PLoS ONE: en opløselig form af Giant Cadherin -fedt1 frigives fra bugspytkirtelkræftceller af ADAM10 Mediated ektodomæne Shedding

Abstrakt

I kræft i bugspytkirtlen, der er et klart udækket behov for at identificere nye serum markører for enten tidligt diagnose, terapeutisk lagdeling eller patientovervågning. Proteomisk analyse af tumor celle secretomes er en lovende metode til at indikere proteiner frigivet fra tumorceller

in vitro

. Ektodomæne udgydelse af transmembrane proteiner er tidligere blevet vist at bidrage signifikante fraktioner tumorcellen secretomes og skabe værdifulde serum biomarkører. Her indfører vi en opløselig form af den gigantiske cadherin -fedt1 som en ny biomarkør kandidat. -fedt1 Udtryk og proteolytisk behandling blev analyseret ved massespektrometri og Western blotting hjælp kræft i bugspytkirtlen cellelinjer i forhold til menneskets bugspytkirtel duktale epitelceller. RNA udtryk i kræft væv blev vurderet ved

i silico

analyse af offentligt tilgængelige microarray data. Inddragelse af ADAM10 (A disintegrindomænet og metalloproteinase domæne-holdigt protein 10) i -fedt1 ektodomæne kaste blev analyseret ved kemisk hæmning og Knockdown eksperimenter. En sandwich ELISA blev udviklet for at bestemme niveauer af opløseligt -fedt1 i serumprøver. I nærværende rapport beskriver vi udgivelsen af ​​høje niveauer af ektodomænet af -fedt1 cadherin i secretomes af humane bugspytkirtelkræftceller

in vitro

, en proces, der medieres af ADAM10. Vi bekræfter fuldlængde og forarbejdet heterodimer form af -fedt1 udtrykt på plasmamembranen og viser også den p60 C-terminale transmembrane rest fragment svarende til skuret ektodomænet. -fedt1 Og dens sheddase ADAM10 er overudtrykt i bugspytkirtlen adenokarcinomer og ektodomæne udgydelse er også sammenfattet

in vivo

fører til øget -fedt1 serumniveauer i nogle bugspytkirtlen kræftpatienter. Vi foreslår, at opløselige -fedt1 kan finde et program som en markør for patientovervågning supplerer kulhydrat antigen 19-9 (CA19-9). Desuden detaljeret analyse af de forskellige forarbejdede protein isoformer af kandidaten tumor suppressor -fedt1 kan også bidrage til vores forståelse af cellebiologi og tumor adfærd

Henvisning:. Wojtalewicz N, Sadeqzadeh E, Weiß JV, Tehrani MM, Klein-Scory S, Hahn S, et al. (2014) en opløselig form af Giant Cadherin -fedt1 frigives fra bugspytkirtelkræftceller af ADAM10 Mediated ektodomæne Kaste. PLoS ONE 9 (3): e90461. doi: 10,1371 /journal.pone.0090461

Redaktør: Andreas-Claudius Hoffmann, vesttyske Cancer Center, Tyskland

Modtaget: 11 oktober, 2013; Accepteret: 28 Januar 2014; Udgivet: 13 marts 2014

Copyright: © 2014 Wojtalewicz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Bundesministerium für Bildung und Forschung, NGFN Plus-programmet, 01GS08117 (til MS) og 01GS08118 (til IS-W) og ved en bevilling fra Hunter Translationel Cancer Research Unit (til RFT). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pankreatisk ductal adenocarcinom er den mest almindelige ondartede tumor i bugspytkirtlen og er den fjerde rangeret årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Betragtes som den mest aggressive solid tumor, at dødeligheden fra kræft i bugspytkirtlen er høj med 5-års overlevelsesraten mindre end 5% [1], [2]. I øjeblikket kun kirurgi tilbyder noget potentiale for helbredelse, men resektion er mulig i kun 15-20% af patienterne. Derfor tidligere påvisning af kræft i bugspytkirtlen er afgørende for at forbedre patienternes resultater.

Serum biomarkører er særdeles ønskeligt for tidlig diagnose, terapeutisk lagdeling og patientovervågning. I forbindelse med pancreascancer kulhydratet antigen 19-9 (CA19-9) også kendt som sialyl Lewis blodgruppe-antigen, er det vigtigste serum biomarkør anvendes klinisk [3]. Serum assays for CA19-9 har begrænset diagnostisk værdi og kan ikke anvendes som et screeningsassay alene ([4] og referencer deri), men giver vigtige oplysninger med hensyn til prognose, respons til kemoterapi og som en tidlig indikator for postoperativ tilbagefald . Den serielle bestemmelse af CA19-9 niveauer kan opdage sygdommen gentagelse måneder før kliniske eller radiologisk evidens. Desuden kan et fald på CA19-9 som respons på kemoterapi tjene som surrogatmarkør for klinisk respons [4] (vedrørende oversigt se [5] – [7]). Men flere forstyrrende variable begrænse, den kliniske anvendelighed af CA19-9.

detekteres De højeste CA19-9 niveauer hos patienter med biliær obstruktion, uanset om obstruktion skyldes cancer eller benigne årsager [8], [9]. Forøgede CA19-9 niveauer er også forbundet med pancreatitis, levercirrhose, cholangitis og multiple adenocarcinomer i anden type, fx kolorektal cancer. Vigtigt er det, udtryk for CA19-9 afhænger af en Lewis positiv fænotype, med falske negative resultater fælles meste på grund af ca. 7-10% af kaukasiere og op til 20% af afrikanere være

Lewis

antigen negativ hvor CA19- 9 er upåviselig uanset tumorbyrde [10], [11]. Der er derfor et klart udækket behov for at identificere nye serum markører for enten tidlig diagnose, terapeutisk lagdeling eller patientovervågning, der har øget nytteværdi eller kan supplere med CA19-9 eller andre serum markører [8].

En metode til biomarkør opdagelse, at vi og andre har udnyttet, er det forhør af det komplette repertoire af proteiner frigivet fra cancerceller

in vitro

– kræftcellen secretome [12] – [15]. Proteomikanalyser af secretomes har fundet tusindvis af proteiner og noget overraskende, blandt dem signifikante fraktioner af transmembrane (TM) proteiner. Dette skyldes først, at udgivelsen af ​​mikrovesikler der bærer intakte TM proteiner. For det andet kan TM-proteiner bearbejdes til en opløselig form ved proteolytisk forarbejdning [16] – [18]. Vi har tidligere fundet, at både microvesicular frigivelse [19], og proteolytisk spaltning af TM proteiner sker ikke kun

in vitro

, men også

in vivo

. Konkret vi bestemt en stigning i serum niveauer af opløselige cadheriner, nemlig af opløselige E-cadherin [20] og af opløselig LI-cadherin (upublicerede data) hos patienter med colorectal carcinom.

I denne rapport har vi analyseret secretome af bugspytkirtelkræftceller

in vitro

og beskrive identifikation af en opløselig form af -fedt1 cadherin som en særdeles rigelige bestanddel af denne fraktion. -fedt1 Tilhører en lille underfamilie af fire hvirveldyr gener (-fedt1, Fat2, Fat3 og Fat4). Fat cadherin koder ekstremt store proteiner af ~500-600 kDa med bevarelse af struktur fra hvirvelløse dyr til pattedyr. Hvert medlem består af op til 34 cadherin gentagelser, en eller to lamininG-lignende motiver og flere epidermal vækstfaktor (EGF) -lignende motiver i deres ekstracellulære region, et single-pass TM domæne og et stort cytoplasmatisk domæne [21] – [ ,,,0],23]. Proteolytisk processering af Fat proteiner der forekommer i de tidlige sekretoriske bane og frembringelse af et ikke-kovalent bundet heterodimer i cellemembranen er tidligere blevet beskrevet. Det omtales som “klassiske” behandling og synes at være bevaret mellem Drosophila [24] og mennesket [22], [25].

-fedt1 er ikke tidligere blevet undersøgt i bugspytkirtelkræft. Her præsenterer vi den første beskrivelse af en opløselig isoform af -fedt1 frigivet fra bugspytkirtelkræftceller

in vitro

. Vi fandt, at A disintegrindomænet og metalloproteinase domæne-holdigt protein 10 (ADAM10) er i høj grad ansvarlig for frigivelsen af ​​denne ektodomæne fragment.

I silico

analyse af offentligt tilgængelige udtryk array-data viste overekspression af -fedt1 samt ADAM10 i pancreas adenokarcinomer. Endelig har vi udviklet et ELISA-baseret assay kan måle ektodomænet af -fedt1 og viser, at øgede niveauer af opløseligt -fedt1 kan detekteres i serummet fra en andel af patienter med pancreas adenocarcinom i sammenligning med ikke-afficerede kontroller.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Vævsprøver blev opnået fra patienter på Institut for Intern Medicin, Knappschaftskrankenhaus, Ruhr-universitetet Bochum, Tyskland, efter informeret samtykke blev opnået. Undersøgelsen blev godkendt af den lokale etiske gennemgang bestyrelsen for Ruhr-universitetet Bochum og blev udført i overensstemmelse med erklæringen fra Helsinki. Se tabel S5 for patientens detaljer.

Skriftligt informeret samtykke fra alle patienter og vævsdonorer blev dokumenteret i henhold til de lokale etiske retningslinjer. De tre kræft prøver blev taget fra patienter med PancCa iscenesætter UICC IIB. Normale kontroller væv var fra de samme patienternes tilstødende sundt væv.

Serumprøver blev opnået fra patienter på Institut for Intern Medicin, Knappschaftskrankenhaus, Ruhr-universitetet Bochum, Tyskland, efter informeret samtykke blev opnået. Undersøgelsen blev godkendt af den lokale etiske gennemgang bestyrelsen for Ruhr-universitetet Bochum og blev udført i overensstemmelse med erklæringen fra Helsinki. Se tabel S4 for patientens detaljer.

Skriftligt informeret samtykke fra alle patienter og bloddonorer blev dokumenteret i henhold til de lokale etiske retningslinjer. De 30 cancerpatienter blev udtaget fra patienter med PancCa stadier UICC I (1), UICC II (9), UICC III (2) og UICC IV (18). En gruppe på 26 patienter med negative diagnostiske resultater for kræft blev brugt som (kliniske) kontrol.

Cell kultur

Den menneskelige pancreas adenocarcinom cellelinie Paca44 [26] blev venligst stillet til rådighed af M. Löhr (Heidelberg, Tyskland), blev BxPc3, MiaPaCa2 og Panc1 opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og A818-4 celler var fra vores laboratorium (WS). Celler blev holdt i suppleret Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) som tidligere beskrevet [19]. Menneskelig pancreas ductal epitelial (Æske med HDPE) celler blev venligst stillet til rådighed af MS Tsao (Toronto) og dyrket i defineret keratinocyt-SFM (KFSM, Life teknologi) som tidligere beskrevet [19].

Fremstilling af proteinprøver

Secretome præparat blev udført som tidligere beskrevet [20] . I korte celler blev dyrket i standard medium indtil de nåede et sammenløb på 60-70%. Bagefter blev de vasket tre gange med DMEM og inkuberet i serumfrit medium med tillæg for enten 16 timer for MS-analyse eller en anden to dage for Western blot-analyse. Supernatanter blev høstet og fjernet fra flydende celler og rester af steril filtrering. At forhindre proteolytisk fordøjelse, blev proteinaseinhibitorer tilsat. Secretome proteiner blev koncentreret ved ultrafiltrering

I cellekultur lysat forberedelse Cellerne blev lyseret med NP-40-puffer (25 mMTrisHCl, pH 7,4, 0,5% NP-40, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA;. 45 min 4 ° C), med CHAPS-lysepuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM MgCl

2, 10% glycerol, 1% CHAPS 90 min, 4 ° C) eller med NDE-lysepuffer (10 mM Tris /HCI, pH 7,2, 66 mM EDTA, 0,4% SDS, 1% NP-40, 1 time, 4 ° C) indeholdende en proteasehæmmer cocktail (Roche, Basel, Schweiz) og 1 mM PMSF. Supernatanten blev opsamlet efter centrifugering (14.000 rpm, 10 min 4 ° C). Proteinkoncentrationen blev bestemt i en standard Bradford proteinassay (BioRad, Hercules, CA, USA).

Frosne væv ekstraktion

Et lille stykke af frossen tumor eller normalt væv blev brækket af og pulveriseret mens afkølet med flydende nitrogen. Pulveret blev dækket med NDE puffer og protein ekstraktion blev udført som beskrevet ovenfor.

ADAM og MMP-inhibering

ADAM10 specifik inhibitor GI254023X [27], [28] og det brede spektrum metalloproteinaseinhibitor batimastat (Tocris Bioscience, Bristol, UK) blev begge opløst i DMSO som stamopløsninger før fortynding og brug. Celler blev dyrket, indtil de nåede et sammenløb på ca. 60-70%. De blev vasket og derefter inkuberet med 10 pM Batimastat eller 5 uM GI254023X i serum-frit medium i to dage.

siRNA-knockdown studier

I siRNA eksperimenter Cellerne blev dyrket til en konfluens på ca. 30% og inkuberet i antibiotisk medium for én dag. Bagefter blev de inkuberet med 30 pM enten ON-TARGETplus siRNA eller Dharmacon ON-TARGETplus nontargeting siRNA som kontrol under anvendelse Dharmafect (Fermentas, ST. Leon Rot, Tyskland) i to dage efterfulgt af inkubation i serum-frit medium i yderligere to dage og en anden inkubering i serumfrit medium i yderligere to dage.

antistoffer og Western blotting Salg

Ikke-kommercielle anti–fedt1 monoklonale muse og kanin polyklonale antistoffer rettet mod den N-terminale eller C- terminale domæner af -fedt1 blev beskrevet tidligere [25]. Polyklonale antistoffer mod det ekstracellulære domæne af -fedt1 (HPA001869 og HPA023882) og monoklonale antistoffer mod β-tubulin (T4026) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). ADAM10 antistoffer blev indkøbt fra Calbiochem (Darmstadt, Tyskland) (kanin, 735-749) og Millipore (Darmstadt, Tyskland) (kanin AB19026). E-cadherin antistof blev købt hos Invitrogen (Darmstadt, Tyskland) (mus, 13-1700).

Til Western blot-analyse, 8 pg totalt protein fra secretomes, 50-75 ug fra cellelysater og væv eller 12 ug serumproteiner blev separeret ved anvendelse 3-8% Tris-Acetat gradientgeler (Life Technologies, Darmstadt, Tyskland) som tidligere beskrevet [25] med nogle modifikationer. Kort fortalt blev proteiner overført til nitrocellulose eller PVDF-membraner ved hjælp af semi-tør blotting og membranerne blev blokeret i 1 time med 5% skummetmælkspulver i PBS. Efter inkubering med de angivne primære antistoffer blev påvisning af immunreaktive bånd udføres ved anvendelse af passende sekundære antistoffer koblet med infrarøde fluoroforer (Alexa-Fluor 680 (Life Technologies, Darmstadt, Tyskland) eller DyLight 800 (Thermo Scientific, Schwerte, Tyskland)) eller HRP ( BioRad laboratorier, München, Tyskland). blev påvist Signaler ved hjælp af Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) eller en Fuji LAS-4000 billeddannende system (GE Healthcare, Braunschweig, Tyskland).

elektrospray ionisering-tandem massespektrometri (ESI -MS /MS) analyse

For en detaljeret beskrivelse se materialer og metoder S1. Kort fortalt secretome og serumprøver separeret på PAGE-geler blev farvet med Krypton (Pierce, Rockford, USA) og hvert protein bane skæres i 29 skiver, og fordøjet med trypsin. Tryptiske peptidblandinger blev separeret under anvendelse af et nanoAcquity UPLC-system (Waters GmbH, Eschborn, Tyskland) som tidligere beskrevet [19]. Nano UPLC systemet blev koblet online til en LTQ Orbitrap XL massespektrometer (Thermo Scientific, Bremen, Tyskland). Massespektrometeret blev drevet i følsomme tilstand. Themgf-filer genereret af Xcalibur software (Thermo Scientific, Bremen, Tyskland) blev anvendt til databasesøgninger med MASCOT søgemaskine (Matrix Science, London, UK, udgave 2.2) mod MSIPI database. Hver skive blev analyseret separat og MS /MS-data blev ikke fusioneret før protein databasesøgning for at opretholde de oplysninger om molekylvægten af ​​hvert protein, peptid kampe og identifikation score. På denne måde protein kataloger fra humane bugspytkirtelkræft celle secretomes (A818-4, BxPC3, MiaPaCa2, Paca44, Panc1 og HDPE (human pancreas ductal epitel)) blev etableret.

ELISA-assay mod udskilt -fedt1

96-brønds plader (hvide MaxiSorp fladbundede plader med 96 brønde (Nunc, Roskilde, Danmark) blev først overtrukket natten over ved 4 ° C med 100 pi anti-Fat mAb NTD-7 (dannet mod cadherin domæner 11/12 ;.. [25]) ved 50 ug /ml i carbonatpuffer (pH 9,6) mellem alle inkubationstrin blev pladerne vasket tre gange med phosphatpufret saltvand indeholdende 0,1% Tween (v /v) (PBS-T) pladerne blev derefter blokeret med 5% skummetmælk i PBS-T (2 H, RT) før påføring af angivne prøver og yderligere inkubation (2 timer, stuetemperatur). Captured -fedt1 antigen blev påvist ved 0,05 ug /ml biotinyleret anti–fedt1 NTD-14 mAb (16 timer, 4 ° C) (dannet mod et peptid i cadherin repeat 12 i -fedt1 [25] fortyndet i 2% skummetmælk i PBST. Komplekser blev påvist ved anvendelse af 5 ug /mL Neutravidin-HRP (Pierce, Darmstadt, Tyskland) i 2 timer ved stuetemperatur, inden du ryster inkubation af 50 pi substrat (SuperSignal ELISA FemtoMaximum følsomhed).

Resultater

kæmpen cadherin -fedt1 er en vigtig del af den secretome af bugspytkirtelkræftceller

Som en del af vores biomarkør opdagelse program, vi har katalogiseret repertoiret af proteiner frigivet fra fem menneskelige kræft i bugspytkirtlen cellelinjer bruger massespektrometri (A818-4, BxPC3, MiaPaCa2, Paca44 og Panc1) og sammenlignede dette til secretome af udødeliggjort menneske pancreatisk ductal epitel (HDPE) celler. Secretomes blev fremstillet som tidligere beskrevet [12], [13], [19] og separeret på en 1D-gradientgel. Hver gel bane blev skåret i 29 skiver. Tryptisk fordøjelse og massespektrometri blev udført separat for hver gel skive og database søgninger førte til identifikation af mere end 1000 proteiner pr secretome og over 3000 unikke proteiner i alt (upublicerede data).

Især mange peptider kortlægning til giant protocadherin Fat-1 blev opdaget i alle seks secretomes inden gelskiver to og tre svarende til proteiner 400 kDa i overensstemmelse med den forudsagte masse af -fedt1 af ~500 kDa (sammenlign tabel 1). Ja, i forhold til antallet af peptider identificeret, hvilket er et relativt mål for protein overflod, -fedt1 var blandt de mest udbredte proteiner i kræftcellen secretomes repræsenterer op til 0,9% af alle peptider og den mest rigelige derivat af enhver TM protein. Fordelingen af ​​-fedt1 peptider blandt cellelinjer og peptider afledt fra andre Fat proteiner (Fat2 og Fat4) er vist i tabel 1.

Vi næste profileret mRNA ekspression af alle fire Fat familie cadheriner i pankreatisk cancercellelinie panelet ved hjælp microarray analyse (tabel S1) efterfulgt af sekundær bekræftelse ved brug af kvantitativ PCR (figur S1). -fedt1 Blev udtrykt ved høje niveauer i alle seks cellelinjer, Fat2 og Fat4 på moderate niveauer i kun to af de seks cellelinier. I modsætning blev opnået kun baggrundsniveauer for Fat3 i denne analyse.

De fundne niveauer af mRNA meste svarede med proteomiske data, men sammenligner kræftceller til HDPE celler der var nogle uoverensstemmelser. Især HDPE celler viste høj -fedt1 mRNA udtryk, men omvendt gav det laveste antal -fedt1 peptider i secretome. Ligeledes peptid tal for Fat2 og Fat4 i HDPE secretome er lavere eller endog fraværende, når det blev sammenlignet med kræftceller, der også udtrykker sammenlignelige niveauer af Fat2 og Fat4 mRNA (BxPC3 og Panc1 henholdsvis) tyder på, at kræftceller frigive mere Fat proteiner end normale celler.

for at uafhængigt validere disse resultater, vi foretog Western blot analyse af pankreascellen secretomes og sammenlignet disse med tilsvarende cellelysater. Påvisning med antistoffer rettet mod aminoterminus af -fedt1 proteinet afslørede hovedsageligt et enkelt bånd lidt over 460 kDa i secretomes med tilsvarende cellelysater fra cancerceller udviser et bånd af lignende mobilitet (figur 1). I modsætning hertil HDPE celler udviste lille reaktivitet for -fedt1 i secretome og hovedbåndet detekteret i lysaterne optrådte større tyder der kan være posttranslationelle forskelle. Da båndintensiteter i secretomes korrelerede med peptidet tællinger bestemt for hver respektiv cellelinje (tabel 1), tilsammen disse data giver god dokumentation for, at -fedt1 er meget rigelige i secretomes af pancreascancer cellelinier men i mindre grad i deres normale cellulære modstykker

Western blot-analyse af -fedt1 i den respektive secretome. (S; 8 ug lastet) og lysat (L; 50 ug indlæst) fraktioner fra fire pancreatiske cellelinjer og HDPE. Blottet blev undersøgt med et antiserum rejst mod det ekstracellulære domæne af -fedt1 (ECD1).

-fedt1 i bugspytkirtelkræft secretome består af det skur ekstracellulære domæne

Den tilsyneladende molekylære område ( mr) af -fedt1 båndet i bugspytkirtelkræft secretomes er i området for den forudsagte mr på fuld-længde kerne -fedt1 polypeptid på 505 kDa (figur 1). Mens nominelt antyder dette, at udskilt -fedt1 kan være intakt, tilpasning af de identificerede peptider til -fedt1 aminosyresekvens afslørede, at alle peptider udelukkende stammer fra de ekstracellulære domæner (ECD, aminosyrer 1-4180) med den mest C-terminale aminosyre er identificeret i et peptid mapping til AA 3997 (fig. 2 og fil S1).

Massespektrometrisk analyser blev udført med alle seks secretomes og -fedt1 specifikke peptider blev detekteret begyndende nær aminoterminalen ned til og med EGF-domænet ( se filen S1 for detaljer). Vist her er opstillinger af -fedt1 specifikke peptider fra tre eksemplariske resultater med høj sekvensdækning i afsnittet af aminosyrer 3500 ned til C-terminalen i AA4588 (ifølge HPRD).

Desuden kan eksistensen af et større bånd i HDPE cellelysat foreslog, at posttranslationelle modifikationer kan bidrage til den samlede størrelse af de protein-isoformer som ofte er observeret for TM-proteiner, herunder mange cadheriner. Faktisk deglycosylering eksperimenter bekræftede, at ca. yderligere 70 kDa af det totale protein masse skyldes glycosylering af de cellulære former og den opløselige form af -fedt1 (figur S2). Om signalerne i cellelysater, den meget høje hr band stede i Æske med HDPE-celler antyder disse overvejende udtrykker fuldlængde glycosyleret protein. Den lidt mindre bånd til stede i cancer cellelysater kan repræsentere den N-terminale del af den nyligt beskrevne -fedt1 heterodimer, der består af en N-terminal gp 490 (P420) og en p85 C-terminale transmembrane fragment. Denne ikke-covalent bundet heterodimer fremstilles ved endoproteolytisk S1-spaltning i trans-Golgi-netværket [25], før de når plasmamembranen. For at præcisere karakteren af ​​-fedt1 stede i secretome og bekræfte identiteten af ​​bands observeret i cellelysater, vi foretog Western blot analyser med domæne specifikke antistoffer [25].

Figur 3 sammenligner en repræsentativ secretome fraktion sammen celle lysater fra dyrkede pancreasceller. Blottet blev probet med antistoffer rettet mod det intracellulære domæne af -fedt1 som let detekterer et enkelt bånd på 500 kDa i cellelysaterne i klar kontrast til den secretome hvor nogen signaler var tydelige. Dernæst blev samme blot inkuberet med antistoffer rettet mod et ekstracellulært -fedt1 domæne, hvor pancreas-cellelysater gav to tætliggende bånd i cellelysater: det øvre bånd er identisk med den, der detekteres af intracellulære antistoffer. Manglen på reaktivitet af det nedre bånd med intracellulære domæne antistoffer identificerer denne dublet af bands som den fulde længde og heterodimere former af -fedt1, henholdsvis (figur 3). Som forventet fra MS-resultater, ekstracellulære domæne antistoffer gav stærke signaler i secretome prøve. Kollektivt resultaterne af både biokemisk og massespektrometrisk (MS) analyser indikerer, -fedt1 stede i secretome helt mangler C-terminale rester. Da begge de kendte former af cellulær -fedt1 er TM-proteiner, det overbevisende konklusion ud fra disse data er, at -fedt1 påvises i secretome repræsenterer ekstracellulær udskillelse gennem proteolytisk spaltning i dets ekstracellulære domæne nedstrøms for lamG domæne. Ved Western blotting af cellelysater kunne vi ikke finde beviser for tilstedeværelsen af ​​et C-terminalt rest fragment forventes at opstå fra ektodomæne udgydelse, heller ikke vi registrerer p85 C-terminale fragment fra heterodimeren.

Cellelysater (75 ug hver) og en repræsentativ secretome (8 ug) blev blottet sammen med et protein markør (M). Den samme blot blev probet først med et antiserum fremstillet mod det cytoplasmatiske domæne (CTD) af -fedt1 og efterfølgende med et antiserum dannet mod det ekstracellulære domæne (ECD 2). Beta-tubulin endelig blev anvendt som en loading kontrol for cellelysat. Det ekstracellulære domæne specifikke antistoffer, kun, opdage den forarbejdede cellulære form, og udgivet -fedt1 i secretome.

Derfor vi næste udført immunopræcipitation analyse med domæne specifikke monoklonale antistoffer (mAbs) ved hjælp af tre repræsentative adenocarcinom celle linjer. Brug af biotinylering at mærke celleoverfladeproteiner, denne analyse viser tilstedeværelse af primært to høje Mr bånd præcipiteret ved N- og C-terminale specifikke mAb’er i de fleste cellelinjer undersøgt. Efterfølgende Western blotting med et ekstracellulært domæne specifikt antistof detekterer større bånd kun, hvorimod det intracellulære domæne specifikke antistof-mærker både store cellulære former (figur 4). Dette tilvejebringer yderligere beviser for dobbelt forarbejdning, hvorved både fuld længde og heterodimere former af -fedt1 forekommer på celleoverfladen af ​​pancreas adenocarcinom-celler som tidligere beskrevet for melanomceller. Især det intracellulære C-terminale domæne-specifikt antistof viste også tilstedeværelsen af ​​p85-båndet indikerer heterodimeren (figur 4). Mest slående en -60 kDa bånd i overensstemmelse med den forventede ektodomæne kaste spaltningssted blev observeret i BxPC3 cellelysat og i mindre grad i PaCa44 celler. Den p60-bånd blev kun udfældet med C-terminale-specifikke mAb’er indikerer det repræsenterer en er ikke længere i forbindelse med det ekstracellulære domæne. Dette er også i overensstemmelse med tidligere observationer i melanom celler [25]

Celler (Panc1, BxPC3 og A818-4) blev mærket med biotin, lyserede og udfældet med -fedt1 specifikke monoklonale antistoffer (NTD7 og CTD7).; protein A /G-perler blev anvendt som kontrol. Den første inkubation af blottet med Neutravidin-HRP angivet bands med høj molekylvægt svarende til de kendte høje Mr former af -fedt1 og en formodentlig krydsreaktive protein ved ≈200 kDa. Efterfølgende Western blotting med det ekstracellulære domæne specifikt antiserum igen detekterer de to høje Mr former af -fedt1. Endelig Western blotting med det intracellulære domæne specifikt antiserum detekterer fuldlængde proteinet og p85 C-terminale rest fragment afledt af klassisk forarbejdning i både -fedt1 udfældninger, bekræfter associering af de N-terminale og C-terminale dele. En ekstra p60 udelukkende påvist i bundfaldet ved hjælp af den intracellulære domæne-specifikt antistof med stærke signaler i BcPC3 og uge signaler i A818-4 lysater. Immunpræcipitation (IP) analyse af -fedt1 efter celleoverfladen mærkning af Panc1, BxPC3 og A818-4 celler med biotin. IP’er ved hjælp domænespecifikke mAb’er mod -fedt1 sammen med en kontrol (protein A /G beads inkuberet med lysater) blev først probet med Neutravidin at dekorere proteiner på celleoverfladen efterfulgt af de polyklonale antistoffer mod ECD og CTD som vist. Bands er mærket gp575, gp490 og p85 som pr A) med p60 betegner et yderligere proteolytisk produkt.

afgivelse af -fedt1 cadherin indebærer ADAM10

Metalloproteaser ofte regulere ektodomæne udgydelse af TM-receptorer med membran-forankret ADAM familien metalloproteaser ofte involveret. mRNA profilering af de pancreatiske cellelinjer afslørede et begrænset ekspressionsmønster af ADAM familiemedlemmer (tabel S2). ADAM10 især er sheddase være hovedansvarlige for ektodomæne udgydelse af E-cadherin og LI-cadherin i kolorektal cancer celler (upublicerede data) og fire af de fem cancer cellelinjer vises højere ADAM10 niveauer end Æske med HDPE celler. På proteinniveauet blev ADAM10 specifikke peptider ikke påvist i secretome kataloger men i de berigede exosomer ved MS, nemlig 9 kampe i Æske med HDPE exosomer og 62 kampe i Panc1 exosomer; ingen anden ADAM’er blev påvist i disse kataloger (data ikke vist). Sammen disse data giver et rationale for at undersøge, hvilken rolle ADAM10 i -fedt1 ektodomæne udgyde.

For at vurdere inddragelsen af ​​metalloproteinaser og især ADAM10 i -fedt1 ektodomæne udgydelse, humane bugspytkirtelkræftceller blev behandlet med det brede spektrum proteasehæmmer Batimastat og ADAM10 specifikke inhibitor GI245023X [28], [29]. Western blotting af -fedt1 i secretomes i Paca44 og Panc1 cellelinjer viste Batimastat behandling reducerede niveauer af ektodomæne udgydelse af -fedt1 til under kontrol niveauer. Den GI254023X inhibitoren var lige effektive reducere niveauet af ektodomæne skur -fedt1 i begge cellelinier (figur 5A). Kvantitativ vurdering af virkningerne af disse midler i tre på hinanden følgende forsøg viste, at Batimastat hæmmede markant -fedt1 kaste i Panc1 og Paca44 celler (figur 5B) hvilket bekræfter rolle metalloproteinaser i denne proces. Virkningerne af GI254023X var tilsvarende tyder på, at ADAM10 er involveret i -fedt1 kaste i disse celler. Imidlertid har nogle rapporter foreslået, at GI254023X ved de anvendte koncentrationer kan også have en vis effekt på matrixmetalloproteaser (MMP’er), f.eks [27], og yderligere forsøg blev udført med RNAi mod ADAM10.

Tallet i A) viser et repræsentativt Western blot. PaCa44 og Panc1 celler blev inkuberet i serumfrit medium i to dage med tilsætningen af ​​enten det brede spektrum metalloproteaseinhibitor Batimastat (B, 10 uM), eller ADAM10-specifikke inhibitor GI245023X (GI, 5 uM) eller opløsningsmiddel som kontrol ( C, DMSO). Secretomes, 8 ug protein per prøve, blev analyseret ved Western blot-analyse under anvendelse af -fedt1 ECD2 polyklonale antistof. Blotting mod transferrin blev anvendt som en loading kontrol. (B) -fedt1 specifikke signaler fra tre uafhængige forsøg blev kvantificeret og normaliseret med transferrin signaler. De søjlediagrammer viser de gennemsnitlige værdier +/- S.E.M. fra tre eksperimenter

Behandling af Paca44 og Panc1 bugspytkirtelkræftceller med ADAM10 specifikke siRNA-duplexer resulterede i . 90% knockdown af ADAM10 protein niveauer stabile i 96 h (figur 6). Undersøgelse af secretome viste et ledsagende fald i opløselig -fedt1 niveauer produceret af Panc1 og Paca44 celler (figur 7). Selvom ADAM10 niveauer blev reduceret til under 10% af kontrolniveauer den maksimale reduktion i -fedt1 sekretion observerede var omkring 50% af kontrollerne. Lignende reduktioner i sekretionen af ​​E-cadherin, en kendt mål på ADAM10, blev observeret i parallelle forsøg iværksættes med de kemiske inhibitorer eller ADAM10 siRNA-duplexer (figur S3 A ​​og B). Kollektivt tyder det ADAM10 er en betydelig effektor af -fedt1 kaste men ikke den eneste involveret.