PLoS ONE: antitumoraktiviteter af human placenta-afledte mesenchymal stamceller udtrykker Endostatin på æggestokkene Cancer

Abstrakt

Endostatin er en vigtig endogen inhibitor af neovaskularisering, der er blevet meget udbredt i anti-angiogenese terapi til behandling af kræft. Imidlertid er den kliniske anvendelse hovedsagelig begrænset af dens lav effektivitet. Human placenta-afledte mesenkymale stamceller (hpMSCs) er særligt attraktive celler til klinisk brug i cellebaserede behandlingsformer. I den foreliggende undersøgelse hpMSCs blev isoleret og karakteriseret. Vi evaluerede derefter tumoren målrette egenskaber og antitumor virkninger af hpMSCs som genadministrationsbærere for kræft i æggestokkene terapi. Vi effektivt manipuleret hpMSCs at levere endostatin via adenoviral transduktion medieret af Lipofectamin 2000. tropisme kapacitet af de konstruerede hpMSCs mod tumorceller blev derefter bekræftet af

in vitro

migration assays og

in vivo

ved intraperitoneal injektion af hpMSCs i nøgne mus. De hpMSCs udtrykker det humane endostatin genet påvist præferentiel homing til tumorstedet og formindskede signifikant tumorvolumen uden tilsyneladende systemiske toksiske virkninger. Disse observationer var forbundet med signifikant nedsat blod spirer og tumorcelleproliferation samt en dramatisk forøget tumor apoptose indeks. Disse resultater antydede, at hpMSCs er potentielt en effektiv leveringsvehikel til terapeutiske gener til behandling af ovariecancer

Henvisning:. Zheng L, Zhang D, Chen X, Yang L, Wei Y, Zhao X (2012) Antitumor Aktiviteter af human placenta-afledte mesenchymal stamceller udtrykker Endostatin på kræft i æggestokkene. PLoS ONE 7 (7): e39119. doi: 10,1371 /journal.pone.0039119

Redaktør: Olivier de Wever, Ghent Universitet, Belgien

Modtaget: December 24, 2011; Accepteret: 16 maj 2012; Udgivet: 24 juli 2012

Copyright: © 2012 Zheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National 973 Program for Kina tilskud (2011CB910703). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ovariecancer er en af ​​de mest almindelige gynækologiske maligniteter, og det er fortsat den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt kvinder [1]. På trods af de mange fremskridt i kirurgisk ledelse, kemoterapi og strålebehandling i de seneste årtier, er prognosen for patienter med fremskreden kræft i æggestokkene er stadig fattige, med en 5-års overlevelse på mindre end 30% for patienter med fjernmetastaser. Denne lave overlevelsesrate skyldes primært eventuel tumor tilbagefald og fremkomsten af ​​[2] drug-resistens. Derfor er et presserende behov for nye terapeutiske metoder til at ændre den fremtidige udsigter for patienter med kræft i æggestokkene.

Angiogenese spiller en afgørende rolle i de biologiske og patologiske processer for kræft. Flere linjer af beviser har vist, at væksten og udviklingen af ​​de fleste faste kræftformer er angiogenese afhængige og tumor angiogenese er stærkt orkestreret af en balance mellem positive og negative regulatorer [3], [4]. Til dato har et stort antal antiangiogenesemidler blevet identificeret. Endostatin, en 20-kDa carboxylterminale fragment af α1-kæden af ​​collagen XVIII, som inhiberer endotelial cellemigration, proliferation og inducerer apoptose af vaskulære endotelceller, er blevet betragtet som den mest potent inhibitor af angiogenese. Det er velkendt, at endostatin effektivt kan inhibere forskellige faste tumorer, såsom små Lewis lunge cellecarcinom [5], tyktarmskræft [6], human brystcancer [7], hepatocellulært carcinom [8], [9], ovariecancer [ ,,,0],10], [11], og malignt melanom [12]. Men som et protein stof, endostatin har en kort halveringstid

in vivo

og let mister sin effektivitet. Desuden er kravet om en hyppig doseringsregimen og høje doser af dyre oprenset protein hæmmer dens fremtidige kliniske anvendelse. For at overvinde disse mangler, har anvendelsen af ​​genterapi blevet udforsket. Imidlertid genafgivelse effektivitet plasmidvektorer er meget dårlig, og de producerer også meget lav ekspression af endostatin. Andre strategier har forsøgt at overvinde nogle af disse spørgsmål i forsøg på at forlænge udtryk endostatin. Adenovirus betragtes som en af ​​de mest effektive genvektorer og har vist sig at kunne skabe en høj ekspression af endostatin i flere dage [4]. Alligevel opstår begrænsninger fra den relativt korte overlevelsestid for viruset, og disse vektorer kan ikke migrere specielt til tumorstedet og derfor kræver placering injektion. Derfor er behov for nye og mere effektive terapeutiske værktøjer, som specifikt målrette endostatin ekspression til tumorcellerne.

Mesenchymstamceller (MSC’er) er multipotente stamceller med evnen til at differentiere til en række celletyper, herunder chondrocyter , osteoblaster, adipocytter, muskler, neuroner, stromale celler og andre celletyper [13]. Flere undersøgelser har vist, at human placenta-afledte mesenkymale stamceller (hpMSCs) ligner stamceller fra knoglemarv med hensyn til celle egenskaber og deres potentiale for multilineage differentiering [14] – [16]. Som placentale væv stammer i de første faser af embryologisk udvikling, kan disse væv indeholder celler, der har bevaret de prosperities af tidlig embryonale celler, hvorfra de stammer. Desuden moderkagen er fundamental for at opretholde fetomaternal tolerance under graviditeten, hvilket tyder på, at celler til stede i placenta væv kan have immonomodulatory karakteristika. I mellemtiden viste nylige undersøgelser, at mesenkymale isoleret fra placenta væv har evnen til specifikt målsøgende til multipel tumorsted. Disse tre centrale aspekter gør celle fra placenta særdeles attraktiv kandidat til mulig anvendelse i celleterapi tilgange i direkte kræftbehandling [17]. Nogle undersøgelser har manipuleret MSC’er at udtrykke interferon β (IFNp) i gliomer [18], metastatisk melanom [19], og brystkræft modeller [20]. MSC-leveret IFNp er blevet vist at undertrykke tumorcellevækst ved at inducere cancer celledifferentiering og apoptose, hvilket resulterer i forøget overlevelse i disse modeller [18], [19]. Disse undersøgelser viste det relevante molekylære mekanisme medierende tværs undertrykkende samspil mellem manipuleret MSC og tumorvækst kan involveret i flere aspekter, herunder: a. MSC’er kan rejse til den samme homing destination som vandrende kræft stamceller med usædvanlige evner til at migrere til oncogenetic sted; b. cytokinet skjult i MSC’erne kan undvige immunsystemet overvågning og være godt tolereret af værten uden at inducere et uacceptabelt immunrespons; c. viral-transducerede MSC’er kan levere viral initiatively til tumorsteder og også øge den lokale viral dosis ved kontinuerlig viral replikation og amplifikation [21]. Disse resultater viste MSC’er kunne tjene som potentiel kandidat af vektor til genterapi. I mellemtiden har hpMSCs vist sig at være mere fordelagtig i celle indkøb, opbevaring og transplantation end knoglemarvafledte MSC’er. Desuden mesenkymale stromaceller fra knoglemarv har risiko for viral infektion [22] og deres differentiering kapacitet aftager betydeligt med donor alder [23]. Endvidere er placenta generelt kasseres efter fødslen; som sådan, dette væv er tilgængelig i stort udbud, og isoleringen af ​​stamceller fra dette væv ikke indebærer nogen invasive procedurer for donoren og undgår etiske kontroverser. Disse centrale aspekter gør celler isoleret fra placenta gode kandidater til mulig anvendelse i celleterapi. Den primære interesse for denne undersøgelse er blevet fokuseret på, hvorvidt endostatin manipuleret hpMSCs specifikt kunne migrere til tumorstedet og overvinde tumor progression og metastaser i et menneske kræft i æggestokkene model.

Materialer og metoder

rekombinant adenovirusvektor konstruktion

konstruktion af det rekombinante endostatin adenovirus er blevet beskrevet i en tidligere undersøgelse [10]. Kort fortalt blev humant endostatin cDNA i fuld længde (ca. 570 bp) amplificeret ved RT-PCR. Efter bekræftelse sekvens, blev cDNA klonet ind i en shuttle-vektor til redning af den rekombinante E1- /E3-slettet adenovirus (AdEasy systemet) [24]. De virale partikler blev amplificeret i 293-celler og oprenses ved totrins cæsiumchlorid (CsCI) -gradient ultracentrifugering, og målt ved absorption ved 260 nm. Virustiteren blev kvantificeret ved anvendelse af en standard TCID50-assay.

Cellekultur og reagenser

A2780s cellelinje og humane embryonale nyre (HEK293) celler blev opnået fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas , VA, USA) og dyrket i RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) rutinemæssigt suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum plus ampicillin og streptomycin i en befugtet 5% CO

2 inkubator ved 37 ° C . Kvindelige nøgne mus (6-8 uger gamle) blev købt fra Laboratory Animal Center i Sichuan University.

hpMSC isolation og kultur

Fuld sigt human placenta blev opnået fra en rask mor efter donorens skriftlig tilladelse under et væv samling protokol godkendt af institutionens Institutional Review Board (IRB) i West China Second Hospital. De informerede samtykke blev skrevet ned, og alle de dokumenter, blev holdt i West China Second Hospitals IRB. Med sterile procedurer, føtale deciduas placentavæv blev skåret i stykker af ca. 1 cm

3 i størrelse, vasket med PBS, og fordøjet med 1 mg /ml I type collagenase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 37 ° C i 2 timer. Cellerne blev derefter separeret via centrifugering over Ficoll-Hypaque separation medium ved en 1,088 g /cm

3 densitetsgradient til at fjerne uønskede celler. De opsamlede celler blev resuspenderet til dyrkning i L-DMEM-medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) suppleret med 20% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 10 U basisk fibroblastvækstfaktor (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA), 2 mmol /l L-glutamin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 100 U /ml penicillin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 100 ug /ml streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Cellerne blev derefter udsået i 75 cm

2 kolber og dyrket i en 37 ° C, 5% CO

2 inkubator med mættet fugtighed. Efter 48 timer blev ikke-adhærente celler fjernet ved at erstatte dyrkningsmediet. Frisk medium blev udvekslet hver 3 til 4 dage. Cellerne blev høstet ved trypsinisering (0,25% trypsin med 0,1% EDTA), derefter passeret, og derefter anvendes under den fjerde passage for eksperimenter.

celleoverfladefænotype og multipotente differential estimering

For at skelne hpMSCs, fænotypisk karakterisering af CD29, CD44, CD105, CD73, CD166, CD90, CD34 og CD 45 blev analyseret ved anvendelse af et flowcytometer (Coulter EPICS Elite ESP) [25]. Celler blev spaltet og inkuberet med antistof i 25 minutter ved 4 ° C. Ufarvede, nonincubated celler tjente som kontrol. Derefter blev cellerne fikseret i 4% pufret formalin og analyseret med et flowcytometer. Minimumsbeløb af celler til 8000-gated hændelser blev erhvervet for hver prøve. For osteogen og adipogenisk differentiering, hpMSCs blev dyrket ved 5 × 10

4 celler pr brønd i 12-brønds plader i OsteoDiff eller Adipodiff induktion medium (Miltenyi Biotec GmbH) i 3 uger, derefter alizarinrødt S og Olie-rød-O blev anvendt til at visualisere kalkaflejringer og fedtdråber separat. At vurdere, om transfektion med adenovirus ville påvirke multipotente egenskaber, 48 timer efter transficeret med adenovirus, celler blev dyrket i OsteoDiff eller Adipodiff induktion medium i 3 uger, derefter Olie-rød-O og alizarinrødt S blev udnyttet til at visualisere kalkaflejringer og fedt dråber henholdsvis

hpMSC transfektion og protein udtryk analyser

Den isolerede MSC befolkning med positive fænotype blev udvidet kontinuerligt i uger, indtil de plade-vedhængende hpMSCs nået . 90% sammenløb og besad tilstrækkelig forankring aktivitet og stabilitet til at udholde de belastninger af viral vektor infektion ved en høj multiplicitet (normalt mellem populationsfordoblinger 4 og 7). Før transduktion blev vækstmediet fjernet, og cellerne blev vasket én gang med serumfrit DMEM. Ad-Hendo-GFP blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved en infektionsmultiplicitet (MOI; virus /celle) i 2000 (valgt som den optimale blandt MOI’er på 1000, 2000 og 3000). Efter 48 timer, vektor- og mock-transducerede celler blev analyseret under et omvendt mikroskop (Axiovert 200; Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY, USA). Og et flowcytometer blev anvendt til evaluering af grøn fluorescens

Cellerne transficeret med Ad-Hendo (hpMSC-Ad-Hendo) og styre- adenovirus (Ad-null) ved en MOI på 2000 (2,5 * 10

8 pfu /10

6 celler i 1,0 ml komplet medium) blev derefter opnået, og supernatanten blev høstet, koncentreret ved ultrafiltrering (Centricon YM-3; Millipore, Bedford, MA, USA) og analyseret ved Western-blot. Proteiner blev separeret ved anvendelse af en 12% SDS-PAGE-gel og transblottet til en PVDF-membran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranen blev derefter blokeret i 5% fedtfri mælk i 0,1% Tris-bufret saltvand med Tween 20 (TBST) i 1 time ved stuetemperatur og senere probet med et kanin polyklonalt anti-endostatin antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) fortyndet 1:400 ved 4 ° C natten over. Efterfølgende blev blots inkuberet med et peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin-immunglobulin (1:5000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i 1 time ved stuetemperatur. Proteinbåndene blev detekteret under anvendelse af et ECL påvisning kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Endvidere udførte vi også ELISA-assay for at bestemme ekspressionsniveauet af endostatin udskilles af manipulerede hpMSCs

in vitro

. Som beskrevet før, blev de isolerede hpMSCs transficeret med adenovirus transporterer endostatin, og 48, 72 og 96 timer efter transfektion blev supernatanterne opsamlet og analyseret for human endostatin genekspressionsniveauer anvendelse af et humant Endostatin Quantikine ELISA Kit (R Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY, USA). Disse forsøg blev udført tredobbelt.

Bestemmelse af hpMSC homing til tumorstedet

Tumorer blev etableret i mus ved intraperitoneal (i.p.) injektion af 5 * 10

6 A2780s celler. Efter 14 dages tumor udfordring, når tumorknuder var palpable, blev hpMSCs transficeret med Ad-GFP under anvendelse af lipofectamin som beskrevet før. Efter 48 timer blev cellerne opsamlet, vasket en gang med PBS og suspenderet i frisk medium. Derefter celler blev injiceret i.p. ved 2 * 10

5 celler pr injektion. Ikke-tumorbærende mus blev anvendt som kontrol. Tre dage og 2 uger efter injektion, blev tumor knuder og orangs (hjerte, lever, milt, lunge, nyre) indsamlet og nedfrosset i Optimal Cutting Temperatur forbindelse (OLT), hhv. Fluorescerende hpMSCs blev påvist i friske kryosektioner (3-5 um) af tumorprøverne og organer ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Salg

Behandling af den eksperimentelle xenograft model Salg

Kvindelige nøgne BALB /c-mus 6- 8 uger gamle, blev købt fra forsøgsdyr centrum af Sichuan University. Forskningen Protokollen blev revideret og godkendt af Institutional Animal Care og behandling Komité Sichuan University. Menneskelig æggestokkræft blev oprettet ved intraperitonealt injektion af nøgne mus med 5 * 10

6 A2780 celler i 200 pi PBS. Før i.p. indgivelse blev hpMSCs transficeret med Ad-Hendo eller Ad-nul ved en MOI på 2000 som beskrevet ovenfor. Mus blev tilfældigt opdelt i fire grupper (n = 5 dyr /gruppe): (a) mus behandlet med 0,9% normalt saltvand (NS); (B) mus behandlet med hpMSCs på 2 * 10

5 /mus; (c) mus behandlet med Ad-nul-transfekterede hpMSCs på 2 * 10

5 /mus; (d) mus behandlet med Ad-Hendo-transficerede hpMSCs på 2 * 10

5 /mus. Behandlingen startede 5 dage efter tumor-celle udfordring og blev administreret via i.p. injektion hver 3 dage, i alt 6 gange. Musene blev overvåget dagligt for tumorbyrde, abdominal distension, kakeksi og andre afvigelser. Musene blev aflivet 1 uge efter den sidste administration, og i.p. tumorer blev derefter skåret ud og vejet.

Kvantificering af celledeling og angiogene mikrokar tæthed

primær tumor prøver med tilstødende væv og relevante indre organer blev høstet, fikseret i 4% paraformaldehyd, og derefter indlejret i paraffin. For immunhistokemi-analyse blev snit 3-5 um tykke skåret fra paraffinblokke, afparaffiniseret i xylen og rehydreret med en serie af gradueret EtOH. Antigen genfinding blev udført ved autoklavering sektionerne i hentning buffer (10 mmol /l EDTA citratbuffer [pH 6,0], Dako, Glostrup, Danmark) i 4 minutter i mættet damp efter op-tryk vinder (126 ° C, 1,6 bar, 23 psi). Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med 3% hydrogenperoxid ved stuetemperatur i 10 min fri for lys, og ikke-specifik binding af reagenser blev standset ved inkubation af sektionerne i 20 minutter i 10% normalt gede eller kaninserum. Sektionerne blev derefter inkuberet med ged anti-human Ki-67 polyklonale antistoffer (1:150; Maixin-Bio, Fuzhou, Kina) og polyklonale rotte anti-human CD31 (1:200; Maixin-Bio, Fuzhou, Kina) natten over i et fugtigt kammer ved 4 ° C; dette blev efterfulgt af inkubering med biotinyleret kanin-anti-ged /rotte IgG og derefter streptavidin-biotin-peberrodsperoxidasekompleks ved 37 ° C i 45 minutter. De immunreaktioner blev endeligt udviklet (visualiseret med diaminobenzidin [DAB] opløsning som et chromogen) med en DAKO Liquid DAB + substrat-kromogen-system, og de Crimson gule bundfald blev identificeret som positiv farvning. Kontrastfarvning blev forsigtigt udført med forbedrende Gills hematoxylin, og dias var dehydreret og monteret med dækglas. Snittene blev derefter visualiseret under anvendelse af et mikroskop ved 400x forstørrelse (Olympus, Tokyo, Japan). Ki-67-positive celler eller blodkar blev talt fra tre områder i hver sektion i et blindet måde.

Alginat indkapsling assay

Alginat perle indeholder tumorceller assay blev beskrevet i detaljer tidligere [ ,,,0],26]. Kort beskrevet dyrkede A2780 celler blev genopslæmmet med 1,5% (m /v) natriumalginat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), og derefter tumorcellen alginat opløsning blev dryppet i en hvirvlende bad af 0,25 M CaCl2 for at danne smådråber indeholdende ca. 1 x 10

5 tumorceller pr perle. Efter bedøvet, blev de nøgne mus implanteret s.c. med fire perler ind et indsnit på ryggen blev indsnit sutureres med kirurgiske klemmer. Den hpMSCs-Ad-Hendo (ved en MOI på 2000) blev injiceret i.p. på dag 3, 6, 9, 12 efter bead implantation, med hpMSCs-Ad-null, hpMSCs eller saltvand som kontrol. På dag 14 blev musene injiceret i.v. med 100 pi FITC-dex- tran-opløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (100 mg /kg) og blev aflivet 20 minutter senere. Billede af alginat implantater blev taget ved hjælp af SPOT FIEX kamera. Alginatkugler blev overført til rør indeholdende 2 ml saltvand. Rørene blev blandet af en vortex i 20 s og centrifugeret (3 min; 1000 x g). Endelig fluorescensen af ​​supernatanten blev målt til at kvantificere blodkar dannelse.

Analyse af apoptose i tumorvæv

Apoptose analyse blev udført ved hjælp af TUNEL (terminal deoxynukleotidyltransferase-medieret dUTP nick-end mærkning) ved anvendelse af en deadend fluorometrisk TUNEL System (Promega, Madison, WI, USA) ifølge producentens protokol. TUNEL-positive kerner, pyknotiske kerner med mørkegrønt fluorescerende farvning blev visualiseret og analyseret under et fluorescensmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). Den apoptose-indekset blev bestemt ved to afhængige efterforskere ved at tælle TUNEL-positive celler i fem høj effekt felter pr dias.

Evaluering af potentielle toksicitet

For at vurdere de potentielle bivirkninger og toksicitet hpMSCs, observeredes de relevante indekser såsom vægttab, anoreksi, diarre, kakeksi, hudulceration, pjusket pels og toksisk dødsfald. Efter aflivning af musene blev forskellige organer (hjerte, lever, milt, lunge, nyre etc.) høstet og fikseret i 4% paraformaldehyd i PBS. Dele af 3-5 um blev farvet med hæmatoxylin og eosin (H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Fænotype analyse og multipotente karakteristika for isolerede celler

Flowcytometri analyser viste, at populationen af ​​plade-vedhængende celler var. positiv for mesenkymale stamcelle markører CD29 ( 95%), CD44 ( 95%), CD73 ( 99%), CD90 ( 95%), CD166 ( 95%), CD105 ( 95%) og negative for hematopietic markører CD34 ( 3%) og CD45 ( 3%), hvilket var i overensstemmelse med kendetegnene for MSC’er (Figur 1A). Den generelle definition af MSC omfatter både fænotypiske og funktionelle kriterier, så vi anvendte den osteogene og adipogenisk differentiering assay at identificere de multipotente egenskaber før og efter adenovirus transfektion. For osteogen og adipogenisk differentiering, hpMSCs blev dyrket ved 5 × 10

4 celler pr brønd i 12-brønds plader i OsteoDiff eller Adipodiff induktion medium (Miltenyi Biotec GmbH) i 3 uger, derefter alizarinrødt S og Olie-rød-O blev anvendt til at visualisere kalkaflejringer og fedtdråber separat. Som vist i figur 1B, 1C, visualisering lipidvakuoler og kalkaflejringer peger på en bredere multipotente differentiering kapacitet af vores hpMSCs. Vi har også afgjort, om transfektion med adenovirus ville påvirke multipotente egenskaber. 48 timer efter transficeret med adenovirus, celler blev dyrket i OsteoDiff eller Adipodiff induktion medium i 3 uger, derefter Olie-rød-O og alizarinrødt S blev anvendt til at visualisere kalkaflejringer og fedtdråber separat. Som vist i figur 1C, kan positive lipidvakuoler og kalkaflejringer visualiseres.

A. Fænotypen karakteristika rensede MSC’er blev verificeret ved flowcytometrisk analyse, som viste, at disse udvidede og plade-vedhæftende populationer af celler (ved fordoblinger 3 og 5) var positive for CD29 ( 95%), CD44 ( 95%) , CD73 ( 99%), CD90 ( 95%), CD166 ( 95%) og CD105 ( 95%) overflade markør udtryk og negativ for CD34 ( 3%) og CD45 ( 3%). Den fuldt optrukne linie angiver ufarvede kontrolceller og stiplede linje betegner isolerede mesenchymstamceller. B. Osteogen og adipogenisk differentiering beslutsomhed i isolerede mesenkymale stamceller. Venstre panel angivet positive calcium indskud (pile), højre panel angivet lipidvakuoler (pile). C. Osteogen og adipogenisk differentiering bestemmelse i isoleret mesenkymale stamceller efter transficeret med adenovirus. 48 timer efter transfektion blev cellerne vasket med PBS og dyrket i OsteoDiff eller Adipodiff induktion medium i 3 uger, derefter Olie-rød-O og alizarinrødt S blev anvendt til at visualisere kalkaflejringer og fedtdråber separat. Lipidvakuoler og kalkaflejringer (pile) kunne visualiseres (× 100).

In vitro

udtryk for hpMSC-Ad-Hendo

Da menneskelig placenta- afledte MSC’er er relativt resistent over for vildtype-adenoviral infektion på grund af deres lave ekspression af adenovirale receptor CAR gennemførte vi Lipofectamine 2000 medieret adenoviral transduktion. Genet levering effektivitet adenovirus ind hpMSCs blev bestemt ved mikroskop evaluering. Vi fandt, at efter transduktion med rekombinante Ad-Hendo-GFP ved en MOI på 2000 og 3000, næsten alle cellerne udsendes grøn fluorescens efter dyrkning under plade-vedhæftende betingelser (figur 2A). Men sammen med øget infektion mangfoldighed, celledød blev også udvidet, hvilket muligvis afspejler celleskader på grund af overdreven transgen ekspression. Endvidere blev flowcytometri anvendes til at måle transduktionseffektiviteten. Resultaterne viste, at den var effektiv ved en MOI på 2000, da ca. 82,3% af hpMSC-Hendo celler konsekvent udtrykt GFP på denne MOI (figur 2D). Taget sammen, vi valgte at bruge celler konstrueret under disse transduktion betingelser (en MOI på 2000) i alle efterfølgende eksperimenter. Efterfølgende at kontrollere, om endostatin protein blev udskilt fra hpMSC-Ad-Hendo celler, blev udført Western blot-analyse. Som vist i figur 2B, ved en MOI på 2000, et særskilt bånd på ca. 20 kDa, svarende til størrelsen af ​​endostatin, blev udtrykt i Ad-Hendo-behandlede celler, men ikke i Ad-nul behandlede celler. Endvidere udførte vi også ELISA-assay til påvisning endostatin udskilt fra hpMSC-Ad-Hendo. Som vist i figur 2C, er koncentrationen af ​​endostatin i cellekultursupernatanterne var signifikant højere end kontrolgruppen og niveauet af endotatin også steget med tiden og forblev på et højt niveau 96 timer efter transfektion. Denne analyse bekræfter, at endostatin kan udskilles effektivt fra de konstruerede hpMSCs.

A. GFP-fluorescens blev vurderet i FITC-kanalen. De hpMSCs transficeret med GFP-mærkede adenovirus viste grøn. Original forstørrelse × 400. B. Celler transficeret med Ad-Hendo og styre adenovirus (Ad-null) ved en MOI på 2000, blev analyseret ved Western blot for at detektere ekspressionen af ​​endostatin protein. hpMSCs transficeret med Ad-Hendo viste indlysende udtryk for endostatin protein sammenlignet med kontrol. C. For at verificere ekspressionsniveauet af endostatin udskilles af manipulerede hpMSCs

in vitro

, ELISA-assay blev udført for at vurdere endostatin i supernatanterne af celler transficeret med adenovirus transporterer endostatin, hpMSCs og hpMSCs transficeret med Ad-null blev anvendt som kontrol. Ved 48 timer, 72 timer og 96 timer efter transfektion blev cellekultursupernatanter opsamlet og endostatin koncentration blev bestemt. Koncentrationen af ​​endostatin i cellekultursupernatanterne var signifikant højere end kontrolgruppen og niveauet af endotatin også steget med tiden og forblev på et højt niveau 96 timer efter transfektion. D. Flow cytometri blev anvendt til at evaluere transfektionseffektiviteten af ​​Ad-Hendo-GFP. Den transfektion hastighed MOI 1000, 2000 og 3000 var 60,3%, 82,3% og 79% hhv. Sammenlignet med kontrollen, infektion ved en MOI på 2000 medførte højere transfektionseffektivitet. Den røde ramme repræsenterer positive zone på hver parcel.

Den vandrende kapacitet hpMSCs mod tumorceller

in vitro

in vivo

det er blevet foreslået, at faktorer frigivet fra cancerceller være potentielle kemoattraktanter involveret i tropisme af MSC’er. For at evaluere den vandrende kapacitet hpMSCs mod A2780 celler,

in vitro

migration assays under anvendelse Millicell indsatser blev gennemført. Konditioneret medium fra 293-celler blev anvendt som kontrol. Kun et par hpMSCs-Ad-Hendo celler migrerede mod 293-medium, mens migration af hpMSCs-Ad-Hendo blev signifikant stimuleret af konditioneret medium fra de menneskelige ovarie cancer A2780 celler (P 0,01, figur 3A). Når antallet af migrerede celler på undersiden af ​​Millicell inserter blev beregnet, blev det bekræftet, at umodificerede hpMSCs migreret til det konditionerede medium fra A2780-celler i et lignende mønster som for hpMSCs-Ad-Hendo. Sammen vores data viste, at under de beskrevne betingelser, viste hpMSCs betydelige vandrende kapacitet og A2780-celler besad en større evne til at inducere migrationen af ​​MSC’er sammenlignet med 293-celler (P 0,05, figur 3B). At afgøre, om hpMSCs fortrinsvis homed til humane æggestokkene xenografter, vi etableret nøgne mus peritoneal ovariecancer model. 2 uger efter i.p. injektion af A2780-celler og tumorer var palpable, vi intraperitoneal injiceret mesenkymale stamceller transficeret med adenovirus, der bærer GFP, og ikke-tumorbærende mus blev anvendt som kontrol. På tidspunktet punkt 3 dage og 2 uger efter i.p. injektion af transficerede mesenchymstamceller blev mus aflivet, og tumorknuder, lever, milt, lunge, nyre og hjerte blev opsamlet og GFP signal blev målt. Som vist i figur 3C, 3 dage efter i.p. injektion blev GFP signaler detekteret ved tumor periferi. 2 uger efter i.p. injektion, interessant vi opdaget positivt signal i tumoren parenkymalt. Dette fund antydede, at de injicerede mesenchymstamceller forblive i xenograft og kan integreres i tumor fokus. Endvidere er der ingen positiv signal fundet med organer fra tumorbærende og ikke-tumorbærende mus.

A. Migration af hpMSCs /hpMSCs-Ad-Endo celler gennem en 8-um Millicell membran. HpMSCs blev dyrket i 24-brønds plade på 8-um pore-størrelse membraner, og A2780s eller 293-celler blev dyrket i det nedre kammer. Cellerne migreret til den nedre side af membranen blev mærket med methyl violet. Original forstørrelse × 400. B. Induktion af hpMSCs /hpMSCs-Ad-Endo migration stimuleret af A2780s eller 293-celler. Sammenlignet med 293-celler, A2780s celler fremmes migration af hpMSCs //hpMSCs-Ad-Endo betydeligt. Data, der er vist som middel ± SD. C. For at verificere den specifikke målsøgende egenskab transduceret mesenchymal til tumor site, vi transduceret hpMSCs med adenovirus bærer GFP og injiceret i.p. til nøgne mus med etableret peritoneal ovarietumor. Efter 3 dage og 2 uger efter i.p. injektion blev musene aflivet, og tumorknuder og organer blev opsamlet. Venstre panel: 3 dage efter intraperitoneal injektion, GFP signal (pil) blev påvist på tumor periferi. Right panel: 2 uger efter i.p. injektion, blev positivt GFP signal påvist i tumoren parenkymalt (pil), som angivet hpMSCs forblive i xenograft og kan integreres i tumor fokus.