PLoS ONE: Overekspression af COL11A1 af Cancer-associerede fibroblaster: kliniske relevans af en Stromal Marker i pancreas Cancer

Abstrakt

Baggrund

collagen11A1 (COL11A1) genet overudtrykt i kræft i bugspytkirtlen. Udtrykket af COL11A1 protein kunne være involveret i desmoplastiske begivenheder i bugspytkirtelkræft, men et antistof, der specifikt pletter COL11A1 protein er i øjeblikket ikke tilgængelig.

Metoder og resultater

I alt 54 pancreas ductal adenokarcinomer (PDAC), 23 kronisk pancreatitis (CP) prøver, og dyrkede peritumorale stromale celler af PDAC (passager 3-6) blev undersøgt. Normale menneskelige bugspytkirtel vævsprøver blev opnået gennem en afdød organdonation program.

1) Validering af COL11A1 gen overekspression af q-RT-PCR. Resultater:. Ekspression af COL11A1 gen steget betydeligt i PDAC prøver vs normale og CP prøver

2) Analyse af COL11A1 ved immunhistokemi hjælp meget specifikke anti-proCOL11A1 antistoffer. Fund:. Anti-proCOL11A1 pletter stromale celler /cancer-associerede fibroblaster (CAFS) af PDAC men det ikke pletter kronisk godartet tilstand (kronisk betændelse i bugspytkirtlen) stromale celler, epitelceller, eller normale fibroblaster

3) Evaluering af diskriminationen evne af antistoffet. Fund:. Anti-proCOL11A1 immunfarvning præcist skelner mellem PDAC og CP (AUC 0,936, 95% CI 0,851, 0,981)

4) Fænotypisk karakterisering af proCOL11A1 + stromaceller co-farvning med mesenkymale, epitelial og stjerneformet celle markører på pancreas vævsprøver og dyrkede peritumorale bugspytkirtelkræft stromale celler. Resultater: ProCOL11A1 + celler til stede co-farvning med mesenkymale, stjerneformet og epitel markører (EMT fænotype) i forskellige proportioner

Konklusioner /Betydning

Påvisning af proCOL11A1 gennem immunfarvning med denne nyudviklede antistof tillader. for en meget nøjagtig skelnen mellem PDAC og CP. I modsætning til andre tilgængelige antistoffer almindeligvis anvendes til påvisning af CAF, anti-proCOL11A1 er negativ i stromale celler fra de normale pancreas og næsten fraværende i godartet inflammation. Disse resultater tyder på, at proCOL11A1 er en specifik markør for CAF, og dermed anti-proCOL11A1 er et kraftfuldt nyt værktøj til kræftforskning og klinisk diagnostik

Henvisning:. García-Pravia C, Galván JA, Gutiérrez-Corral N, Solar-García L, García-Pérez E, García-Ocaña M, et al. (2013) Overekspression af COL11A1 af Cancer-associerede fibroblaster: kliniske relevans af en Stromal Marker i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 8 (10): e78327. doi: 10,1371 /journal.pone.0078327

Redaktør: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Spanien

Modtaget: April 28, 2013; Accepteret: September 11, 2013; Udgivet: 23. oktober 2013 |

Copyright: © 2013 García-Pravia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning er blevet samfinansieret af EFRU Midler fra Europæiske Unionen; af INNPACTO-ONCOPAN IPT-010000-2010-31 Projekt; af Fiss-09- PS09 /01.911 Project, Ministeriet for videnskab og innovation, Spanien; af FC-11-PC10-23 Project, FICYT, Axe 1 af EFRU Operative rammeprogram Asturien, Spanien 2007-2013; og ved Progenika Biopharma, S.A. og Oncomatrix, S.L. Derio, Spanien. Den proCOL11A1 mAb er blevet patenteret af Oncomatrix, S.L. (PCT /ES2012 /070.616, WO 2013/021088 A2). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Antistoffet beskrevet i denne undersøgelse er under et patent indgivet af Drs. Luis Barneo, Carmen García-Pravia, Juan R. de los Toyos, Marcos García-Ocaña, jokin Del Amo-Iribarren, Laureano Simón-Buela og andre med titlen: METODER OG PRODUKTER TIL in vitro-diagnostik in vitro Prognose og udvikling af lægemidler mod invasiv karcinom (PCT /ES2012 /070.616, WO 2013/021088 A2). Jokin Del Amo-Iribarren arbejder for Progenika Biopharma, S.A. og Laureano Simón-Buela arbejder for Oncomatrix, S.L. Denne undersøgelse blev delvist finansieret af Progenika Biopharma, S.A. og Oncomatrix, S.L. Der er ikke andre patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) repræsenterer den fjerde hyppigste dødsårsag af kræft hos mænd og kvinder. Det 5-års overlevelse er mindre end 5% og gennemsnitlig overlevelsestid er 6 måneder efter den første diagnose. Selv i patienter, der gennemgår resektion, langsigtede overlevelse er fortsat ekstremt fattige [1]. På nuværende tidspunkt er der ingen tidlig diagnosticering metoder eller effektive terapier til anvendelse mod denne type tumor. Trods fremskridt der er gjort i diagnose og behandling, pancreascancer fortsat har den værste prognose af alle faste maligne tumorer. Kræft i bugspytkirtlen er paradigmet af avancerede neoplastisk sygdom: uafhængigt af TNM fase, de fleste patienter stede med dissemineret sygdom i de tidlige faser [2]. Endvidere pancreascancer er resistent over for kemoterapi og strålebehandling [3].

pancreascarcinom er kendetegnet ved en desmoplastiske reaktion, der involverer cellulære og acellulære komponenter, såsom fibroblaster (aktiveret eller hviler), myofibroblasts, pericytter, pancreas stjerneformet celler, immunceller, blodkar, den ekstracellulære matrix og opløselige proteiner, såsom cytokiner og vækstfaktorer [4,5]. Denne heterogene stroma påvirker flere aspekter af PDAC og synes at fremme tumorvækst, invasion, og resistens mod kemoterapi [6-9].

Kronisk pancreatitis er en inflammatorisk sygdom karakteriseret ved irreversibel og progressiv ødelæggelse af orglet, hvilket resulterer i eksokrin og endokrine insufficiens. Den tabte parenkym erstattes af tæt fibrøst væv med infiltrerende leukocytter og kanalsystem hyperplasi. Kronisk pancreatitis øger risikoen for at udvikle kræft i bugspytkirtlen [10-12], hvilket antyder, at kronisk betændelse i bugspytkirtlen kan være en disponerende faktor til udviklingen af ​​cancer. Årsagssammenhængen mellem kronisk betændelse og kræft blev beskrevet to århundreder siden af ​​Marjolin [13], men de inflammatoriske mediatorer, der fører til udvikling af kræft forbliver udefineret.

Blandt de tumor-associerede matrix kollagener, fibrillære collagener er den mest iøjnefaldende. Kollagener syntetiseres som procollagener af fibroblaster. Disse procollagenerne har en vigtigste centrale triple-helix domæne, der er udpeget som α1, α2, og α3 og kodet af specifikke gensekvenser. Når secerneres til det ekstracellulære miljø, er disse procollagener spaltes, og derefter de modne kollagenmolekyler samles ekstracellulært i fibriller. I normale væv, kollagen type I, II og III er de vigtigste større fibrillære kollagener, mens collagener V og XI er mindre rigelige mindre fibrillære kollagener [14]. Collagener V og XI deler en 75% homologi på deres aminosyresekvens niveau. Procollagener α1 typer V og XI er kodet efter COL5A1 og COL11A1 generne.

Studier af fibroblasterne i nærheden af ​​tumoren, de såkaldte cancerassocierede fibroblaster (CAF), har vist deres rolle ved stimulering af tumorudvikling [15-20]. De kendetegn for CAF er blevet undersøgt i dybden, der viser, at deres genotypisk udtryk, vækstmønster, vandrende adfærd og sekretion af vækstfaktorer adskiller sig fra de normale fibroblaster [15,21]. Men forskerne ikke har konkrete værktøjer til at differentiere CAF fra inflammatoriske fibroblaster. Vimentin (VIM) og alfa-glatmuskelactin (αSMA) anvendes ofte til at identificere CAF, men disse biomarkører er ikke specifikke, da de plette inflammatoriske fibroblaster og andre celler samt. Vi har tidligere identificeret 116 gener, der blev overudtrykt i PDAC anvendelse af DNA microarrays [22] (se File S2). Vi fandt gener af den ekstracellulære matrix, hvis ekspression blev øget i forhold til normal og kronisk pancreatitis (CP) væv. En af de mest markant og konsekvent overudtrykte gener var COL11A1 (tabel S1 i File S1). Betragtning af manglen på en pålidelig kommerciel antistof, genereret vi en kanin polyklonalt antiserum til en yderst specifik aminosyre strækning af human proCOL11A1 for at vurdere proteinniveauet udtrykt i pancreascancer [23]. Efterfølgende udviklede vi et monoklonalt antistof [24], meget specifikt for humant proCOL11A1, som klart markerer disse peritumorale stromale celler.

I dette studie vi forsøgte at bekræfte overekspression af COL11A1 gen i PDAC. Derudover har vi vurderet den kliniske anvendelighed af immunpåvisningen af ​​proCOL11A1 i PDAC og CP væv. Endelig har vi udforsket fænotypiske karakteristika COL11A1-udtrykkende celler i bugspytkirtlen stroma.

Materialer og metoder

Patient karakteristika og væv prøveudtagning

immunhistokemi studier med anti-proCOL11A1 pAb blev udført på 54 PDAC og 23 CP (20 alkoholiker, 2 autoimmune, en galde) historiske paraffinindlejrede prøver fra kirurgiske prøver fra patienter, som gennemgik kirurgi på hospitalet Universitario Central de Asturias, Oviedo, Spanien. Gennemsnitsalderen for de patienter med PDAC var 65 ± 9 år (46-81 år), og 56 ± 12 år (25-73 år gamle) af patienterne med CP. Den kønsbestemte ratio (M /K) var 37/17 for PDAC patienter, mens mandlige overvægt var endnu højere i CP patienter (22/1). (.. AJCC Cancer Staging Manual 7th ed 2010) Fordelingen af ​​PDAC tumor fase i henhold til TNM klassifikation var: IA, 13%; IB, 17%; IIA, 19%; IIB, 37%; III, 6%; IV, 9%. Den neoplastiske indplacering var: G1, 20%; G2, 66%; G3, 12%; G4, 2%. Den anti-proCOL11A1 mAb blev anvendt til 69 (51 PDAC og 18 CP) i de foregående tilfælde. Frisk fjernet PDAC, CP og normale pancreas vævsprøver blev straks snap-frosset i flydende nitrogen i operationsstuen og opbevaret ved -80 ° C indtil bearbejdning. De normale humane bugspytkirtel vævsprøver blev opnået gennem en afdød organdonation program (6 tilfælde, alle 41-76 år gamle hanner) og blev anvendt til q-RT-PCR. Friske prøver blev anvendt til at isolere og dyrke fibroblaster. Q-RT-PCR-undersøgelser blev anvendt på frosne PDAC og CP prøver. Denne undersøgelse er i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og blev godkendt af Hospital Universitario Central de Asturias komité (Projekt nr 42/12). Alle patienter underskrevet samtykke formularer med angivelse af deres vilje til at deltage og deres forståelse af proceduren og generelle formål med undersøgelsen.

Kvantitativ RT-PCR af COL11A1

Total RNA blev isoleret fra bugspytkirtlen biopsier hjælp TRIzol reagens (Life Technologies), og cDNA blev syntetiseret med revers transkriptase-enzymet SuperScript II RNAse (Life Technologies). Alle PCR-reaktioner blev kørt i duplikat på en LightCycler 2.0 (Roche) under anvendelse af FastStart DNA Master SYBR Green I kittet (Roche). Primersekvenser var som følger: COL11A1 (målgenet): forward 5’TGGTGAT CAGAATCAGAAGTTCG 3 ‘, reverse 5’AGGAGAGTTGAGAATTGGGAATC 3’; Ribosomprotein L10 (henvisning gen): frem 5’TGCGATGGCTGCACACA 3 ‘, omvendt 5’TCCCTTAGAGCAACCCATACAAC 3’. Effektiviteten af ​​PCR-reaktionerne blev beregnet ved anvendelse referencekurver med serielle fortyndinger af cDNA. Forholdene mellem normaliserede genekspression værdier blev bestemt under anvendelse af den relative kvantificering ligning, som korrigerer for forskelle i PCR effektivitet [25]. Endelig blev genekspression data sammenlignet mellem tumor og kontrolprøver ved anvendelse af Mann-Whitney U test.

Polyklonalt antiserum mod den variable region af humant procollagen 11a1 (anti-proCOL11A1 pAb)

Vi har tidligere beskrevet generation af denne antiserum [23]. Kort fortalt, efter den rekombinante COL11A1-TGST fusionsprotein blev konstrueret, udtrykt og oprenset, blev en New Zealand hvid kanin injiceret intramuskulært ved 2-ugers intervaller med 2 ml immunogen emulsion af det oprensede COL11A1-T-GST-fusionsprotein (se File S2). Det opnåede ved hjertepunktur antiserum blev udtømt for den anti_GST reaktivitet. IgG-fraktionen blev oprenset ved anvendelse af protein ASepharose.

Mus monoklonalt antistof til human procollagen 11a1 (anti-proCOL11A1 mAb)

Metoden til generering af anti-humant proCOL11A1 monoklonalt antistof og til karakterisering deraf er blevet offentliggjort [24]. Sammenfattende blev det oprenset COL11A1-T-GST-fusionsprotein anvendes til at hyperimmunize BALB /c-mus. Brug af Sp2 /0 myelomaceller som fusionspartneren, B-celle hybridomer blev dannet ved standardmetoder. Antistoffet, DMTX1, blev leveret af Oncomatrix, SL, Derio, Spanien (Ref # P0002, vare # 200212).

Etablering af cellekulturer

Prøver blev opnået fra tumor-området, peritumoral område og normalt område ved hjælp af forskellige kirurgiske knive til at undgå forurening. Repræsentative portioner blev histologisk undersøgt. Prøverne blev transporteret i RPMI-1640 medium (Gibco, Invitrogen) suppleret med amikacin og vancomycin (Normon Laboratories, Madrid, Spanien, både ved 40 ug /ml) til kulturen laboratorium, hvor de blev skåret i mindre fragmenter under anvendelse af kirurgiske sakse. De opnåede fragmenter blev enzymatisk fordøjet med collagenase (type I 2 mg /ml, Sigma) i 1-2 timer. Efter fordøjelse blev collagenaseopløsningen centrifugeret ved 400 g i 10 minutter. Pelleten blev resuspenderet i en fibroblast dyrkningsmedium (Dulbeccos modificerede Eagles medium (Gibco, Invitrogen) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS, Gibco, Invitrogen), amikacin og vancomycin (begge ved 40 ug /ml). Vævet fragmenter, ikke var blevet fordøjet med collagenase undergik en anden fordøjelse med 0,05% trypsin og 0,02% EDTA (T /E, Gibco, Invitrogen, Barcelona, ​​Spanien) i 30-60 minutter. Den fjernede T /E blev inaktiveret med serumholdigt dyrkningsmedium (DMEM + 10% FCS) og centrifugeret ved 400 g i 10 minutter. pelleten blev resuspenderet i fibroblast dyrkningsmedium. celler opnået fra collagenase fordøjelse og trypsin fordøjelse blev podet i seks-brønds plader ved anvendelse af fibroblast dyrkningsmedium og opretholdt ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. mediet blev skiftet hver 3. dag. Når den primære kultur blev konfluerende, blev cellerne vasket to gange med PBS og behandlet med T /E, indtil de blev frigjort. Derefter T /E blev neutraliseret med kultur medium og centrifugeret ved 400 g i 10 minutter for at genvinde cellerne. Alle stromale celler blev anvendt på tidlige passager (passager 3-6). Cellen renhed stromale celler blev vurderet ved morfologi og ved immunfarvning for vimentin.

Immunhistokemi og dobbelt immunfarvning i pancreas væv resektion

Den opnåede fra bugspytkirtlen prøver væv blev fikseret i en 10% formaldehyd opløsning, paraffinindlejret, skåret 3 um tyk og farvet med H SLR: 7)

Alle PDAC prøver testet med anti-proCOL11A1 mAb og. med antiproCOL11A1 pAb viste stærk intracytoplasmatisk mærkning af tumor-omgivende desmoplastiske stromale CAF (Figur 2E, figur S1D i File S1). Farvningen var ikke udbredt, men snarere lokaliseret i begrænsede peritumorale områder, selv hvor tumorceller ikke blev set. De morfologiske træk ved disse fibroblastlignende stromaceller var forenelige med de myofibroblaster (figur SLE, F i File S1). Ekstracellulær farvning blev aldrig observeret. I modsætning hertil ekspressionen af ​​proCOL11A1 i kronisk pancreatitis prøver var enten fraværende (figur 2A, figur S1B i File S1) eller meget lav og begrænset til nogle få stromaceller. CP stroma viste fibrotiske og inflammatoriske forandringer uden bemærkelsesværdige myofibroblastisk befolkning. Normale pancreas og epiteliale tumorceller, på den anden side, viste ingen farvning overhovedet med anti-proCol11A1 (figur S2 i File S1). Normale bugspytkirtel viste farvning med VIM og αSMA, men farvede ikke med GFAP. Størstedelen af ​​CP (figurerne 2C, D) og PDAC (fig 2G, H) stromaceller udviste stærk intracellulær farvning med VIM og αSMA. Den farvning med desmin var intens i PDAC (figur 2F) prøver, men ikke-eksisterende i CP (Figur 2B) prøver. Figur S3 i File S1 viser positiv farvning med anti-proCOL11A1 mAb (score 4) og desmin i et tilfælde af autoimmun pancreatitis; Desuden er intens positivitet med VIM og αSMA, og negativitet med GFAP observeret.

Stromaceller i CP var negative for anti-proCOL11A1 mAb (A) og desmin (B) at et stort antal af stromale celler af PDAC udtrykte anti-proCOL11A1 mAb (E) og desmin (F). I CP og PDAC pletten af ​​stromale celler til αSMA (C og G, henholdsvis) og VIM (D og H, henholdsvis) var diffust og ikke-selektive. Anti-proCOL11A1 mAb (A og E), desmin (B og F), αSMA (C og G) og VIM (D og H) (alle mikrofotografier ved × 400, Målestok 50 um).

Karakterisering af pancreas CAF

for at karakterisere CAF, pancreas vævssnit var dobbelt farvet for proCOL11A1 /desmin, proCOL11A1 /αSMA, proCOL11A1 /VIM, proCOL11A1 /GFAP, proCOL11A1 /CK7 og CK7 /VIM (Figur 3 ). Et meget stort antal mesenchymal-celler blev stærkt mærket til VIM og αSMA. Immunfarvning med GFAP var negativ. Som en del et lille antal celler var proCOL11A1 + og desmin +. Co-farvning af VIM eller CK7 med proCOL11A1 identificeret en delmængde af CAF med mesenkymale fænotype (proCOL11A1 + /VIM +) og meget få celler med epitelial fænotype (proCOL11A1 + /CK7 +) (figur 3 og E, henholdsvis). Nogle desmin eller αSMA celler co-farvet med proCOL11A1 (Figur 3 A og B, henholdsvis). Men CP stroma prøverne ikke viser farvning med proCOL11A1, desmin eller GFAP, og der var ingen co-farvning (figur 4).

A, anti-proCOL11A1 (brun)

vs

. desmin (magenta); B, anti-proCOL11A1 (brun)

vs

. αSMA (magenta); C, anti-proCOL11A1 (brun)

vs

. VIM (magenta); D, anti-proCOL11A1 (brun)

vs

. GFAP (ikke farvning); E, anti-proCOL11A1 (brun) vs. CK7 (magenta); F, CK7 (epitelial tumorceller:

brun

) vs. VIM (magenta) (alle mikrofotografier ved × 200, Scale bar 200 um, indsat X1000).

A, anti-proCOL11A1 (brun)

vs

. desmin (magenta); B, Anti-proCOL11A1 (brun)

vs

. αSMA (magenta); C, anti-proCOL11A1 (brun)

vs

. VIM (magenta); D, anti-proCOL11A1 (brun)

vs

. GFAP (ikke farvning); E, anti-proCOL11A1 (brun) vs. CK7 (magenta); F, CK7 (epitelial tumorceller:

brun

) vs. VIM (magenta) (alle mikrofotografier ved × 200, Scale bar 200 um).. .

Cellen fordeling af dyrkede CAF blev analyseret ved co-lokalisering med immunocytofluorescence. De resulterende data er vist i tabel 2 (figur 5). Fortolkningen af ​​tabellen er som følger: når en dobbelt farvning blev påført de dyrkede pancreas CAF, f.eks proCOL11A1 og CK7, i alt 188 celler blev farvet; Heraf blev 82-celler mærket med anti-proCOL11A1, 60-celler var CK7 positive, og 46 celler blev farvet med begge antistoffer. Den samme logik gælder for resten af ​​farvninger. Ifølge de data vist i tabel 2, blandt proCOL11A1 celler, 36% er CK7 +, 49% er VIM + og 48% er αSMA +; blandt cellerne med VIM fænotype, 21% er proCOL11A1 + og kun 8% er CK7 +; 33% af αSMA celler deler proCOL11A1 fænotype; og endelig 45% af CK7 celler har VIM + fænotype og 43% har proCOL11A1 fænotype. Fordelingen af ​​proCOL11A1, CK7 og desmin fænotyper i vævsprøver er vist i tabel S2 i File S1. Det var ikke muligt at analysere de områder, hvor cellerne er VIM + og αSMA + på grund af det store antal farvede celler, hvilket gør det kompliceret at individualisere og tælle dem. Ifølge de data vist i tabel S2 i File S1, 18% af proCOl11A1 celler er CK7 +, og 21% er desmin +; 45% af de celler farvning med desmin har proCOL11A1 fænotype, og 50% af CK7 celler er proCOL11A1.

ProCOL11A1 /CK7 (DI)

proCOL11A1 /VIM (DI)

proCOL11A1 /αSMA (DI)

VIM /CK7 (DI)

proCOL11A1 + kun 82 (43%) proCOL11A1 + kun 106 (18%) proCOL11A1 + kun 73 (23%) VIM + kun 364 (85%) CK7 + kun 60 (32%) VIM + kun 370 ( 64%) αSMA + kun 138 (50%) CK7 + kun 36 (8%) proCOL11A1 + /CK7 + 46 (25%) proCOL11A1 + /VIM + 101 (18%) proCOL11A1 + /αSMA + 67 (24%) VIM + /CK7 + 30 (7%) I alt 188 (100%) i alt 577 (100%) i alt 278 (100%) i alt 430 (100%) tabel 2. Kvantitativ analyse af celle fordeling i dyrkede peritumorale bugspytkirtelkræft fibroblaster (passage 3)

*.

* En patient prøve, værdiansættelse på fem felter for hver dobbelt immunfarvning (DI) eksperiment. Celler farvet med både Ab med fed. CSV Hent CSV

Dobbelt fluorescens plet illustrerer tilstedeværelsen af ​​celler proCOL11A1 + /CK7 +, proCOL11A1 + /αSMA + og proCOL11A1 + /VIM +.

Red

: proCOL11A1;

grøn

: CK7, αSMA og VIM henholdsvis;

blå og: kerner. Mellemværker: tilfældigt taget høj effekt områderne kultur. Scale bar 100 um (X200) og 20 um (X630).

PDAC vs. CP

De karakteristika for hver enkelt patient og hans /hendes patolog s proCOL11A1 immunfarvning score er vist i tabel S3 i File S1. Der var en statistisk signifikant forskel mellem PDAC og kronisk pancreatitis i mAb score (gennemsnit ± SD: 7,33 ± 4,04 vs. 0,61 ± 1,33; P 0,0001). Dataene er vist i figur 6. AUC af ROC kurver PDAC vs. CP var 0,936 (0,851-0,981), P 0,0001 (figur 7). Den immunfarvning viste en sensitivitet på 92% og en specificitet på 83% i at diskriminere PDAC fra CP, med en nøjagtighed på 90%. Anvendelsen af ​​pAb viste en lignende resultat diskriminerende PDAC fra CP (tabel S4 i File S1). Observationelle overensstemmelse mellem patologer var 90%. Farvningen score korrelerede ikke til patientens alder, køn, tumor stadium eller kvalitet. Foreningen med patienten samlet overlevelse blev ikke undersøgt, fordi antallet af PDAC patienter med en lav score var meget lav (4/51 tilfælde) Salg

Bars:.. ± 1 SD

μ angiver skæringspunktet med den bedste separation (minimale falsk negative og falsk positive resultater) mellem de to grupper.

Immunfarvning blev også vurderet ved hjælp af QWin billede analyse software. Resultaterne er vist i tabel S5 i File S1. Der er en statistisk forskel mellem PDAC og CP i antallet af positive celler i den farvede overflade og i referenceområdet. Inden for samme serie, der var en høj overensstemmelse mellem patologen score og QWin data som overfladearealet af de farvede celler, og antallet af positive celler (Spearman rang korrelationskoefficient = 0,825 og 0,825, henholdsvis). ROC kurve AUC data blev opnået for de seks billede-analyse parametre (tabel S6 i File S1). Alle parametre tillader forskelsbehandling mellem PDAC og kronisk pancreatitis. De mest relevante parametre var antallet af positive celler og overfladearealet af de farvede celler.

Discussion

DNA microarrays tillade samtidig analyse af ekspressionsniveauet for tusinder af gener og kunne klarlægge de mekanismer af pancreas carcinogenese [26-31]. Den første undersøgelse at anvende denne teknik til kræft i bugspytkirtlen med succes identificeret et sæt af gener, der udtrykkes forskelligt i bugspytkirtelkræft [32]. Andre undersøgelser har ført til identifikation af både tidligere beskrevne og nye kandidatgener [33-39,50]. De fleste af de identificerede gener kunne ikke valideres af andre mere præcise teknikker på enten mRNA eller proteinniveauet. Vi har fokuseret vores studier på de gener med potentiel interesse som markører og /eller terapeutiske mål [23], hvoraf den ene er COL11A1.

I denne rapport bekræfter vi den immunhistokemiske udtryk for COL11A1 i PDAC. Tidligere observationer på ekspressionen af ​​COL11A1 i andre cancere [40-44] var begrænset til differentiel genekspression analyser valideret ved kvantitative RT-PCR, Northern blots og /eller in situ-mRNA-hybridisering. For nylig har ekspression af collagen XI i både normal og malign human colon væv blevet vurderet ved immunohistokemi [45].

En beregningsanalyse af genekspression i forskellige cancertyper [46] viser, at overekspression af COL11A1 og andre gener er en høj-specificitet biomarkør for cancer invasion og forudsiger reaktion på neoadjuvansterapi. Nedreguleringen af ​​COL11A1 i in vitro co-kulturer af bugspytkirtelkræft og stromaceller [47] er blevet rapporteret. Disse in vitro observationer understøttes ikke af ex vivo-data; den kunstige in vitro betingelser ikke opfylder alle krav eller råd til alle de lokale faktorer, der bidrager til høj COL11A1 udtryk.

Så vidt vi ved, har ingen specifik markør for CAF blevet rapporteret. Konventionel farvning viste ikke forskelle mellem CAF og normale fibroblaster. A: CP (H B, desmin, positiv kontrol (indsat): tillæg; C, alpha-glatmuskelactin, positiv kontrol (indsat): appendix; D, vimentin, positiv kontrol (indsat): bilag); E, GFAP, positiv kontrol (indsat): astrocytom). Serielle sektioner (alle mikrofotografier ved × 200, Scale bar 200 um). A, anti-proCOL11A1 mAb, positiv kontrol (indsat): cellelinje A204); B, desmin, positiv kontrol (indsat): bilag); C, alpha-glatmuskelactin, positiv kontrol (indsat): bilag); D, vimentin, positiv kontrol (indsat): bilag); E, GFAP, positiv kontrol (indsat): astrocytom). Serielle sektioner (alle mikrofotografier ved × 200, Scale bar 200 um).