PLoS ONE: LRP-1 Fremmer Cancer Cell Invasion ved Støtte ERK og hæmmende JNK Signaling Pathways

Abstrakt

Baggrund

low-density lipoprotein receptor-relateret protein-1 (LRP-1 ) er en endocytisk receptor medierer clearance af forskellige ekstracellulære molekyler involveret i udbredelsen af ​​kræftceller. LRP-1 fremgik således som en attraktiv receptor til målretning den invasive opførsel af maligne celler. seneste resultater tyder imidlertid, at LRP-1 kan lette udviklingen og væksten af ​​cancer metastaser in vivo, men den præcise bidrag af receptoren under cancer progression er endnu ikke klarlagt. Manglen på mekanistiske indsigt i den intracellulære signalering netværk nedstrøms for LRP-1 har forhindret forståelse af sit bidrag til kræft.

Metode /vigtigste resultater

Gennem en kort hårnål RNA-medieret lyddæmpning tilgang, identificerede vi LRP-1 som en vigtigste regulator af ERK og JNK signalering i en tumor celle sammenhæng. Co-immunopræcipitationsforsøg afslørede, at LRP-1 udgør en intracellulær docking site for MAPK holdige komplekser. Ved at bruge farmakologiske agenter, konstitutivt aktive og dominerende negative kinaser, viste vi, at LRP-1 opretholder maligne celler i en klæbende tilstand, der er gunstigt for invasion ved at aktivere ERK og hæmme JNK. Vi yderligere demonstreret, at LRP-1-afhængig regulering af MAPK signalering arrangerer cytoskeletale arkitektur og medierer klæbende kompleks omsætning i kræftceller. Desuden fandt vi, at LRP-1 er bundet til actin netværket og fokale vedhæftning sites og styrer ERK og JNK målretning til Tallinn-rige strukturer.

Konklusioner

Vi identificerede ERK og JNK som de vigtigste molekylære relæer, hvorved LRP-1 regulerer fokal adhæsion demontering af maligne celler til at støtte invasion

Henvisning:. Langlois B, Perrot G, Schneider C, Henriet P, Emonard H, Martiny L, et al. (2010) LRP-1 Fremmer Cancer Cell Invasion ved Støtte ERK og hæmmende JNK signalveje. PLoS ONE 5 (7): e11584. doi: 10,1371 /journal.pone.0011584

Redaktør: Bill Hooker, Calypte Biomedical Corporation, USA

Modtaget: April 2, 2010; Accepteret: 20 Juni 2010; Udgivet: 14 juli 2010

Copyright: © 2010 Langlois et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), La Ligue nationale Contre le Cancer (Comité de la Marne), CPER (Contrat de Projets Etat-regionen) 2007-2013 og Fonds National pour la Santé ACI (aktion Concertée Incitative) 2008 (Canceropole Grand-Est Project). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

low-density lipoprotein (LDL) receptor-relateret protein-1 (LRP-1) er et ubikvitært endocytiske receptor tilhører LDL-receptorfamilien [1]. Først beskrevet som en last-receptor medierer optagelse og lysosomal nedbrydning af α2-makroglobulin [2] blev LRP-1 derefter fundet at være involveret i internaliseringen af ​​over 30 funktionelt og strukturelt ubeslægtede ekstracellulære ligander. Disse omfatter proteaser, protease-inhibitor-komplekser, makromolekylære proteiner og vækstfaktorer. Syntetiseres først som et 600 kDa precursor, er LRP-1 viderebehandles i trans-Golgi af en furin-convertase til ekspression på celleoverfladen i moden tokædeformen sammensat af en 515 kDa ekstracellulært underenhed (α-kæde), kovalent bundet til et 85 kDa β-kæde, som indeholder transmembrandomænet og den cytoplasmatiske hale. LRP-1 α-kæde havne fire ligandbindende klynger involveret i specifik genkendelse af ekstracellulære ligander og montering af multiprotein komplekser på celleoverfladen. Den intracellulære domæne af LRP-1 β-kæde kunne rekruttere molekyler involveret i endocytiske maskiner og cytoplasmatiske modulatorer af signalveje [3].

Mangfoldigheden af ​​dets ligander kan forklare, hvorfor LRP-1 er blevet identificeret som en kritisk faktor i forskellige patologiske sammenhænge, ​​herunder atherosklerose og neurodegenerative lidelser som den hyppigst beskrevet [4], [5]. Et stigende antal beviser styrket den formodede rolle LRP-1 i afgørende begivenheder i kræft progression [6]. LRP-1 blev faktisk rapporteret at mediere clearance af forskellige matrixmetalloproteinaser såsom MMP-2, MMP-9 og MMP-13 [7], [8], [9] og regulere plasmin aktiveringskaskade gennem endocytose af vævs- type (tPA) eller urokinase-type (uPA) plasminogenaktivatorer [10], [11]. I betragtning af dens velkendte funktion i kontrollen af ​​matrix proteolyse [12], blev LRP-1 oprindeligt foreslået som en hidtil ukendt tumor suppressor. Den svage udtryk niveau af LRP-1 observeret i høj kvalitet humane cancerceller og væv syntes at støtte en sådan hypotese [13], [14]. Imidlertid synes den overordnede funktion af LRP-1 i carcinogenese at være meget mere kompliceret end først antaget. Nylige undersøgelser har rapporteret et positivt bidrag på LRP-1 til migration og invasion arrangementer af forskellige celletyper [10], [15], [16], herunder maligne tumorceller [17], [18], [19], [20 ]. LRP-1-ekspression blev også rapporteret at være hypoxi-responsiv og støtte metastatisk spredning af mus tumorxenoplantater [21]. Endvidere blev LRP-1 vist at opretholde den mitogene og /eller promigratory virkninger af flere opløselige faktorer i peritumoral miljø, hvilket understøtter en pro-tumorigenese rolle af receptoren [15], [22], [23]. Vi har for nylig vist, at LRP-1 bidrager til carcinom celleinvasion ved subtilt styre klæbemiddel kompleks omsætning [17]. Det fremgår derfor, at de mekanismer, som LRP-1 kontroller tumor progression er ikke kun relateret til dens endocytisk funktion.

Beyond endocytose, LRP-1 blev udmærker sig ved sin evne til at udløse intracellulære signalveje regulerer celleproliferation, differentiering , migration eller overlevelse [15], [24], [25], [26]. Dens korte intracytoplasmatisk domæne (ICD) indeholder to NPxY motiver til fosforylering af tyrosinkinaser som derefter i stand til at binde phosphotyrosin-bindende domæne (PTB) -holdige proteiner. Gær-to-hybrid assays og proteomics analyse afslørede, at Shc (Src homologi 2 domæne indeholdende protein), Fe65, DAB1 (deaktiveret 1), PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) eller en PIP-4,5-kinase (phosphatidyl-inositol -4,5-kinase) homolog kan associere med LRP-1-ICD [27], [28]. Således som respons på ekstracellulære stimuli, kan LRP-1 rekruttere intracellulære scaffold proteiner til at udløse nedstrøms signalering. LRP-1 er blevet identificeret som en molekylær signalering partner for blodpladeafledt vækstfaktorreceptor (PDGFR), hvilket fører til migration og proliferativ signalering og udvikling af aterosklerotiske læsioner [4], [29]. For nylig har promigratory virkning af plasminogenaktivatorinhibitor PAI-1 syntes at kræve LRP-1-afhængig aktivering af JAK (Janus kinase) /STAT (signal transducer og aktivator af transkription) signalvejen [30]. Desuden Ma og kolleger rapporterede, at LRP-1 kan regulere murine embryonale fibroblaster migration ved at undertrykke Rac1 og ekstracellulære signal-regulerede kinase (ERK) veje [31].

I feltet kræft, er der en bemærkelsesværdig mangel af viden om intracellulær signalering nedstrøms for LRP-1 og forståelse af dens mulige bidrag til kræft progression. I den foreliggende undersøgelse, vi kendetegnet de molekylære signalering relæer involveret i LRP-1-medieret stimulering af cancercelleinvasion og identificeret LRP-1 β-kæden som en primær docking site for fokal adhæsion (FA) komponenter og mitogenaktiveret protein (MAPK) -holdige komplekser.

Resultater

Identifikation af LRP-1 som en regulator af MAPK signalveje i tumor celle sammenhæng

for at vurdere, hvilken rolle LRP- 1 i reguleringen af ​​intracellulær signaltransduktion, vi brugte en tidligere valideret metode til at generere shLRP-1 klonede celler, der stabilt overekspression en specifik hårnål sekvens rettet mod LRP-1 [17]. Som vist i fig. 1, observerede vi en -90% nedregulering af endogen LRP-1-ekspression i shLRP-1 celler sammenlignet med shCTRL celler, både mRNA (fig. 1A) og proteinniveauer (fig. 1B). Vi analyserede derfor virkningerne af LRP1 silencing på aktiveringen af ​​flere potentielle LRP-1-regulerede signalveje. De aktivering tilstande af to store MAPK pathways, dvs. ERK-1/2 og SAPK /JNK (stress-aktiveret proteinkinase /c-jun N-terminal kinase), blev først undersøgt (fig. 1C). Vi fandt, at niveauet af phosphoryleret ERK-1/2 var selektivt reduceret i LRP1-lyddæmpet celler og en stigning i JNK-1/2/3-phosphorylering blev påvist ved LRP-1 nedregulering. Men phosphoryleringsniveauerne af Akt og p38 MAPK ikke ændre sig væsentligt i LRP-1-mangelfulde karcinomer. Disse resultater viser, at LRP-1 kan virke som en intracellulær signalering modulator, aktiverende ERK og inhibere JNK signalveje.

(A) Totale RNA’er blev oprenset fra FTC133 kontrol klonal cellelinie (shCTRL) eller klonale celler, der stabilt overekspression shRNAs for LRP-1 (shLRP-1). Det transkriptionelle niveau af LRP-1 blev vurderet ved RT-PCR. p-actin-primere blev anvendt som en normalisering kontrol. (B) Whole-celleekstrakter fra hver cellelinje blev underkastet immunoblotanalyse med anti-LRP-1 β-kæde-antistof (5A6). p-actin antistof blev anvendt til normalisering. (C) shCTRL og shLRP-1 klonale celler blev dyrket i 24 timer på gelatineovertrukne overflader i 10% FBS-holdige medier. Whole-celleekstrakter blev immunoblottet ved anvendelse phospho-ERK, phospho-JNK, phospho-Akt og phospho-p38-antistoffer. Antistoffer mod ERK, JNK, p38 og β-actin blev anvendt for at sikre lige lastning og til normalisering. Gelen og immunoblots præsenteres, er repræsentative for mindst tre separate forsøg. Tal under gelen og immunolots angiver fold induktioner ved comparaison med shCTRL celler.

LRP-1 medierer serum-induceret aktivering af ERK-1/2 og konstitutive hæmning af JNK-1/2 /3

LRP-1-medieret regulering af intracellulær signalering kan enten afhænge af bindingen af ​​ekstracellulære ligander eller om ansættelse af intracellulære stilladser. Vi vurderede LRP-1-medieret regulering af både ERK (fig. 2A til 2D) og JNK pathways (Fig. 2E til 2H) som reaktion på serum stimulation og gelatineovertræk. LRP-1-medieret aktivering af ERK-1/2 phosphorylering blev kun observeret i tilstedeværelsen af ​​serum (fig. 2A og 2B vs 2C og 2D). I modsætning hertil blev aktiveringen af ​​JNK-1/2/3 i LRP-1-lyddæmpede celler ikke betinget af tilstedeværelsen af ​​serum (fig. 2E til 2H). I begge tilfælde, reguleringen af ​​MAPK af LRP-1 var upåvirket af gelatine belægning (fig. 2A, 2C, 2E og 2G). LRP-1-receptoren udløser derfor det ekstracellulære-ligand-afhængig aktivering af ERK-1/2 og fungerer som en konstitutiv inhibitor af JNK-vejen.

shCTRL og shLRP-1-celler blev udpladet på plast eller gelatine- skåle coatet i 24 timer i fravær eller nærvær af FBS. Whole-celleekstrakter blev underkastet Western-blot-analyse til at studere aktivering af ERK (A-D) og JNK (E-H) i fravær eller nærvær af FBS. De respektive aktivering satser ERK (B, D) og JNK (F, H) blev bestemt som intensitet forhold mellem phospho-protein til tilsvarende pan-protein og udtrykt i relative enheder +/- SD, med en værdi på 1 lagt til shCTRL celler. NS, ikke signifikant; *,

P

. 0,05

LRP-1 er en docking site for Src, ERK og JNK indeholder komplekser

LRP-1 C-terminal ende kan interagere med stillads molekyler involveret i signaltransduktion [28]. Co-immunpræcipitationseksperimenter blev udført for at teste, om det intracellulære domæne af LRP-1 er i stand til at rekruttere, der er involverede i reguleringen af ​​ERK og JNK signalveje i en tumorcelle sammenhæng. Som vist i fig. 3, var vi i stand til at immunpræcipitere LRP-1 β-kæde med et antistof rejst mod den ekstracellulære LRP-1 α-kæden. Både ERK og JNK-kinaser blev co-immunpræcipiteret med LRP-1 β-kæde. Vi undersøgte også fosforylering tilstand af disse kinaser. blev fundet phosphorylerede former af ERK-1/2 forbundet med LRP-1, hvor phosphoryleret JNK ikke var. . Src, en kinase velkendt at blive aktiveret nedstrøms for mitogen og matrix-receptorer, blev også påvist i LRP-1 β-kæde indeholdende komplekser

Immunopræcipitationer af LRP-1-holdige komplekser (IP: LRP-1 -α) blev udført ved anvendelse af anti-LRP-1 α-kæde (8G1) antistoffer og immunkomplekserne blev immunblottet (IB) ved anvendelse 8G1, anti-LRP-1 β-kæde (5A6), anti-ERK-1/2 , anti-phospho-ERK-1/2, anti-JNK-1/2/3, anti-phospho-JNK-1/2/3 og anti-Src-antistoffer. Uspecifikke IgG’er blev anvendt som en negativ kontrol af immunfældning.

LRP-1-afhængig ERK-aktivering bidrager til carcinom celleinvasion

Vi har for nylig beskrevet en nøglerolle for LRP-1 i tumor progression [17]. Således som vist i fig. 4A, LRP-1-deficiente celler udviste en to gange mindre invasiv kapacitet, sammenlignet med kontrolceller klonale celler. Vi undersøgte derfor, om LRP-1-afhængig aktivering af ERK kunne bidrage til carcinom celleinvasion. Først blev kontrolceller behandlet med U0126, en selektiv inhibitor af MEK-1/2 (MAPK ERK-kinase-1/2) eller transficeret med en dominant negativ mutant af MEK-1. Effektiviteten af ​​ERK-1/2-inhibering under disse betingelser kan ses i fig. 4B. blev påvist nogen ændring i JNK-phosphorylering ved ERK inhibering (fig. S1). Kontrol celleinvasion blev inhiberet ved U0126 behandling på en dosis-afhængig måde (Fig. 4C og 4D). Desuden udviste shCTRL celler, der overudtrykker en kinase-dødt form af MEK-1 nedsatte invasive egenskaber (fig. 4c og 4d). Disse resultater indikerer, at ERK-signalering modulet aktiveres under carcinoma celleinvasion. Dels at redde den aktiverede ERK-vejen i LRP-1-lyddæmpede celler blev et konstitutivt aktivt ERK-2 overudtrykkes. Aktiveringstilstanden af ​​ERK-1/2 blev vurderet ved immunoblotting (Fig. 4E). Som vist i fig. 4F og 4G, evne til LRP-1-deficiente celler at invadere blev delvist gendannes, når ERK-2 blev overudtrykt. Da tyrosin-kinase Src potentielt kunne aktivere ERK signalering nedstrøms for LRP-1 (fig. 3), blev celleinvasion kvantificeret i nærvær af en Src-kinaseinhibitor. Desværre fik Src hæmning ikke påvirke invasive kapacitet både shCTRL og shLRP-1-celler (fig. 4H), hvilket udelukker Src kinase bidrag til LRP-1-medieret ERK aktivering under karcinom celle invasion.

Matrigel Invasion assay blev udført for shCTRL og shLRP-1 carcinomceller i basale betingelser (A), efter modulationen af ​​ERK aktivitet i shCTRL (B-D) og shLRP-1-celler (E-G) eller i nærvær af Src inhibitor ( H). (C, D) Kapaciteten af ​​shCTRL celler at invadere matrigel blev kvantificeret efter inhibering af ERK-aktivitet ved hjælp U0126 behandling (10 eller 25 uM) eller ekspression af en kinase-død mutant for MEK-1 (dn-MEK). (F, G) De invasive egenskaber af shLRP-1-celler blev undersøgt efter en konstitutiv aktivering af ERK-2 (ca-ERK). Effektiviteten af ​​ERK inhibering i shCTRL (B) og ERK-aktivering i shLRP-1-celler (E) blev kontrolleret ved hjælp af phospho-ERK, ERK og p-actin-antistoffer. Anti-HA blev anvendt til at kontrollere niveauet af ekspression af overudtrykte HA-mærkede proteiner. (H) Tumorcelleinvasion blev målt efter inhibering af Src-afhængig aktivitet ved anvendelse af 10 uM af Src-kinase inhibitor I (Src inh). Repræsentative billeder vises for hver tilstand (D, G). Resultater blev opnået fra tre separate forsøg hver udført tredobbelt. Invasion blev bestemt ved tælling celler i otte tilfældige mikroskopiske felter per brønd. Resultaterne blev udtrykt som middel +/- SD efter normalisering ved sammenligning med bærer, dvs. DMSO for lægemiddelbehandlinger eller lipofectamin (lipo) til transfektion. NS, forskelle med tilsvarende kontrol var ikke signifikant. *,

P

. 0,05

Hæmningen af ​​JNK medieret af LRP-1 opretholder maligne celle invasion

Ligeledes undersøgte vi, i hvilket omfang LRP- 1-medieret inhibering af JNK-vejen kunne støtte carcinom celleinvasion. JNK1 og MKK-7 (MAPK kinase-7) var således co-udtrykkes i shCTRL celler (Fig. 5A). Invasion af shCTRL celler blev reduceret med 25%, når overudtrykker vildtype-JNK (fig. 5B og 5C), hvilket antyder, at JNK inhibering skal fremme invasion. Dernæst brugte vi den selektive JNK hæmmer SP600125 og en dominerende-negativ mutant af JNK at inddrive JNK hæmning i LRP-1-mangelfulde karcinomer (Fig. 5D). Vi har ikke observere nogen væsentlig graduering af ERK phosphorylering under disse betingelser (fig. S1). Interessant, den svage kapacitet LRP-1-tavshed celler at invadere blev øget betydeligt under JNK hæmning (fig. 5E og 5F). Disse resultater understøtter det koncept, at inhiberingen af ​​JNK-signalvejen medieret af LRP-1 bidrager til carcinom celleinvasion. Salg

celleinvasion assays blev udført med shCTRL (B, C) og shLRP-1-celler ( E, F) efter modulation af JNK-aktivitet (A, D). (B, C) ShCTRL celler blev transficeret ved ekspressionsvektor der koder for vildtype-MKK-7 /JNK-1 før celleinvasion blev kvantificeret. (E, F) De invasive egenskaber af LRP-1-lyddæmpede celler blev målt efter SP600125 behandling (5 eller 10 uM) eller transfektion af en dominant negativ mutant af JNK-1 (dn-JNK). JNK-aktivering i shCTRL (A) og JNK inhibering i shLRP-1-celler (D) blev bedømt ved hjælp af phospho-JNK, JNK og p-actin-antistoffer. Anti-HA og anti-FLAG blev anvendt til at kontrollere ekspressionen af ​​overeksprimeres mærkede proteiner. Repræsentative billeder vises for hver tilstand (C, F). Resultater blev opnået fra tre separate forsøg hver udført tredobbelt. Invasion blev bestemt ved tælling celler i otte tilfældige mikroskopiske felter per brønd. Resultaterne blev udtrykt som middel +/- SD efter normalisering ved sammenligning med bærer, dvs. DMSO for lægemiddelbehandlinger eller lipofectamin (lipo) for transfektioner. *,

P

. 0,05

Den LRP-1-medieret regulering af MAPK styrer fastgørelse af carcinomaceller

Vi rapporterede for nylig, at LRP-1 silencing kraftig nedsat invasionen af ​​maligne celler efter hinanden til en stærk ændring af cellematrixkonstruktion interaktion turn-over. Vi postulerede derfor, at LRP-1-afhængig styring af begge ERK og JNK pathways bidrager til at modulere cellematrixkonstruktionen interaktion til støtte invasionsevne. Som forventet, shLRP-1-celler, i hvilke ERK aktiviteten reduceres, vises en accelereret hastighed for fastgørelse til gelatineovertrukne overflader, sammenlignet med kontrol klonale celler (Fig. 6A). Desuden overekspression af en kinaseinaktiv MEK-1-mutant i shCTRL celler førte til forøget adhæsion rate (Fig. 6B), hvorimod konstitutivt aktiv ERK-2 faldt kapaciteten af ​​LRP-1-deficiente celler at vedhæfte (fig. 6C). Ja, efter 60 minutters vedhæftning blev adhærente celler forøget 2 gange ved ERK pathway inhibering (fig. 6B). Samtidig bindingspunktet, blev procentdelen af ​​vedhængende LRP-1-lyddæmpede celler faldt 2-fold under ERK-aktivering (fig. 6B og 6C). Ligeledes overekspression af vildtype MKK-7 /JNK-1 i kontrolceller, førte til en 2-fold øget vedhæftning efter 60 min (fig. 7A). Desuden blev den forøgede binding observeret i LRP-1-deficiente celler reverseres ved ekspression af en dominant-negativ form af JNK-1 (fig. 7B). Disse data understøtter konceptet, at LRP-1 opretholder maligne celler i en mellemliggende klæbende tilstand, der er gunstigt for invasion gennem ERK aktivering og JNK hæmning.

(A) shCTRL (hvide kasser) og shLRP-1 (grå kasser ) celler podedes på gelatineovertrukne plader og de ikke adhærente celler blev kasseret efter 30, 60 eller 90 min. Adhæsionsassays blev også udført med shCTRL celler, der overudtrykker en kinase-død mutant for MEK-1 (dn-MEK) (B) og shLRP-1 overudtrykker en konstitutivt aktiv ERK-2 (ca-ERK) (C). For hver betingelse, er resultater udtrykt i procent af tilsvarende kontrol adhærente celler efter 90 minutter. Hver værdi er middelværdien +/- SD for fire separate forsøg, idet hver udført in triplo. *,

P

. 0,05

shCTRL (hvide kasser) og shLRP-1 (grå kasser) celler blev podet på gelatine-belagte plader og de ikke vedhæftende celler blev kasseret efter 30, 60 eller 90 min. Adhæsionsassays blev udført med shCTRL celler, der overudtrykker vildtype MKK-7 /JNK1 (A) og shLRP-1 overudtrykker en dominant negativ mutant af JNK-1 (dn-JNK) (B) kinaser. For hver betingelse, er resultater udtrykt i procent af tilsvarende kontrol adhærente celler efter 90 minutter. Hver værdi er middelværdien +/- SD for fire separate forsøg, idet hver udført in triplo. *,

P

. 0,05

Den actin netværk af hurtigt invaderende karcinomer er reddet i LRP-1-tavshed celler efter reaktivering af ERK eller hæmning af hyperaktiveret JNK

Vi yderligere undersøgt, om LRP-1-afhængig regulering af MAPK signalering kunne orkestrere koordineringen af ​​actin og vedhæftning dynamik under malign celle invasion. Vi analyserede derfor den cellulære fordeling af fibrillær actin efter modulation af ERK og JNK aktiviteter (fig. 8). Adhærente kontrolceller vises en polariseret morfologi med filopodial celle udvidelser og en hovedsagelig cortically distribueret actin netværk (fig. 8A). I skarp kontrast LRP-1-silencing induceret spredte morfologi med talrige stress fibre, fremtrædende tværgående filamenter og et udviklet forgrenet actin netværk (fig. 8F). Hæmning af ERK signalering i kontrol kræftceller ved U0126 behandling (fig. 8B vs 8A) eller en dominerende-negativ form af MEK-1 (fig. 8D vs 8C) inducerede drastiske morfologiske ændringer svarende til dem opnået under LRP-1 lyddæmpning. Det samme resultat blev observeret efter ekspression af vildtype MKK-7 /JNK-1 i kontrolceller carcinomceller (fig. 8E vs 8C). I LRP-1-lyddæmpet celler, inhibering af JNK signalering ved SP600125 (fig. 8G vs 8F) eller overekspression af kinaseinaktiv JNK-1 (fig. 8J vs 8H) genoprettede mesenchymale morfologi af vildtype-carcinomceller. Desuden konstitutivt aktive ERK-2 (fig. 8I vs 8H) var tilstrækkelig til at vende den spredte morfologi forårsaget af inaktivering af LRP-1. Disse resultater viste, at LRP-1 lyddæmpning inducerer store aktincytoskelettet omlejringer direkte knyttet til ERK hæmning og JNK hyperaktivering.

shCTRL (A-E) og shLRP-1 (F-J) celler blev podet på gelatine-coatede plader til 120 min. ERK eller JNK aktiviteter blev moduleret. Kontrolceller blev behandlet med 25 pM U0126 (B) eller transficeret med en kinase-død mutant for MEK-1 (dn-MEK) (D) til at inhibere ERK-afhængige vej og JNK-aktivering blev opnået ved overekspression af både vildtype MKK-7 og JNK-1 (E). For LRP-1-deficiente celler, blev inhibering af JNK-banen opnås ved at anvende SP600125 behandling (10 uM) (G) eller overekspression af en dominant negativ form af JNK-1 (J), mens reaktivering af ERK-vejen blev opnået ved anvendelse af en ekspressionsvektor for konstitutivt aktive ERK-2 (i). DMSO (A, F) tjente som kontrol for medicinsk behandling (B, G) og lipofectamin (C, H) tjente som kontrol for transfektion assays (D, E, I, J). Celler blev farvet for actinfilamenter (rød) og kerner blev modfarvet med DAPI (blå). Billeder er repræsentative for mindst tre separate sæt af kulturer. Barer, 20 um.

LRP-1-afhængig aktivering af ERK og hæmning af JNK er nødvendig for FA demontering i hurtigt invaderende karcinomer

I betragtning af virkningen af ​​LRP-1 lyddæmpning på de klæbende og morfologiske egenskaber af carcinomceller (fig. 6, 7 og 8), undersøgte vi, om LRP-1-medieret styring af MAPK er nødvendig for FA vende-over. Således blev den cellulære fordeling af fokale komplekser analyseret i shCTRL og shLRP-1-celler efter differentiel aktivering af ERK og JNK pathways (Fig. 9A til 9J). LRP-1-silencing førte til akkumulering af talrige og højt strukturerede fokale komplekser på cellen periferi (fig. 9F vs 9A). Interferens med ERK-aktivering i kontrolceller med U0126 (fig. 9B vs 9A) eller en kinase-inaktiv form af MEK-1 (fig. 9D vs 9C) øgede antallet og størrelsen af ​​talin-holdige fokale kontakter i samme omfang som observeret i LRP-1-lyddæmpet celler (fig. 9F). Følgelig overekspression af vildtype MKK-7 /JNK-1 i LRP-1-udtrykkende kontrolceller stimulerede ophobning af talin-holdige perifere adhæsion strukturer (fig. 9E vs 9C). Derimod blev antallet af talin-rige strukturer drastisk reduceret i LRP-1-lyddæmpet celler ved anvendelse af en selektiv JNK-inhibitor (fig. 9G vs 9F) eller ekspression af en dominant negativ JNK-1-mutant (fig. 9J vs 9H ). Lignende resultater blev opnået, når en konstitutivt aktiv ERK-2 blev udtrykt i LRP-1-deficiente celler (fig. 9i vs 9H). Disse data viste, at JNK aktivering eller ERK hæmning i LRP-1-mangelfulde celler kunne genoprette den oprindelige fordeling af vedhæftning komplekser. Procentdelen af ​​celler positive for FA blev efterfølgende kvantificeret, som allerede beskrevet [17]. Som vist i fig. 9K og 9L, antallet af LRP-1-udtrykkende cancerceller positive for talin-rige adhæsionskomplekser blev øget med ca. 1,4 gange under ERK inhibering (U0126 og dn-MEK) og 1,7 gange under JNK-aktivering (MKK-7 /JNK-1). Derimod blev det øgede antal fokale kontakter forårsaget af LRP-1 lyddæmpning delvis vendes ved ERK aktivering (ca-ERK) eller JNK hæmning (SP600125 og dn-JNK). Derfor synes LRP-1 som en primær formidler af vedhæftning forstyrrelser gennem regulering af ERK og JNK signalveje.

(A-J) shCTRL (A-E) og shLRP-1 (F-J) celler podedes på gelatineovertrukne plader i 120 minutter. ERK signalvej blev inhiberet i shCTRL celler ved anvendelse af 25 pM U0126 (B) eller en kinase-dead MEK-1 mutant (dn-MEK) (D) og genaktiveret i shLRP-1-celler ved en konstitutiv aktivering af ERK-2 (ca -ERK) (I). MKK-7 /JNK1 vektor blev anvendt til at udløse JNK-aktivering i shCTRL celler (E), mens JNK inhibering i LRP-1-deficiente celler blev opnået ved anvendelse af en 10 uM SP600125 (G) eller en dead-kinase til JNK-1 ( dn-JNK) (J). DMSO (A, F) tjente som en kontrol for medicinsk behandling (B, G) og lipofectamin (C, H) tjente som en kontrol for transfektioner (D, E, I, J). Celler blev derefter farvet for talin (grøn) og kerner blev modfarvet med DAPI (blå). Billeder er repræsentative for mindst tre separate sæt af kulturer. Barer, 20 uM. (K, L). Procenten af ​​celler positive for fokale adhæsioner blev kvantificeret efter modulationen af ​​ERK og JNK aktiviteter ved hjælp af selektive lægemiddelbehandlinger (K) eller den angivne MAPK-konstruktionen (L). For hver betingelse blev tre hundrede celler fra tre separate forsøg evalueret. Resultaterne blev udtrykt i procent, sammenlignet med shCTRL-celler behandlet med DMSO (K) eller lipofectamin (L). *,

P

. 0,05

LRP-1 er forbundet med cytoskeleton og FA komponenter og styrer rekruttering af aktive MAPK til grupper komplekser

For at klarlægge den molekylære mekanisme, hvormed LRP-1 styrer FA dynamik og cytoskeletorganisation gennem MAPK regulering blev immunopræcipitationsanalyser udført (fig. 10). Dataene præsenteret i figur 10A viste, at α-actinin, talin og paxillin interagere med LRP-1 β-kæden i fast-invaderende carcinomceller. Interessant, vi har registreret også en associering mellem LRP-1 og aktiv phospho-Shp-2 (SH2-domæne-holdige protein-tyrosin-phosphatase-2), PP2A (serin /threonin proteinphosphatase 2A), og PAK (p-21 aktiveret kinase), som er centrale regulatorer af MAPK signalering. Andre molekylære relæer såsom Ras og MEK blev også findes associeret til LRP-1-ICD (Fig. S2). Sammensætningen af ​​talin-holdige komplekser blev derefter analyseret i LRP-1-lyddæmpede celler sammenlignet med kontrolgruppen tumorceller (fig. 10B). Som forventet blev en øget mængde af talin observeret i LRP-1-deficiente celler. Desuden blev mængden af ​​paxillin i talin-holdige komplekser specifikt ændres under LRP-1 lyddæmpning hvorimod α-actinin ikke var. Interessant nok blev de aktive former af ERK hovedsageligt påvist i talin-holdige komplekser af LRP-1-udtrykkende celler. Endvidere observerede vi en stærk akkumulering af phospho-JNK i disse komplekser under LRP-1 nedregulering.

shCTRL og shLRP-1-celler blev udpladet på gelatineovertrukne overflader og helcelleekstrakterne blev anvendt til at udføre immunopræcipitationsforsøg (IP). (A) Immunopræcipitation af LRP-1-holdige komplekser blev udført ved anvendelse af de monoklonale anti-LRP-1-antistoffer (8G1). Immunkomplekser blev derefter immunblottet (IB) ved anvendelse af specifikke antistoffer for LRP-1 β-kæde, α-actinin, talin, paxillin, phospho-Shp-2, PP2A og PAK. (B) Talin-holdige komplekser blev immunpræcipiteret og analyseret ved Western-blot ved anvendelse af anti-talin, anti-phospho-ERK, anti-phospho-JNK, anti-α-actinin og anti-paxillin antistoffer. Uspecifikke IgG’er blev brugt som en negativ kontrol af immunopræcipitationsanalyser.

Diskussion

I betragtning af manglen på molekylær viden om LRP-1 i feltet kræft, vi undersøgte intracellulær signalering forbinder LRP-1 til den aggressive opførsel af tumorceller. Vores resultater fremhævet, at LRP-1 opretholder maligne celler i en klæbende tilstand gunstigt for invasion ved at styre ERK og JNK-afhængige veje.

Vi først påvist, at LRP-1-ekspression i carcinomceller udløser serum-medieret aktivering af ERK og er ansvarlig for den konstitutive hæmning af JNK. I overensstemmelse med vores resultater har tidligere undersøgelser rapporteret en formindsket phosphorylering af ERK-1/2 i LRP-1-deficiente ikke-tumorceller [15], [32]. På den anden side, Ma og samarbejdspartnere rapporterede, at LRP-1 kunne undertrykke ERK-aktivering for at kontrollere celle mobilitet [31]. I HT1080 fibrosarcomceller, Webb og hans kolleger viste, at LRP-1-mangel ført til øget phosphoryleret ERK niveau, der stimulerer celle migration og invasion [33]. I disse undersøgelser aktivering af ERK i LRP-1-deficiente celler krævede ekspression af uPAR, uPA receptoren, som binder vitronectin. Disse resultater syntes at være meget vitronectin-afhængige siden uPAR-vitronectin interaktion er velkendt for at være tilstrækkelig til at indlede downstream ændringer i cellevandring og signaltransduktion [34]. Evnen af ​​LRP-1 til at mediere den endocytiske optagelse af uPAR og nedregulere celleoverfladen mængde uPA: uPAR kompleks blev ofte evoked at forklare kontrol med ERK-aktivering ved LRP-1 [31], [33], [35 ]. Desværre fik shRNA-medieret knock-down af LRP-1 ikke påvirke celleoverfladen niveau af uPAR i vores model [17]. Selvom ERK aktivering blev rapporteret som reaktion på ligandbinding til LRP-1 [15], [19], [32], [36], er et klart overblik over de underliggende mekanismer stadig mangler.