PLoS ONE: En Quest for miRNA Bio-Marker: En Track Back Approach fra gingivo Buccal Kræft til to forskellige typer af Precancers

Abstrakte

Deregulering af miRNA udtryk kan bidrage til tumorigenese og andre patofysiologi i forbindelse med kræft. Brug TLDA, udtryk af 762 miRNA blev kontrolleret i 18 par gingivo buccale kræft-tilstødende kontrol væv. Angivelse af markant deregulerede miRNA blev yderligere valideret i kræft og undersøgt i to typer af præcancer (leukoplakia og lichen planus) væv ved primer-specifikke TaqMan analyser. Biologiske konsekvenser af disse miRNA blev vurderet bioinformatically. Angivelse af

HSA-miR-1293, HSA-miR-31, HSA-miR-31 *

HSA-miR-7

var signifikant opreguleret og de af

HSA -miR-206, HSA-miR-204

og

HSA-miR-133a

var signifikant nedreguleret i alle kræft prøver. Angivelse af kun

HSA-miR

-31 var signifikant opreguleret i leukoplakia men ingen i lichen planus prøver. Analyse af ekspression heterogenitet opdelt 18 cancer prøver i klynger på henholdsvis 13 og 5 prøver og afslørede, at ekspression af 30 miRNA (herunder de ovennævnte 7 miRNA), var signifikant dereguleret i klyngen af ​​13 prøver. Fra database minedrift og sti analyse blev det observeret, at disse miRNA væsentligt kan målrette mange af de gener, der er til stede i forskellige kræftrelaterede veje såsom “proteoglycaner i kræft”,

PI3K-AKT

etc., som spiller en vigtig rolle i udtryk af forskellige molekylære karakteristika ved cancer. Angivelse af

HSA-miR-31

var signifikant opreguleret i både kræft og leukoplakia væv og dermed kan være en af ​​de molekylære markører for leukoplakia der kan udvikle sig til gingivo-buccal kræft.

Henvisning: De Sarkar N, Roy R, Mitra JK, Ghose S, Chakraborty A, Paul RR, et al. (2014) En Quest for miRNA Bio-Marker: En Track Back Approach fra gingivo Buccal Kræft til to forskellige typer af Precancers. PLoS ONE 9 (8): e104839. doi: 10,1371 /journal.pone.0104839

Redaktør: Ratna B. Ray, Saint Louis University, USA

Modtaget: April 5, 2014 Accepteret: 15 Juli 2014; Udgivet: 15 August, 2014

Copyright: © 2014 De Sarkar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Alle bevillinger kom fra Institut for bioteknologisk, Indiens regering og indiske statistiske institut til Prof. Bidyut Roy. Den bidragyder har ingen rolle i studie design, dataindsamling, analyse, beslutning om at offentliggøre og manuskript forberedelse

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

gingivo buccal pladecellekræft (GBSCC) er en af ​​de mest udbredte (-60%) kræftformer i mundhulen, især blandt tobak brugere i Indien. Hele sæt af hoved og hals pladecellekræft står som den femte mest almindelige malignitet verdensplan [1]. Men hoved og halscancer omfatter ~24% af de samlede kræfttilfælde i Indien som er optaget på et tertiært hospital, Tata Memorial Center, Mumbai og omkring ~13.5% af dem er fra den mundtlige [2] hulrum. Fem år overlevelsesraten (-50%) af patienter, der lider hoved og hals pladecellekræft er ikke forbedret meget, selv efter intens forskning i sidste 15 år, så, tidlig påvisning er stadig et centralt spørgsmål for bedre overlevelse [3].

Siden 1993, miRNA har vist sig at være en af ​​de mest fremtrædende biologiske regulatorer, som spiller en vigtig rolle i at kontrollere og finjustering sin målets (mRNA) udtryk [4] – [9]. I de senere år er det blevet påvist, at microRNA (miRNA) også er involveret i human tumorgenese og kunne fungere enten som tumorgene /onkogene eller anti-tumorigene molekyler. Det er således gør et nyt lag i de molekylære begivenheder i human cancer. Genekspression undersøgelser viste, at mange miRNA er dereguleret i forskellige typer kræft og funktionelle undersøgelser klart, at miRNA er involveret i flere molekylære og biologiske processer, der driver tumorigenese [10] – [12]. Således, ud over forskellige skalaer af variabilitet med hensyn til nye mutationer i genomet eller genetisk baggrund af patienterne (dvs. kønscellerne mutation), variation i ekspression af forskellige miRNA er også et vigtigt aspekt for undersøgelsen. Med denne tro, vi studerede udtryk deregulering af 762 miRNA i GBSCC og også kontrolleret, om lignende slags udtryk deregulering kunne observeres i præcancerøse leukoplakia og lichen planus væv fra mundhulen. Der er gjort en indsats for at forstå, hvordan disse miRNA kan være involveret i kræft ved hjælp pathway analyse og information fra lit

e

ratures og databaser.

Materialer og metoder

Prøver

Denne undersøgelse blev godkendt af “Review komité for beskyttelse af forskningen risiko for mennesker, indiske statistiske institut”. Alle personer i denne undersøgelse har givet skriftligt informeret samtykke til at offentliggøre case detaljer. Alle deltagere underskrevet en spørgeskema med demografi, tobak vane og en redegørelse, at han /hun ikke har nogen indvendinger til anvendelse af blod og vævsprøver i denne undersøgelse, og deltager i denne undersøgelse frivilligt. Uafhængige patienter, der lider af kræft (n = 18), lichen planus (n = 12) og leukoplakia (n = 18) blev anset for denne undersøgelse fra Guru Nanak Institute of Dental videnskab og forskning, Panihati, Kolkata, (tabel 1, tabel 2 , tabel 3). Et væv punch fra cancer /præcancer stedet og en anden punch fra tilstødende “klinisk” normal websted (mindst 1,5 tommer væk fra grænsen af ​​læsionen) blev biopsi ved oral patolog. En portion af biopsi væv blev anvendt til histopatologisk bekræftelse og resterende del af væv blev holdt separat i “RNA senere” ved -80 ° C og anvendes inden for 2 måneder. Vejviser

RNA isolation og TLDA assay

RNA-isolering blev udført ved anvendelse Mirvana kittet (Life Technologies, USA). RNA udbytte kvantificering blev gjort ved Nano Drop og integritet blev kontrolleret med Agilient s Bioanalyzer (Agilent RNA6000 Nano Kit), hhv. RIN nummer cut-off blev valgt som ≥6.9. Parallel ekspression assay af 762 miRNA blev udført under anvendelse TLDA-A (V2) og TLDA-B (V3) kort i 7900HT FAST Real Time PCR-system (Applied Biosystems, USA) under anvendelse TLDA flad blok [13]. Primær analyse blev udført ved hjælp af SDS og data Assist (Life Technologies, USA) softwarepakker at få udtryk i form af Ct, ACt og ΔΔCt værdier hvor Ct = Cycles, hvor PCR-produktet mængde når et bestemt tærskel, ACt = Ct

af en miRNA i kræftvæv – Ct

af geometriske gennemsnit af ekspressionen af ​​3 mest stabile endogene kontrol miRNA i at vævs- og ΔΔCt = ACt

af en miRNA i kræftvæv – ACt

af at miRNA i kontrol væv . Ud af de analyserede 762 miRNA, fem var kandidater til endogene kontrol. Men på grundlag af deres udtryk stabilitet på tværs af alle prøver, RNU-48, RNU-44 og U6 /mmu-6 blev valgt som endogene kontrol. For at få ACt som normaliseret mål for udtryk for en miRNA i begge kræft /præcancer og kontrol væv, blev udtryk for alle miRNA i væv normaliseret uafhængigt hjælp geometriske gennemsnit af ekspressionen af ​​udvalgte 3 endogene kontrol miRNA i samme væv. Ct-værdi mindre end 40 kun blev anset for yderligere analyse.

Analyse

Data Beskæring.

Hvis der blev observeret udtryk for en bestemt miRNA at være til stede i at-mindst 9 ud af 18 kræft-normal parrede væv, da kun, det har været overvejet til yderligere nedstrøms analyse. Annotation af TLDA assay V2 (A-kort) og V3 (B-kort) følger miRBase frigivelse-14 [13] – [14]. Nu blev udtryk data i disse miRNA i betragtning til yderligere analyse, hvis annotation stadig er gyldig i miRBase frigive-19 [15] – [16]. På denne måde udtryk for 531 miRNA blev anset for efterfølgende downstream-analyse.

Statistisk analyse.

I første omgang en prøve Kolmogorov-Smirnov (KS) test for udtryk data fra alle 531 gener blev udføres selvstændigt, således at kontrollere for normalitet af den differentierede udtryk værdier på tværs af alle prøver [(Zi = {(Ci-Ni) – (middelværdi C- gennemsnitlig N)}, så Zp = ΣZi /SD Z, KS testen blev udført på Zp Ci: i

th Cancer prøvens ACt-værdi, Ni: i

th Normal prøves ACt value] og til sidst udtryk viste sig at være normalfordelt Det skal bemærkes, at ACt-værdier allerede log forvandlet, så. ., ikke yderligere log-transformation blev udført med dette sæt af udtryk data Efterfulgt af normalitet test blev ensidet parret t-test [(Ci-Ni) 1 / 1]. nulhypotesen af ​​ensidet parret t -test var “udtryk for en bestemt miRNA er ikke større end to fold op /ned reguleret” Så naturligvis, alternativ hypotese var “udtryk for en bestemt miRNA er . 2 fold op /ned reguleret. Test for opregulering (lavere hale test) blev udført, hvis medianen for en bestemt miRNA s ΔΔCt er mindre end nul. Tilsvarende test for nedregulering blev udført, hvis medianen af ​​en bestemt miRNA s ΔΔCt er mere end nul. Flere test korrektioner ved hjælp Benjamini-Hochberg metoden blev udført på 5% signifikansniveau [17] og korrigeret afskåret p-værdi var 0,00065.

Cluster Analyse af miRNA udtrykt i cancer væv.

K-median klyngedannelse metode blev anvendt for hele beskåret datasættet for at se, om genom bred miRNA ekspressions variationer mellem individer var stort nok til pålideligt opdele prøverne i et antal sub klynger. Til denne gruppering, valgt afstand metriske var euklidisk. Da udtryk for mange miRNA var fraværende i vores datasæt, blev det skaber “Fraværende data” situation. Denne situation er kendt for bias klyngedannelse, hvis de mest populære clustering metoder, som National- K-midler blev vedtaget. Så valget af klyngedannelse var K-median. Antallet af pålidelige klynger, dataene vil danne, blev bestemt ved anvendelse metode “albuen”.

TaqMan analysen.

Angivelse af markant deregulerede miRNA, detekteret i cancer væv ved TLDA metode , blev også valideret i samme kræft væv og undersøgt i leukoplakia og lichen planus væv ved TaqMan assay (7900HT Hurtig Real Time PCR-system, Applied Biosystems, USA). Sonder og primere blev leveret af Invitrogen India Ltd og data blev hentet som “fold ændring” i forhold til tilstødende kontroller. Normalisering af ekspression af hvert gen i hver prøve blev udført ved anvendelse geometriske gennemsnit af de samme 3 endogene kontroller, nemlig.

RNU-44, RNU-48

og

MMU-6

, at få ΔΔCt værdien af ​​denne miRNA.

Resultater

Expression profil i cancer væv af TLDA

Expression data for 762 miRNA blev analyseret ved denne metode, men efter data beskæring blev udtryk data fra 531 miRNA (herunder 5 endogene kontrol), der anvendes til andre downstream-analyse (File S1). Under statistisk test blev mindst 2-fold ekspression ændring i cancervæv sammenlignet med dets parrede-kontrolvæv betragtes som bench-mærket af ekspression deregulering. Således blev fundet udtryk for 7 miRNA skal dereguleret markant efter flere test korrektion og alle disse syv miRNA havde 4-fold gennemsnitlig udtryk deregulering (dvs. enten op- eller nedregulering). Validering af udtryk af miRNA specifik TaqMan assay bekræftede også udtryk deregulering i kræft væv selvom fold-ændringer blev formindsket i forhold til TLDA udfald (tabel 4). Forskellen i følsomhed af disse to RT-PCR-(TLDA og miR-specifikke TaqMan Assay) eksperimentelle metoder, kombineret med det faktum, at disse to sæt eksperimenter blev udført på to forskellige tidspunkter, kan være de påvirkende faktorer for forskel i grader udtryk deregulering af miRNA. Relative placeringer af disse 7 miRNA sammen med andre miRNA gener på tværs af forskellige kromosomer viste, at

HSA-miR-133a

og

HSA

–

mir-7

er placeret på to ( chr 18 og chr 20) og tre kromosomer (chr 9, Chr 15 og chr 19), henholdsvis (figur 1a). Her blev analyser udføres kun modne miRNA, dermed udtryk for

HSA-miR-133a

HSA

–

mir-7

kan være kumulative sum af alle modne former af respektive miRNA. Blandt disse 7 miRNA, udtryk for 4 miRNA nemlig.

HSA-miR-1293, HSA-miR-31, HSA-miR-31 *

HSA-miR-7

var signifikant opreguleret og de af 3 miRNA nemlig.

HSA-miR-206, HSA-miR-204

og

HSA-miR-133a

var signifikant nedreguleret i prøver kræft (tabel 4). Heat map blev bygget efter to måder uden opsyn hierarkisk klyngedannelse. Så alle nedreguleres miRNA samlet i en klynge i den øvre del af plottet hvorimod alle opregulerede miRNA grupperet i bunden (figur 1b). Det viste værdier af udtryk (dvs. ΔΔCt) sammenlignet med tilstødende kontrol samt antallet af prøver, der leverer udtryk data. Angivelse af

HSA-mir-1293

blev opnået fra 9 kræft-kontrol parrede prøver, men seks af dem havde ΔΔCt værdier ≤-2 og de resterende 3 prøver havde ΔΔCt værdier mellem 0 og -2. Så for

HSA-mir-1293

, alle disse 9 prøver havde ΔΔCt værdier med ve tegn, hvilket betyder; når ekspression blev opnået, er det altid opreguleres men 6 af dem viste mere end 4 gange ekspression forandring. Tilsvarende udtryk data for

HSA-mir-31 *

blev opnået fra 16 kræft-kontrol parrede prøver. Ud af disse 16 prøver, en prøve havde ΔΔCt mellem 0 +2, To prøver havde ΔΔCt værdier mellem 0 -2 Og de resterende 13 prøver havde ΔΔCt værdier ≤-2

A:. Manhattan plot af p-værdier for alle 528 miRNA 18 prøver. AB-linie (dvs. vandret linje i midten af ​​figuren) betegner P-værdi afskåret, p = 0,00065. Relativ placering af 528 miRNA (langs den vandrette akse) på tværs det menneskelige genom og deres tilsvarende -log

10 forvandlet p-værdi (langs den lodrette akse) blev plottet. B: Heat map diagram af ΔΔCt værdier. Tovejs opsyn hierarkisk gruppering af 7 miRNA hvis udtryk var signifikant deregulerede prøver. Hver række repræsenterer ekspression af et miRNA og hver kolonne repræsenterer en prøve. Sky-blå farvede celler står for mislykkedes assay dvs. ingen data i disse celler. Røde og grønne farver betyde op- og nedregulering, hhv. Dendogram langs den lodrette akse repræsenterer hierarkisk klassificering af miRNA på grundlag af udtryk lighed. Afstand målinger af hierarkisk klyngedannelse var euklidiske afstand. Heat map blev bygget ved hjælp af Heatmap 2 af R ‘s “gplot” pakke. C:. Højt korreleret udtryk for

miR-206

og

MIR-1 Vejviser

Normaliseret udtryk (ACt) af disse 7 miRNA i kræft og kontrol væv var for det meste ikke-overlappende og ACt-værdier af forskellige miRNA over reguleringsventilen væv viste også ganske bredt variationsområde (figur 2). Så for at få korrekte relative ekspression, er det vigtigt at sammenligne ekspression af miRNA i cancervæv med de kontrol væv fra det samme individ. I denne figur blev miRNA placeret efter stigende p-værdier (fra top til bund) vertikalt. De ACt-værdier på 8 miRNA i forskellige tumor- og kontrolprøver var blevet afsat på den vandrette akse for at vise fordelingen af ​​ACt-værdier på tværs af alle prøverne. Det er klart, at mere overlapningen mellem intervaller af ekspression af miRNA i cancer og kontrol væv, mindre er signifikansniveauet. Her,

HSA-mir1293

med laveste p-værdi 0,000028 var blevet anbragt på toppen og

HSA-mir-1

med p-værdi på 0.00094 (lige under det korrigerede signifikansniveau) anbringes nederst på den lodrette akse (figur 2).

vandret boxplot er vist for fordeling af ekspression (ACt) af miRNA langs den vandrette akse. P-værdier for miRNA er plottet i stigende rækkefølge (top til bund). Angivelse af

har-miR-1

ikke signifikant dereguleret og vist at sammenligne med andre 7 miRNA. Hver Box og knurhår par (Gray for Cancer og hvidt for Normal) repræsenterer vifte af variabilitet ACt værdier for en miRNA fra TLDA data. Denne serie repræsenterer udtryk for alle held analyseres prøver data for denne miRNA.

Angivelse af miRNA i præcancerøse leukoplakia og lichen planus prøver

Blandt 7 miRNA, som blev observeret at være signifikant dereguleret i cancer prøver (tabel 4), udtryk for kun

miR-31

var signifikant opreguleret i leukoplakia væv, hvor som udtryk for ingen af ​​disse 7 miRNA blev liberaliseret betydeligt i lichen planus væv. Angivelse af

miR-31 *

miR-204

var også op- (4,75 folder) og nedreguleret (1,99 folder), henholdsvis i leukoplakia væv, men ikke signifikant forskellig.

Database minedrift og bioinformatik analyser

Offentliggjorte rapporter om disse 7 miRNA havde også vist lignende retning udtryk deregulering i visse kræftformer, herunder hoved og hals [10], [18] – [20]. I alt 561 unikke mål blev identificeret, når disse 7 miRNA blev brugt til at søge målene ved hjælp miRWalk [21] og videre tværs valideret fra Pubmed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed).

HSA-miR-31 *

har valideret target,

RhoA

, som efter sigende impliceret i munden neoplasma [18].

HSA-miR-1293

indtil nu er kendt for at målrette

GCN1L1

(tabel 5) og

HSA-miR-1293

medieret nedregulering af denne tumor antigen gen ( dvs.

GCN1L1

) kunne bidrage til dårlig prognose af tumor [22]. IPA værktøj blev brugt til “sygdom sigt search” (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) og mest betydningsfulde “sygdom udtrykket” i kræft kategori af IPA var “hoved og hals” kræft. IPA kunne ikke give nogen ramt af

HSA-miR-1293

betragtes

HSA-miR-31

og

HSA-miR-31 *

som synonym så produktionen var fra 5 miRNA. Det blev også bemærket, at IPA betragtes

HSA-miR-206

synonym til

HSA-miR-1

da de har identiske frø sekvens [23]. Det blev også bemærket, at udtrykket deregulering status

HSA-miR-1

og

HSA-miR-206

tværs prøverne var meget lig hinanden (r = 0,94) (Figur 1c) . Inddragelse af

HSA-miR-1

i mål søgelisten øget antallet af mål til 702. I Kegg pathway kortlægning portal [24] – [25] validerede mål for disse 8 miRNA er blevet brugt. Top fleste veje i det kortlagte liste var “microRNA i kræft” efterfulgt af “proteoglycaner i kræft” og “kræft global sti” (tabel S1 i File S2). Andre top relevant vej var

PI3K-AKT

som er en af ​​de mest almindelige veje impliceret i kræft. Andre mest markante ændringer, der kunne være sket på grund af disse miRNA er afbrydelse af aktincytoskelettet vedligeholdelse og fokal vedhæftning. Andre sandsynlige impliceret signalveje var

RAS

,

RAP1, MAPK, HIF-1

,

FOXO, TNF, erbB

, apoptose etc. (tabel S1 i File S2). “GO” term berigelse Søgningen blev udført under anvendelse af input af 702 validerede targets af disse otte miRNA (data ikke vist), og det blev observeret, at mest fremtrædende forstyrret biologiske processer er primært relateret til cellemigrering, tab af apoptose, celleproliferation etc. Men DAVID baserede “GO” term berigelse for biologisk proces viste mest fremtrædende biologisk proces er “Apoptose” (tabel S2 i File S2) [26] – [28]. Alle disse observationer støtter, at disse 8 miRNA kan spille vigtige funktionelle roller i gingivo buccal kræft. Vores RNA-Seq data viser, at ekspressionen af ​​

FN1, MSN

MMP9

, som tilhører “Proteoglycaner i kræft” gen liste og er mål for down-regulerede miRNA, blev opreguleret i 10 af 13 vævsprøver (i gennemsnit, 6,83, 2,43 og 21,89 folder, sammenlignet med tilstødende normal). Tilsvarende forudsagt opregulering af

LAMC

nedregulering af

PAI

, der hører til

PI3K-AKT

vej, blev også valideret i RNA-Seq data i en sub sæt med disse vævsprøver (upublicerede data). Disse observationer understøtter også vores prædiktive pathway analyse vedrørende involverede biologiske proces /veje, der kunne blive ramt af dette sæt af 8 miRNA.

Udvalgte prøver havde lidt variation i form af dens differentiering status eller klinisk iscenesættelse. Cluster analyse blev udført for at kontrollere, om genom bred miRNA profil kunne forklare den pågældende egenskab variation. Den blev udført ved hjælp af udtryk deregulering data (ΔΔCt) af 531 miRNA fra 18 kræft prøver ved hjælp af K-median metode. Optimalt opnåedes kun to adskilte klynger; én bestod af 13 parrede tumor-normal prøver og anden bestod af 5 parrede tumor-normal prøver. Det var tydeligt, at disse to klynger af prøverne ikke blev dannet på grundlag af deres differentiering status eller kliniske stadier. Ekspression af 30 miRNA signifikant dereguleret i klyngen af ​​13 prøver (p-værdi afskåret 0,00298 efter Benjamini-Hochberg Correction, figur 3a, 3b), men ingen af ​​miRNA var signifikant dereguleret i klyngen af ​​5 prøver (data ikke vist ). Fold ekspression (op- eller nedreguleres) af en miRNA i en tumorvæv sammenlignet med dens tilstødende kontrol og antal prøver, der leverer udtryk data af en miRNA kunne observeres i Heat kort diagrammer over klynge af 13 prøver (figur 3b). Den viste, at ekspressionen af ​​alle miRNA ikke var tilgængelige fra alle prøver. Ekspression af nogle miRNA var opreguleret i de fleste af prøverne (f.eks ekspression af

MIR-31 *, MIR-7, MIR-21

vist nederst i figuren) og ekspression af nogle miRNA var ned -regulated i de fleste af prøverne (f.eks

miR-206, miR-1, miR-133a

vist i midten af ​​figuren) (figur 3b)

A:. Manhattan plot af p-værdier for 520 miRNA fra klyngen af ​​13 prøver. Plottet i relative placering af 520 miRNA (langs den vandrette akse) på tværs af menneskelige kromosom og deres tilsvarende -log

10 forvandlet p-værdi (langs den lodrette akse). Benjamini-Hochberg korrigerede P-værdi afbrød var 0,00298 (vandret linje i midten af ​​figuren). B: Heat map diagram af ΔΔCt værdier på 30 miRNA. Ekspression af disse miRNA blev signifikant dereguleret i klyngen af ​​13 prøver. Hver række repræsenterer et miRNA og hver kolonne repræsenterer en prøve. Sky-blå farvede celler står for mislykkedes assay (i.e.no data i disse celler). Røde og grønne farver tilkendegiver op- og nedregulering af udtryk, hhv. Heat map blev bygget ved hjælp af Heatmap 2 af R ‘s “gplot” pakke. C:. Highly korreleret udtryk for miR-411 * og miR-411

Ud af disse 30 miRNA (tabel 6), udtryk for 28 miRNA viste lignende udtryk deregulering mønster som det allerede blev rapporteret i tidligere undersøgelser af kræft [10], [29] – [30]. Af de resterende to miRNA, en miRNA

(HSA-miR-770-5p

) er ikke blevet endnu forbundet med nogen kræft. Angivelse af resterende miRNA (

HSA-miR-211

) er blevet dereguleret i modsat retning i denne undersøgelse i forhold til tidligere rapporter om kolorektal cancer [29] – [30]. Faktisk, 7 miRNA, hvis udtryk var signifikant dereguleret i analysen af ​​18 prøver, er en delmængde af disse 30 miRNA. Imidlertid blev observeret udtryk for

HSA-miR-411 *

at være signifikant dereguleret i denne undersøgelse, men ingen tidligere rapport havde vist sit engagement med kræft. Igen er det kendt, at

HSA-MIR-411

MIR-411 *

er stammede fra den samme precursor miRNA og

HSA-MIR-411

har en stærk forbindelse med kræft [31]. Når vi kontrolleres udtryk for moden

HSA-miR-411

HSA-miR-411 *

, en stærk positiv korrelation blev observeret (r = 0,95) (Figur 3c), selv udtryk for

HSA-miR-411

blev ikke fundet at være statistisk signifikant. Ligeledes har vi observeret signifikant udtryk deregulering af

HSA-miR-135b *

HSA

-miR-99a * og rapporter om sammenslutning af kræft med

HSA-miR-135b

og

HSA

–

miR-99a

[32]. Søgning i lignende måde blev 1207 unikke målgener opnået for disse 30 miRNA. IPA og Kegg kortlægning blev udført ved anvendelse af disse 30 miRNA og deres kendte 1207 målgener. I IPA-analyse, tre cancere, som viste sig at være associeret med ekspression deregulering af en større delmængde af disse miRNA, var hypo svælg, esophageal og hoved- og halscancer (p-værdier 1,71 × 10

-07, 2,20 × 10

-07 og 1,02 × 10

-07 henholdsvis). Interessant, blev rapporteret samme biologiske signalveje (relevante for kræft) at være involveret med disse sæt af 30 miRNA som det blev observeret med 8 miRNA tidligere. Men forskellen ligger i det repertoire og antallet af målrettede knudepunkter for alle disse veje (tabel S1 i File S2, tabel S2 i File S2, tabel S3 i File S2 og tabel S4 i File S2).

diskussion og konklusioner

udtryk for 7 miRNA var signifikant dereguleret i 18 kræft prøver og signifikant opregulering af

HSA-miR-1293

bliver rapporteret for første gang i gingivo buccal cancer ( tabel 4). Hvad nu, funktionelle rolle af

HSA-miR-1293

i kræft er meget begrænset. Ifølge miRWalk [21] og starbase [33], en af ​​de forudsagte mål for

HSA-miR-1293

er

MAPK14

(p38), som har vist sig at være forbundet med tumor følsomhed til

cis

-platin behandling [34]. Hvis dette forudsagte forhold kunne valideres, kan så udtryk for denne miRNA være nyttig i forudsigelse af patientens følsomhed over for

cis

-platin behandling. To miRNA,

HSA-miR-206

og

HSA-miR-1

, er kendt for at spille anti-tumorigen rolle [35] – [37] og

HSA-miR-

206 kan indirekte aktivere apoptose, inhibering af cellemigration og fokus dannelse [38]. Nedregulering af ekspressionen af ​​

HSA-miR-1

og

HSA-miR-133a

, som er blevet observeret i denne undersøgelse (tabel 5), er allerede blevet rapporteret i en tidligere undersøgelse med oral pladecellecarcinom [39]. Faktisk,

HSA-miR-133a

mål flere onkogener og er rapporteret at være almindeligt nedreguleret i en række andre orale undersøgelser kræft [35] – [40]. Ekspression af både

HSA-miR-31

og

HSA-miR-31 *

blev rapporteret i nogle tidligere undersøgelse om kræft [41] – [42]. Undersøgelse af OSCC cellelinje viste, at eksogen levering af

pre-mir-31

, hvilket øger op mængden af ​​kønsmodne

HSA-miR-31

og

HSA-miR-31 *

, forstærket OSCC onkogenicitetsstudie [41] – [42]. Derfor vores observation af opregulering af

HSA-miR-31

og

HSA-miR-31 *

, bestyrker med eksisterende rapporter om mundtlige og andre kræftformer. Svarende til en tidligere rapport om hoved- og halscancer, her også, udtryk for

HSA-miR-204

blev også fundet at være signifikant nedreguleret [43]. Angivelse af

HSA-miR-7

, en kendt OncomiR, er efter sigende opreguleret i OSCC [44]. Det henvender sig primært tumor suppressor udskrifter fra

RECK

[16]. I denne undersøgelse, udtryk for

HSA-miR-7

var også signifikant opreguleret og dermed bekræfter med tidligere resultater relateret til kræft i mundhulen. Der er gjort en indsats for at forstå mulige biologiske konsekvenser ved minedrift forskellige databaser. Pathway analyse afslørede, at de fleste forstyrret biologiske processer ville være cellemigrering, apoptose og proliferation (tabel S2 i File S2). Mest forstyrret veje blev forudsagt at være “proteoglycaner i kræft”, og

PI3K-AKT

(tabel S1 i File S2), som også understøttes af vores RNA-Seq data om udtryk deregulering af nogle proteoglycan gener og

LAMC

PAI

som tilhører

PI3K-AKT

pathway (upublicerede data). Disse observationer understøtter også vores prædiktive pathway analyse vedrørende involverede biologiske proces /veje, der kunne blive ramt af dette sæt af 8 miRNA.

Cluster analyse af 18 prøver havde vist, at ekspressionen af ​​30 miRNA viste sig at være betydeligt dereguleret i klyngen af ​​13 prøver (figur 3b). Litteratursøgning og database minedrift med disse 30 miRNA viste relevans af disse gener med mundtlige og andre kræftformer (tabel 6). Selv pathway analyse ved hjælp 8 miRNA (identificeret fra udtryk data fra 18 prøver) og 30 miRNA (identificeret fra udtryk data fra klynge af 13 prøver) indsnævret til lignende signalveje men antallet og repertoire af knuder ramt af disse sæt af miRNA er helt forskellige (data ikke vist). Denne klyngeanalyse er faktisk afslører eksistensen af ​​molekylære heterogenitet, der kan tygge op beslutning om at finde finere molekylær markør. Interessant, observerede molekylære heterogenitet mønster på ingen måde relateret til differentiering undertype, der eksisterer inden for de væv eller kliniske stadier af prøver.

Blandt to pre-kræft, er leukoplakia kendt for at være forbundet med tobak vane, mens lichen planus er en auto immun sygdom. Det forlyder, at alle mundtlige kræft indledes med forstadier til kræft. Så vi kontrolleret, om, svarende til prøver kræft, kunne udtryk deregulering af miRNA observeres i disse to forstadier til kræft. Her viste TaqMan data, at ekspression af kun

HSA-mir-31

var signifikant opreguleret (4,55 gange mere end tilstødende kontrol væv) i leukoplakia prøver (tabel 4), men ikke i lichen planus væv. Selvom udtryk for en anden miRNA,

HSA-mir-31 *

, var også opreguleret af 4,75 folder men væsentligt ikke anderledes på grund af en større standardafvigelse blandt prøver. Så skal kontrolleres i flere leukoplakia prøver udtryk for disse to miRNA. Denne gang gentager om molekylær nærhed leukoplakia med GBSCC end andre præ-kræft, lichen planus. Så udtryk for

HSA-mir-31 og HSA-mir-31 *

i leukoplakia væv kunne være potentielle risiko-markører for progression af præcancer til GBSCC.

Lille nummer og blandet fase af tumor prøver og udtryk assay på kun 762 miRNA ved TLDA (findes på tidspunktet for vores eksperiment) begrænset denne undersøgelse for at udlede, at ekspressionen af ​​kun 7 miRNA var signifikant liberaliseret i GBSCC væv i forhold til tilstødende kontrol væv. Der er stor chance at antallet af deregulerede miRNA vil stige, hvis vi kunne analysere ekspression af ~2578 miRNA tiden kendte i humant væv som nævnt i miRBase-20 [45]. Som et resultat, kan udtryk for flere miRNA er blevet kontrolleret i kræft og leukoplakia væv til at udlede mere om molekylære markører. Endnu vigtigere er, er rolle disse miRNA i carcinogenese skal valideres ved funktionel undersøgelse.

Støtte Information

File S1.

Genome bred miRNA udtryk profil for 528 miRNA (ekskl 3 endogene kontroller) i GBSCC. Hver kolonne fra S1 til S24 repræsenterer data for 18 prøver, hver række repræsenterer data for ΔΔCt af en specifik miRNA. N /A repræsenterer ingen data

doi:. 10,1371 /journal.pone.0104839.s001

(XLSX)

File S2.

Indeholder supplerende tabeller

doi:. 10,1371 /journal.pone.0104839.s002

(DOCX)

Tak

Vi hjerteligt takke Dr. Analabha Basu og Dr. Saurabh Ghosh til vurdering af egnetheden af ​​statistiske metoder, der anvendes i denne undersøgelse.