere beskrevet [16]. Relativ luciferaseaktivitet blev opnået ved normalisering af aktiviteten af ​​ildflueluciferase mod aktivitet af den interne kontrol

Renilla

luciferase.

Immunfældning og Western blotting

Cellelysater blev analyseret for immunopræcipitation og /eller immunoblot, som tidligere beskrevet [17]. Anti-α-tubulin (Sigma, MO), anti-vimentin (Sigma, MO), anti-c-myc (Santa Cruz, CA), anti-β-catenin (Santa Cruz, CA), anti-NOS2 (Santa Cruz , CA), anti-TCF-4 (Santa Cruz, CA), anti-β-catenin (BD Biosciences, CA), anti-cycinD1 (BD Biosciences, CA), og anti-phospho-GSK3p antistof (cellesignalering, MA ) blev erhvervet. Det polyklonale anti-PLD antistof, som genkender både pLD1 og PLD2 blev dannet som beskrevet tidligere [18].

PLD aktivitetsassay

PLD-aktivitet blev vurderet ved måling af dannelsen af ​​[

3H] phosphatidylbutanol, produktet af PLD-medieret transphosphatidylering, i nærvær af 1-butanol, som beskrevet tidligere [17].

Kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA (1 ug) blev forbehandlet med DNase og anvendt til revers transkription med M-MLV revers transkriptase (Invitrogen). Real-time Q-PCR blev udført på en Rotor-Gene RG-6000A apparatet (Corbett Research): for 44 cykler af 94 ° C i 10 sek, 60 ° C i 10 sek og 72 ° C i 15 sek. Reaktioner (20 pi) indeholdt 2 pi cDNA, målspecifikke primere, og Quantitect SYBR green PCR-kittet (QIAGEN). Temperaturområdet til analyse af smeltekurver var 55 ° C til 99 ° C i løbet af 30 sek. Tre uafhængige forsøg blev udført for hver reaktion i tre eksemplarer. Alle data blev normaliseret med GAPDH genekspression værdier. Se tabel S3 for Q-RT-PCR-primer sekvenser.

Animal og væv forberedelse

Mus blev forsynet med standard vedligeholdelse og en kost fra Dae Han Bio Link (Seoul, Korea). Dyreforsøg blev godkendt og udføres under retningslinjerne fra Institute of Health retningslinjer for Institutional Review Board of Pusan ​​Nationale Universitet (Busan, Sydkorea). Tolv uger gamle mandlige FVB mus modtog intravenøs injektion med LiCI gang hver dag i 2 dage ved en dosis på 5 mg /kg. Kontrolgruppen blev injiceret med det samme volumen af ​​phosphatbufret saltvand (PBS). Otteogfyrre timer efter LiCI injektion, dyr (n = 3 /gruppe) blev dybt bedøvet med diethylether og halshugget, og vævene blev frosset straks i LN

2 og opbevaret ved -70 ° C i immunblotting. Mus (n = 3 /gruppe) også blev bedøvet og derefter perfunderet intracardialt med 4% paraformaldehyd i PBS indeholdende 0,34% L-lysin (Sigma). Efter fiksativ perfusion blev vævene fjernet, anbragt i 4% paraformaldehyd-opløsning ved 4 ° C natten over, og derefter overført til en saccharoseopløsning på 30%. Vævene blev forarbejdet ved coronal kryostat sektionering i Dulbeccos PBS-opløsning indeholdende 0,1% natriumazid ved anvendelse af en frysning mikrotom (MICROM, Tyskland).

Immunhistokemi

Paraformaldehyd-fikserede 4 um paraffinsnit af kolon væv blev autoklaveret i 10 mM natriumcitratbuffer (pH 6,0). Efter blokering med 5% BSA og 1% normalt gedeserum i PBS blev snit inkuberet med anti-β-catenin (BD transduktion) og PLD antistoffer natten over ved 4 ° C, efterfulgt af vask med PBS. Efterfølgende blev snit inkuberet med Alexa Fluor 488 eller Alexa Fluor 555-konjugeret IgG sekundært antistof (Santa Cruz, 1: 200) ved stuetemperatur i 1 time, efterfulgt af vask med PBS. Efter counterstaing med DAPI, og glider blev monteret i Permount

® (Fisher Scientific, USA). To-farve fluorescerende billede for anti-PLD og β-catenin antistof-farvning blev opsamlet på et Zeiss LSM 510 konfokalt mikroskop (Zeiss, Tyskland). Fluorescerende billeder blev analyseret ved hjælp af Zeiss LSM billede browser software (Zeiss).

blev udført chromatin immunoprecipitation (chip) assay

CHIP eksperimenter som beskrevet tidligere [19], med mindre modifikationer. HCT116 celler blev anvendt til tværbinding med 1% paraformaldehyd i phosphatbufret saltvand (PBS) i 10 minutter. Celler blev skrabet og opsamlet ved centrifugering. Celler blev lyseret i lysisbuffer (50 mM Hepes, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% deoxycholat og 1,0 mM blanding af proteaseinhibitor) og sonikeret i 20 sek 3 gange. Normalt muse-IgG, anti-β-catenin eller anti-HDAC1 antistof blev tilsat og inkuberet i 6 timer ved 4 ° C. Immnunocomplexes blev ekstraheret 3 gange med 1% SDS, 0,1 M NaHCO3, og tværbinding blev vendt ved inkubering ved 65 ° C natten over. Den gemte fraktion kromatin input blev også behandlet på samme måde. Prøver blev derefter fordøjet med DNase- og RNase-frit proteinase K ved 50 ° C i 4 timer, og ekstraheret med phenol /chloroform /isoamylalkohol. DNA-prøver blev renset med Qiagen oprydning kolonner. Den PLD2 eller NOS2 promoter region blev analyseret ved Q-RT-PCR ved hjælp af specifikke primere (tabel S4).

Cell Migration og Invasion Analyser

Cellerne blev tilføjet til Transwell membran kamre (porestørrelse, 12,0 um, Corning). Antallet af celler, som migrerede gennem membranen til det nedre kammer blev talt efter 24 timer. For siRNA eksperimenter blev celler podet 24 timer efter transfektion med siRNA’er, og migration assays blev udført i yderligere 24 timer. For invasionen assays Matrigel (1: 5; BD) blev tilsat til Transwell membran- kamre og inkuberet i 5 timer; Cellerne blev derefter podet. Omfanget af migration og invasion blev udtrykt som et gennemsnitligt antal celler pr mikroskopisk felt.

Anchorage-uafhængig vækst assay

Anchorage uafhængig vækst blev målt ved hjælp af CytoSelect ™ 96-Well

I vitro

Tumor Følsomhed Assay (Cell Biolabs, CA), i henhold til producentens specifikationer. Forankringsuafhængig vækst blev undersøgt i blød agar; 50 pi baseagar matrix blev sat til bunden af ​​hver brønd i en plade med 96 brønde. Når agaren var fast, 75 pi cellesuspension /blød agar matrix indeholdende 3 × 10

3 celler blev lagt på toppen, efterfulgt af 50 pi 2 × komplet medium med Wnt3a og /eller inhibitorer. Efter 10 dages inkubation, agar matrix var solubiliseret, og 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromid blev tilsat til hver brønd. Absorbansen produceret ved dannelse af uopløseligt formazan produkt ved levedygtige celler blev registreret ved 570 nm.

Statistisk analyse

Alle eksperimenter blev uafhængigt udført mindst tre gange, med lignende resultater. Data blev analyseret af den studerendes

t

test, og

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Wnt signalering fremmer udtryk for PLD. isozymer

for at undersøge spørgsmålet om, hvorvidt Wnt signalering øger PLD udtryk blev HCT116 kolorektal kræft celler udsat for Wnt3a eller Wnt3a mimetika (Figur 1). Som ved immunopræcipitation og Western blot, ekspression af både pLD1 og PLD2 var forøget i en tidsafhængig måde efter udsættelse for oprenset rekombinant Wnt3a (150 ng /ml) (figur 1A, øvre panel). Anti-PLD antistof blev genereret mod C-terminalt peptid af pLD1, hvor 7 aminosyrer blandt 12 aminosyrer var den samme med den for PLD2, og genkender både pLD1 og PLD2 [18]. Det blev påvist, at HCT116 celler har mutationer i β-catenin ved Ser-45, og at denne Ser-45 mutant allel ikke var tilstrækkelig til at understøtte tumorgenese af HCT116 celler [20] – [22]. Det foreslås således, at β-catenin pathway i HCT116-celler ikke er fuldt aktiveret ved mutation og derfor kan stimuleres af yderligere ekstracellulære messengers, såsom Wnt signalering, hvilket resulterer i yderligere oncogen transformation. Vi derefter undersøgt spørgsmålet om, hvorvidt eller ikke Wnt signalering-induceret PLD udtryk kan reguleres på transskriptionsniveau. Wnt3a forbedret mRNA-niveauerne af pLD1 og PLD2 i en tidsafhængig måde (Figur S1). At udelukke, at Wnt-afhængig stigning af PLD-mRNA kun er forårsaget af ændringer i mRNA-stabilitet, udførte vi en mRNA henfald under anvendelse af actinomycin D, som forhindrer transkription. Ekspressionen af ​​pLD1 og PLD2 blev forøget over tid i en sammenlignelig måde mellem Wnt-behandlede og kontrolceller, som analyseres af Q-RT-PCR (figur S2). Forbehandling med actinomycin D betydeligt undertrykt både basal og Wnt3a-inducerede PLD mRNA-niveauer (figur S2). Således Wnt-afhængig stigning af PLD-mRNA er faktisk skyldes forhøjet transkription. For yderligere at styrke vores resultater, vi bestemt effekten af ​​blokade af GSK-3β på PLD udtryk. LiCI og BIO er etableret agonister, der efterligner Wnt-signalvejen, hvilket fører til aktivering og stabilisering af β-catenin [23], [24]. Som analyseret ved immunopræcipitation og Western blot, LiCI (20 mM), BIO (1 uM), og Wnt3a (150 ng /ml) signifikant forøget ekspressionsniveauet af PLD isozymer (figur 1b). Wnt mimetika også øget protein niveau af β-catenin, samt ekspression af c-myc og NOS2, målgener af Wnt-signalering. Som analyseret ved Q-RT-PCR, Wnt signalering markant forhøjede ekspressionsniveauer af PLD-mRNA (figur 1C). Derudover Wnt og dets mimetika signifikant forøget promotoraktiviteten af ​​både pLD1 og PLD2 (figur 1D); Wnt3a ledsaget en signifikant stigning i genekspression fra en TCF /LEF specifik luciferasereporterplasmid (TOPflash) anvendt som kontrol. Endvidere fandt vi, at Wnt3a øget ekspressionsniveauer af PLD isozymer i forskellige cancerceller, herunder colorektale cancerceller (HCA-7, RKO, Colo-741) og brystcancerceller (Hs578T) (Figur S3). At observere induktion af PLD isozymer i afhængighed Wnt signalering, valgte vi cancerceller, hvor status for Wnt-vejen er normal. Disse cancerceller er kendt for at udtrykke vildtype APC og β-catenin [25] – [29]. Således foreslås det, at Wnt signalering-induceret PLD-ekspression kan være et generelt fænomen. Opregulering af plds ekspression ved Wnt3a og Wnt mimetika stærkt impliceret en central rolle for inhibering af GSK3p og den kanoniske Wnt signalvejen i Wnt-medierede virkninger. Taget sammen indikerer disse resultater, at induktion af PLD isozym som en ny mål for Wnt signalering reguleres på både transkriptions- og post-transkriptionelle niveau.

(A) HCT116-celler blev behandlet med renset rekombinant Wnt3a (150 ng /ml) i de angivne tidsrum, og lysaterne blev immunpræcipiteret og immunoblottet med antistof til PLD. β-catenin blev analyseret ved Western blotting under anvendelse af nukleare lysater (øvre panel). Histogrammer viser relative protein niveauer af pLD1 og PLD2, som er normaliseret til de tilsvarende α-tubulin værdier (lavere panel). (B-C) HCT116-celler blev behandlet med Wnt3a (150 ng /ml), LiCI (20 mM), eller BIO (1 uM) i 24 timer. (B) Protein niveau af plds blev analyseret ved immunopræcipitation og immunblotting. c-Myc og NOS2 ekspression blev analyseret ved Western blotting (øvre panel). Histogrammer viser relative protein niveauer af pLD1 og PLD2, som er normaliseret til de tilsvarende α-tubulin værdier (lavere panel). Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (C) mRNA-niveauer af de angivne gener blev analyseret ved Q-RT-PCR. *

P

0,05

versus

køretøj. (D) De angivne promoter reporter plasmider blev transficeret og behandlet med Wnt3a, LiCI, eller BIO i 12 timer; luciferaseaktivitet blev derefter bestemt. *

P

0,01

versus

køretøj. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. af tre uafhængige forsøg.

LiCl inducerer ekspressionen af ​​PLD isozymer

in vivo

For yderligere at styrke vores resultater, undersøgte vi effekten af ​​blokaden af ​​GSK3p på PLD udtryk

in vivo

. LiCl blev injiceret i mus, og ekspression af PLD blev undersøgt i flere væv under anvendelse af anti-PLD antistof, som genkender både pLD1 og PLD2. Vi har rapporteret om specificiteten af ​​antistoffet til PLD [18], [30]. Som analyseret ved immunopræcipitation og immunoblot, LiCI forøgede proteinniveauer både pLD1 og PLD2 i colon, mave, og levervæv (figur 2A). Som en positiv kontrol, niveauet af β-catenin og NOS2 samt phosphorylering af GSK3p, blev forøget i LiCl-injicerede væv. En komplementær resultat med hensyn til ekspression af plds efter applikation af LiCI blev også opnået ved immunofluorescens i colonvæv (figur 2B). Kerner blev modfarvet ved DAPI. Henviser β-catenin viste et membranagtige farvningsmønster i PBS-injicerede kontrol colon, blev β-catenin steg med LiCI i cytoplasmaet og kernen af ​​celler. PLD-niveauet blev samtidigt forøget i både cytoplasmaet og kernen af ​​celler i LiCl-injicerede colon som β-catenin blev forøget (figur 2B). Tilsammen indikerer disse observationer, at ekspression af både pLD1 og PLD2 forstærkes i væv af LiCl-behandlede mus.

(A) Mus blev injiceret intravenøst ​​med LiCI, som beskrevet i “Materialer og metoder”. Lysater fra forskellige væv blev immunpræcipiteret og immunoblottet med antistof til PLD genkende både pLD1 og PLD2 (venstre panel). Proteinniveauer blev analyseret ved immunblot under anvendelse af de viste antistoffer. Histogrammer viser relative protein niveauer af pLD1 og PLD2, som er normaliseret til de tilsvarende α-tubulin værdier (højre panel). (B) Paraffinsnit af kolon væv blev underkastet immunfluorescens analyser ved anvendelse af anti-β-catenin (Alexa Fluor 488, grøn) og PLD (Alexa Fluor 555; rød) antistof. Væv blev overvåget ved anvendelse Zeiss LSM 510 konfokalt mikroskop. blev observeret mikroskopi felter på × 650 forstørrelse. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

β-catenin og TCF-4 opregulere ekspressionen af ​​PLD isozymer

Vi undersøgte spørgsmålet, om ekspressionen af ​​PLD isozymer eller ikke er faktisk transkriptionelt aktiveret af β-catenin eller TCF-4. Som vist i figur 3

A

, ektopisk ekspression af TCF-4 og en stabil β-catenin mutant (S37A β-catenin), som er ufølsom overfor ubiquitinering af β-catenin, øget transkriptionel aktivering af både pLD1 og PLD2. TCF-4 og stabil β-catenin mutant væsentligt forøget genekspression fra en TCF /LEF specifik luciferasereporterplasmid anvendt som kontrol. Denne induktion blev signifikant reduceret ved tilsætning af en dominant negativ (dn) TCF-4 ekspressionsvektor (ΔN30 TCF-4) (figur 3A). Endvidere analyse ved immunopræcipitation og immunoblot viste, at ektopisk ekspression af β-catenin eller TCF-4 forøgede endogene protein niveauer af pLD1 og PLD2 isozymer i HCT116-celler. TCF-regulerede gener, herunder c-Myc og NOS2, blev også forøget ved ekspression af β-catenin eller TCF-4 (figur 3B). Endvidere transfektion af dnTCF-4 eller udtømning af β-catenin hjælp shRNA reducerede proteinniveauer både PLD isozymer og Wnt målgener i HCT116-celler (figur 3C). Disse resultater viser, at ekspression af PLD isozymer opreguleres både β-catenin og TCF-4. Salg

(A) HCT116-celler blev co-transficeret med pGL4-PLD eller TOP /FOP reportere og de angivne ekspressionsvektorer. *

P

0,01

versus

mock; †

P

0,05

versus

S37A β-catenin /TCF-4. (B) Celler blev transficeret med enten TCF-4 eller β-catenin-ekspressionsvektor, og lysater blev immunfældet eller immunoblottedes med de angivne antistoffer (øvre panel). Histogrammer viser relative protein niveauer af pLD1 og PLD2, som er normaliseret til de tilsvarende α-tubulin værdier (lavere panel). (C) Celler blev transficeret med ΔN30 TCF-4 eller shRNA for β-catenin. Lysater blev analyseret ved immunopræcipitation eller Western blot under anvendelse af de angivne antistoffer (øvre panel). Proteinekspression blev kvantificeret ved densitometer analyse. Histogrammer viser relative protein niveauer af pLD1 og PLD2, som er normaliseret til de tilsvarende α-tubulin værdier (lavere panel). Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

β-catenin og TCF-4 binder til TBE-enheder i PLD2 promotoren og forbedre PLD2 ekspression

En polymorfisme af PLD2 genet har for nylig blevet forbundet med forekomsten af ​​kolorektal carcinom [31]. Desuden blev ekspressionsniveauer af PLD2 detekteret ved real-time PCR under anvendelse 97 colorectalt carcinom væv signifikant korreleret med tumorstørrelse og overlevelse af patienter med colorectal carcinom; Det blev således foreslået, at PLD2 ekspressionsniveauet kunne være en prognostisk indikator i colorektal carcinom [10]. Derfor forsøgte vi at undersøge de områder, der er ansvarlige for Wnt /β-catenin /TCF-4-induceret PLD2 udtryk.

Som vist i figur 4A, den -2180 /+ 491 PLD2 promotor blev transaktiveres af TCF -4 (4,6 gange) eller S37A β-catenin (2,3 gange) proteiner. Sekventielle 5’deletioner af PLD2 promotoren til positioner -1601, -1210 og -784 påvirkede ikke TCF-4- eller S37A β-catenin-medieret transaktivering af PLD2 promotoren (TCF-4, 4,2-fold; p-catenin 2,2 gange aktivering af alle mutanter); dog, sletning af -380 regioner faldt betydeligt TCF-4 eller S37A β-catenin-stimuleret PLD promotor-aktivitet. Således foreslås det, at formodede TCF bindende element (TBE) i positionerne -784 ~ -380 kan være afgørende for PLD2 genregulering af TCF-4 og β-catenin.

(A) Deletionsanalyse af pGL4- PLD2 i HCT116-celler. En skematisk repræsentation af pGL4-PLD2 reporterkonstruktioner er vist. Celler blev cotransficeret med pGL4-PLD2 og de angivne ekspressionsvektorer, efterfulgt af bestemmelse af luciferaseaktivitet. (B) Skematisk fremstilling af -2180 til +491 område af det humane PLD2 promotoren. Tallene over linierne refererer til transkriptionsstartsitet af

PLD2

gen (+1). To formodede bindingssteder for TCF-4 er angivet på sekvensen (pilene angiver retningen). (C) HCT 116-celler blev transficeret med luciferase- reporterplasmidet indeholdt vildtype (wt) PLD2 promotor, en eller dobbelt TBE mutantformer (MT) af PLD2 promotor og behandlet med Wnt3a (150 ng /ml) eller BIO (1 uM). Luciferaseaktiviteter blev målt. *

P

0,05

versus

wtTBE /Wnt3a; †

P

0,01

versus

wtTBE /BIO. (D) Celler blev co-transficeret med de anførte ekspressionsvektorer, sammen med de wt eller TBE mutantformer af den PLD2 promotoren. Luciferaseaktiviteter blev målt. *

P

0,05

versus

transficeret med wtTBE /β-catenin; †

P

0,05

versus

wtTBE /TCF4; **

P

0,05

versus

transficeret med wtTBE /β-catenin /TCF4. (E) Pile angiver placeringen af ​​primere anvendt i chippen eksperimentet. Chippen assay blev udført under anvendelse af præimmun IgG, anti-β-catenin, eller anti-HDAC1 antistof og analyseret ved Q-RT-PCR. Som en positiv kontrol blev udført chipanalyse af NOS2 promotoren indeholdende TBE. *

P

0,05

versus

β-catenin /køretøj; †

P

0,05

versus

HDAC1 /køretøj. Data er repræsentative for fire uafhængige forsøg. (F) Skematisk diagram til sammenligning af TBE-enheder på PLD2 promotorregioner fra forskellige arter. TCF-4 bindende elementer i 5′-flankerende regioner af den humane PLD2 transskriptionsstartstedet (TSS) blev sammenlignet med dem af genomerne fra 4 forskellige arter. En kerne

motiv

, CTTTG (A /T) (A /T) [eller den komplementære sekvens (A /T) (A /T) CAAAG] af TCF bindende sekvenser på PLD2 promotor er yderst

konserveret

tværs af arter.

som vist i figur 4B, sekvensanalyse af 5′-flankerende sekvens af PLD2 genet identificeret to formodede TBE-enheder (betegnet som TBE1 og TBE2). TBE1 (ATGAAAG) er placeret -512 b opstrøms, og indeholder en næsten omvendt match med konsensus CTTTG (A /T) (A /T) sekvens for TCF-4 binding [32]; TBE2 (CTTTCAT) blev placeret -497 b opstrøms og næsten matchede konsensus sekvens (tabel S2) [33].

For at undersøge den funktionelle betydning af TBE motiv i reguleringen af ​​PLD2 gentranskription, stedorienteret mutation af TBE sites blev genereret i forbindelse med en PLD2 promotor. Mutation i TBE1 eller TBE2 stedet faldt betydeligt Wnt3a-induceret PLD2 promotor-aktivitet i HCT116 celler (Figur 4C). Mutationer af både TBE1 og TBE2 sites (TBE1 /2) dramatisk undertrykt Wnt3a-stimuleret PLD2 promotor-aktivitet. Desuden TCF-4 og /eller β-catenin-induceret PLD2 promotoraktivitet blev også afskaffet når TBE1 og TBE2 var muteret (figur 4D). Disse data tyder på, at PLD2 promotoren er et mål for TCF /β-cateninkomplekset via sin konsensus TBE.

Desuden vi derefter udført en kromatin immunofældning (chip) assay i HCT116 celler for at bekræfte

i vivo

binding af β-catenin /TCF-4 til PLD2 promotoren. DNA-β-catenin /TCF-4-komplekser blev immunpræcipiteret med antistoffer, der er vist i figur 4E, efterfulgt af reversering af tværbinding og Q-RT-PCR under anvendelse af primere, som omgiver både TBE1 og TBE2, som er placeret i proximal stilling til hinanden. Som vist i figur 4E, oprenset rekombinant Wnt3a forøget binding af β-catenin /TCF-4 til begge TBE-enheder i PLD2 promotoren. Disse resultater er sammenlignelige med de for promotoren assay under anvendelse af mutagenese. Wnt signaling mål p-catenin til chromatin til fjernelse af co-repressorkomplekset HDAC1 (histon deacetylase 1) [34]. Som forventet, Wnt3a undertrykt signifikant binding af β-catenin til to TBE-enheder i PLD2 promotoren efter chippen assay under anvendelse af anti-HDAC1 antistof. Desuden fandt vi, at TCF bindende sites på PLD2 promotor er bevaret på tværs af arter (Figur 4F). Taget sammen viser disse data, at PLD2 genet er et direkte transkriptionel mål af β-catenin /TCF signalering in vivo.

PLD isozymer er nødvendige til dannelse af β-catenin /TCF-4-kompleks og fremme af β-catenin /TCF transkriptionsaktivitet

Vi undersøgte spørgsmålet om, hvorvidt Wnt signalering-induceret plds opregulering kan modulere β-catenin-afhængige TCF transkriptionel aktivitet via en positiv spiral. Ektopisk ekspression af en konstitutiv aktiv mutant af β-catenin øget TCF transkriptionsaktivitet i HCT116 colon cancerceller (figur 5A). Selektive PLD-inhibitorer er for nylig blevet udviklet [35], [36].