PLoS ONE: Østrogen Regulerer Tumor suppressor miRNA-30c og ​​dens Target Gene, MTA-1, i endometriecancer

Abstrakt

MicroRNA-30c (miR-30c) er blevet rapporteret at være en tumor suppressor i endometriecancer (EF). Vi viser, at MIR-30C er nedreguleret i EF væv og udtrykkes kraftigt i østrogenreceptor (ER) -negative HEC-1-B-celler. MIR-30c direkte inhiberer MTA-1-ekspression og fungerer som en tumorsuppressor via MIR-30C-MTA-1-signalering pathway. Endvidere MIR-30c faldt upon E

2 behandling i begge ER-positive Ishikawa og ER-negativ HEC-1-B-celler. Tilsammen vores resultater tyder på, at miR-30c er en vigtig dereguleret miRNA i EF og kunne tjene som en potentiel biomarkør og nye terapeutiske mål for EF

Henvisning:. Kong X, Xu X, Yan Y, Guo F , Li J, Hu Y, et al. (2014) Østrogen Regulerer Tumor Suppressor miRNA-30c og ​​dens Target Gene, MTA-1, i endometriecancer. PLoS ONE 9 (3): e90810. doi: 10,1371 /journal.pone.0090810

Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: August 27, 2013; Accepteret: 4 Februar, 2014; Udgivet: 3 marts 2014

Copyright: © 2014 Kong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Six Talent Summit Projekt i Jiangsu-provinsen Personale bureau (WSW-021). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Endometriecancer (EF) er den hyppigste ondartet svulst af den kvindelige kønsorganer på verdensplan. Endometriecancer omfatter to forskellige patogenetiske undertyper. Type I tumorer er lav kvalitet østrogen-relaterede endometrioide kræftformer (EØF), der generelt udvikler fra komplekse og atypiske endometrie Hyperplasier i peri-menopausale kvinder. I modsætning hertil type II tumorer er aggressive ikke-endometrioide kræftformer (NEEC), der ikke er relateret til østrogen stimulation og der udvikler sig fra atrofisk endometrium af ældre kvinder. Forskellene mellem de to EF-undertyper føre til forskellig behandling og prognoser [1].

Betydningen af ​​microRNA (miRNA), en type af den ikke-kodende RNA, er blevet påvist i kræft. Gener, der koder pattedyr miRNA er i første omgang transskriberet som primære miRNA (pri-miRNA), der behandles af de enzymatiske komplekser drosha og Dicer bliver precursor miRNA (pre-miRNA) og modne miRNA [2]. De modne miRNA er cirka 22-nukleotid-lang, enkeltstrengede RNA-molekyler, der regulerer ekspressionen af ​​deres målgener ved upræcis komplementering til 3′-utranslaterede regioner (UTR’er), 5′-UTR’er og endda kodende sekvenser af de mRNA’er at undertrykke translation i dyr [2] – [5]. Østrogen (E

2) og estrogenreceptoren (ER) er blevet vist at modulere miRNA såsom MIR-125a [6] og MIR-429 [7] i muse uterus, miRNA-20a og miRNA-21 i normal endometrial glandulær epitelceller [8], Lad-7 familie, miR-27a, miR320 og miR-424 [9] i EF-celler, miR-104 [10], miR-7 [11], miR-21 [12], miR -30C og miR-103 [13] i brystkræftceller, miR-135b i kolorektale celler [14] og miR-203 i vaskulære glatte muskelceller [15]. Tilsammen indikerer disse resultater, at E

2 og ER spiller vigtige roller i miRNA regulering.

For nylig har dereguleringen af ​​miR-30c rapporteret til ikke blot at være relevante for tumorigenese og progression af mange kræftformer, såsom EF [16], [17], ovariecancer [18], [19], brystkræft [20] – [23], lungecancer [24], klar celle renalcellecarcinom [25], mavekræft [26], blærecancer [27] og neuroblastom [28], men også at udvise potentielle diagnostiske og prognostiske implikationer, samt at udgøre en potentiel terapeutisk mål af kemo- og radiotherapies for cancere [18], [29], [ ,,,0],30]. I øjeblikket, metastase-associeret gen-1 (MTA-1) [17], KRAS [20], DLL4 [31], TWF1, vimentin [21], BCL9 [19], REDD1 [32], PAI-1 [33] og CTGF [34] er blevet identificeret som mål for miR-30c, og SERPINE1 [28], NYH11, GPRASP2 DDR2 [16], PPARGC1B, Makorin-3, UBAC1, PTPDC1 [22] snail1 [35], p53 [36] er potentielle mål, der mangler at blive valideret. Fordi miR-30c udviser en relativ nedgang i udtryk fra normal endometrium til atypisk hyperplasi til kræft, og fordi den rolle, miR-30c i EF er ukendt, gennemførte vi en undersøgelse af den rolle, miR-30c i EF. Vores tidligere undersøgelser har fundet, at MIR-30c mål MTA-1, som er overudtrykt i EF [37] og fungerer som tumorsuppressor i EF-cellelinier [17]. Men de præcise roller miR-30C og MTA-1 i EF er uklare. Derfor gennemførte vi denne udvidede undersøgelse.

I denne undersøgelse har vi vurderet udtryk for miR-30c i EF-væv og forskellige EF-cellelinjer, yderligere undersøgt forholdet mellem miR-30C og MTA-1, valideret tumorsuppressorfunktion af miR-30c og ​​udforskede reguleringen af ​​miR-30c i EF-cellelinjer. Således har vi forsøgt at bestemme den tumorsuppressionsfunktion MIR-30c, som skal definere dets potentielle værdi som et hidtil ukendt terapeutisk mål til behandling af EF. Salg

Materialer og Metoder Salg

Patienter og væv prøver

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Nanjing Drum Tower Hospital Tilknyttet til Nanjing Universitet. Undersøgelse forsøgspersoner blev rekrutteret fra patienterne på Institut for Obstetrik og Gynækologi, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School i Nanjing, Kina. Skriftligt informeret samtykke blev modtaget fra alle deltagere, der er involveret i undersøgelsen. Alle prøver blev opsamlet med patienternes informerede samtykke og bekræftet af patologisk undersøgelse. Alle patienter blev ramt type I EF og ingen af ​​dem fik præoperativ behandling, såsom strålebehandling eller kemoterapi. 21 primære EF tumor vævsprøver blev opnået fra EF patienter, og 14 normale endometriske vævsprøver blev opnået fra kvinder, der undergik hysterectomies (laparoskopisk eller abdominal) til behandling af andre sygdomme, såsom myom eller uterin prolaps.

EF-cellelinjer og behandlinger

Menneskelig EF Ishikawa celler blev venligst stillet til rådighed af professor LHWei (Peking University Folkets Hospital, Kina), og HEC-1-B blev købt fra Shanghai Cell Collection (Shanghai, Kina). De Ishikawa-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Gibco, USA), og HEC-1-B-celler blev dyrket i McCoys 5A-medium (Gibco, USA), som begge blev suppleret med 10% føtalt bovint serum ( FBS, Gibco). Cellerne blev holdt i en CO 5%

2 befugtet atmosfære ved 37 ° C. For at bestemme reguleringen af ​​E

2 blev celler behandlet med 17β-østradiol (E

2, 10

-8 M og 10

-10 M, Sigma, USA) til 6, 12, 24 og 48 timer i 6-brønds plader. Ishikawa og HEC-1-B-celler blev co-behandlet med ER-antagonist Fulvestrant (ICI 182780, 10

-8 M, Sigma, USA) og 10

-8 M eller 10

-10 ME

2 for 24 og 48 t.

Cell transfektion

De efterligner (miR10000244) og hæmmer (miR20000244) af miR-30c, lille interfererende RNA af MTA-1 (Si- MTA-1, si-h-MTA1_001) og deres respektive kapløbet oligonukleotider, efterligner-sc (miR01101), hæmmer-sc (miR02101), Sir-sc (siN05815122147), designet og syntetiseret af Guangzhou RiboBio (Guangzhou, Kina). Alle oligonukleotider blev transficeret i celler under anvendelse af Lipofectamine

TM 2000 (Invitrogen, USA) i antibiotika-fri Opti-MEM-medium (Invitrogen, USA) ifølge fabrikantens protokol ved en slutkoncentration på 50 nM. For cotransfections blev 25 nM af hvert oligonukleotid anvendes. Total RNA og proteiner blev ekstraheret ved 48 timer efter transfektion for yderligere analyse. Ikke-transficerede Ishikawa-celler i dyrkningsmediet var også parat til at tjene som mock kontroller.

Kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR)

Totalt RNA fra væv og celler blev ekstraheret under anvendelse TRIzol-reagens (Invitrogen, USA). Hårnåle-RT-primer af MIR-30c, blev primerne af MIR-30c, U6 og MTA-1 for QRT-PCR er beskrevet i vores tidligere undersøgelse [17]. GAPDH, pri-miR-30c, og præ-miR-30c primere blev udformet som følger: GAPDH fremad primer: TGAACGGGAAGCTCACTGG, GAPDH reverse primer: TCCACCACCCTGTTGCTGTA; PRI-MIR-30c forward primer: GCCCAAGTGGTTCTGTGTTT, pre-MIR-30c forward primer: ACCATGCTGTAGTGTGTGTAAACA, og PRI-MIR-30c /pre-MIR-30c reverse primer: TCCATGGCAGAAGGAGTAAA. cDNA blev syntetiseret ud fra total RNA ved revers transkription under anvendelse af PrimeScript ™ RT-reagens (Takara, Dalian, Kina). Dernæst blev QRT-PCR udført under anvendelse af SYBR PrimeScript ™ RT-PCR Kit (Takara, Dalian, Kina) ifølge fabrikantens protokol. De relative ekspressionsniveauer af MIR-30C og MTA-1 blev bestemt under anvendelse af 2

-ΔΔCt analysemetode; niveauerne af GAPDH og U6 blev brugt som interne kontroller for MTA-1 og miR-30c, pri-miR-30c, præ-miR-30c.

Western Blot

Celler blev høstet og lyseret i radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) lysis buffer (Sigma, USA) indeholdende en proteasehæmmer cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Proteinkoncentrationerne af det totale cellulære lysater blev målt ved anvendelse af Micro BCA protein assay kit (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, USA). Et tilsvarende beløb (50 ug) af hver cellelysatet blev opløst ved elektroforese i 10% SDS-polyacrylamid geler (SDS-PAGE) og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA), som blev blokeret i TBST med 10% fedtfri tørmælk. Membranerne blev probet med et primært antistof mod MTA-1 (1:500, Abcam, Cambridge, UK) og en sekundær peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret antistof (1:5000, Bioworld Technology, USA). Proteinerne af interesse blev derefter detekteret under anvendelse af et forøget kemiluminescens (ECL) blotting detektionssystem (Millipore, Billerica, MA). GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. Den relative intensitet af de målrettede båndene blev analyseret under anvendelse Mængde One.

Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev analyseret under anvendelse af et 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. Celler blev podet i 96-brønds plader (5 × 10

3 celler /brønd) direkte eller ved 24 timer efter transfektion og inkuberet i 24, 48, 72 og 96 timer, hhv. Efter inkubering med 25 pi MTT (5 mg /ml, Sigma, USA) ved 37 ° C i 4 timer blev supernatanterne fjernet, og 150 pi dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma, USA) blev tilsat til hver brønd. Absorbansværdien (OD) af hver brønd blev målt ved 490 nm. For hver eksperimentel betingelse blev 6 brønde anvendt, og forsøget blev udført tre gange.

Cell migration og invasion assay

Cell migration blev målt ved anvendelse af en sårhelende assay. De transficerede celler blev podet i 6-brønds plader og dyrket til konfluens. Sårene blev foretaget under anvendelse af et p10 pipettespids, og cellerne blev vasket med PBS for at fjerne snavs og løsnede celler. Cellerne blev derefter inkuberet i serumfrit medium i yderligere 24 eller 48 timer. De individuelle huller blev observeret og fotograferet ved anvendelse af et omvendt mikroskop ved 0, 24 og 48 timer ved den samme position af såret.

celleinvasion assays blev udført i 24-brønds, Matrigelcoatede invasions kamre. Ved 48 timer efter transfektion, 2 × 10

4-celler i 0,2 ml serumfrit-DMEM blev tilsat til de øvre kamre (8-um, Millipore), som blev overtrukket med 30 ul matrigel (BD Bioscience, San Jose , CA), og 0,6 ml 10% FBS-DMEM blev tilsat som kemoattraktanten til det nedre kammer. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 24 timer, hvorefter blev de ikke-indtrængende celler fjernes med vatpinde. De invaderende celler blev farvet med 0,1% krystalviolet. Cellerne blev talt i 5 tilfældige høj effekt felter på × 200 forstørrelse per brønd. Eksperimentet blev udført tre gange.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS 19.0 software (SPSS, Chicago, USA). Værdierne er vist som de middelværdier ± SD. T-test blev anvendt til at sammenligne værdierne af test- og kontrolprøver. Forskelle mellem behandlingsgrupper blev undersøgt for statistisk signifikans under anvendelse af envejs ANOVA. Den statistiske signifikans niveau blev betegnet som P. 0,05

Resultater

Angivelse af MIR-30C og MTA-1 i EF-prøver og cellelinjer

MIR-30c blev rapporteret at udvise relativt reduceret ekspression fra normal endometrial til atypisk hyperplasi til kræft [16] og for at fungere som en tumorsuppressor i EF-cellelinier [17]. Imidlertid har ingen andre undersøgelser viste, at MIR-30c spiller en rolle i EF. Derfor vi først undersøgte den relative ekspression af MIR-30C blandt vævsprøverne i denne undersøgelse. Vores QRT-PCR-analyser viste, at MIR-30C er væsentligt reduceret i EF prøver (Fig 1A.), Hvilket antyder, at MIR-30c spiller en rolle i forekomsten af ​​EF.

(A). MIR-30c blev reduceret i 21 EF prøver sammenlignet med 14 NE prøver, som angivet ved QRT-PCR-analyse. Hver prøve blev evalueret i tre eksemplarer. (B). MIR-30c blev højt udtrykt i HEC-1-B-celler sammenlignet med Ishikawa-celler, som indikeret ved QRT-PCR-analyse. (C) og (D). Ekspressionen af ​​MTA-1 blev reduceret i HEC-1-B-celler sammenlignet med Ishikawa-celler på mRNA (C) og protein (D) niveauer. Hver søjle repræsenterer middelværdierne ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. (* P 0,05, ** P 0,01).

Vi næste evaluerede udtryk for miR-30C i forskellige cellelinier. ER-positive Ishikawa-celler og ER-negative HEC-1-B-celler repræsenterer modeller af type I og type II EF hhv. Vores QRT-PCR-analyse afslørede, at MIR-30C udtrykkes kraftigt i HEC-1-B-celler sammenlignet med Ishikawa-celler ved 1,79 gange (Fig 1B.), Hvilket antyder, at ekspressionen af ​​MIR-30C korrelerer med ER eller E

2. Næste vurderede vi niveauerne af MTA-1-ekspression i forskellige cellelinier og fundet, at det er overudtrykt i Ishikawa-celler på både mRNA og protein niveauer (Fig 1C og 1D). Tilsammen vores resultater tyder på en negativ korrelation mellem miR-30C og MTA-1, i overensstemmelse med vores tidligere konklusion, at miR-30C henvender MTA-1.

Variation af miR-30c udtryk modulerer udtryk for sit mål gen, MTA-1, i EC-celler

Vi har tidligere vist, at mIR-30c mål MTA-1 mRNA-transkripter i Ishikawa og HEC-1-B-cellelinier ved anvendelse af en Luciferase reporter assay. At grundigt belyse forholdet mellem miR-30C og MTA-1, vi brugte MIR-30c-efterligner og miR-30c-hæmmer til at genoprette og for at reducere ekspressionen af ​​miR-30c henholdsvis. Derudover har vi brugt Sir-MTA-1 til knockdown MTA-1 i Ishikawa-celler.

udtryk for miR-30c i Ishikawa-celler var opreguleret med 23,14 gange og nedreguleret med 0,043 gange ved transfektion med MIR-30c-efterligninger og MIR-30c-inhibitor, (fig 2A). Ved tilstrækkelig transfektion effektivitet, fandt vi, at MTA-1-ekspression blev signifikant reduceret, da miR-30c blev genoprettet, og at reduktionen af ​​miR-30C opreguleret MTA-1-ekspression (Fig 2B).

(A) . Transfektionseffektiviteten af ​​Ishikawa-celler blev vurderet ved QRT-PCR ved 48 timer efter transfektion af MIR-30c-efterligninger og MIR-30C-inhibitor, vist som fold-ændringer i forhold til deres scrambled kontrol. (B). MTA-1-protein-ekspression blev vurderet ved Western blot-analyse ved 48 timer efter transfektion med MIR-30c-efterligninger, MIR-30C-inhibitor og deres scrambled kontrol. (C). Cotransfektion med MIR-30c inhibitor, Sir-MTA-1 og deres kodede kontroller blev udført, og MTA-1-protein-ekspression blev vurderet ved Western blot-analyse. (D og E). Sir-MTA-1 reducerer MTA-1-ekspression på mRNA (D) og protein (E) niveauer ved 48 timer efter transfektion. (F). QRT-PCR-analyse viser en stigning i MIR-30c ekspression efter MTA-1-ekspression blev inhiberet. Hver søjle repræsenterer middelværdierne ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. (* P 0,05, ** P 0,01).

I cotransfektion eksperimenter, fandt vi, at miR-30C-hæmmer og SIR-MTA-1 spillede en antagonistisk måde i MTA-en regulering (Fig 2C). Sammen med den observation, at Sir-MTA-1 suppresseed ekspressionen af ​​MTA-1 på både mRNA og protein niveauer (Fig 2D og 2E), mener vi, at MIR-30C rent faktisk reguleres negativt MTA-1. Interessant, undertrykkelsen af ​​MTA-1-ekspression af Sir-MTA-1 resulterede i en forøget ekspression af miR-30c (figur 2 F).

Samlet set vi bekræftet, at miR-30c direkte undertrykt MTA-1 ekspression og at en tilbagemelding-loop er til stede mellem dem. Selvom flere undersøgelser er nødvendige for at udforske den specifikke mekanisme bag deres feedback-loop regulering, disse resultater støttede forestillingen om, at miR-30c kunne arbejde ved at hæmme MTA-1 i EF.

MIR-30c regulerer celleproliferation, migration og invasion i EF

Som vores tidligere undersøgelse har vist, at ektopisk udtryk for miR-30c kan hæmme EF celleproliferation, migration og invasion [17]. Her har vi fremlagt yderligere beviser til at bekræfte disse effekter i Ishikawa-celler. Den ektopiske ekspression af MIR-30C inhiberede celleproliferation i en MTT assay. Levedygtighed transficeret blev undertrykt (Fig 3A) og relative celleproliferation blev reduceret ved 72 og 96 timer efter transfektion (Fig 3B). Med hensyn til migration og invasion, vi udførte en sårheling og en transwell assay. Transfektion af MIR-30c-efterligner faldt migration og invasion sammenlignet med den efterligner-sc, som vist i fig 3C og 3D. På den anden side blev de evner af celleproliferation, migration og invasion forbedret efter blev cellerne transfekteret med MIR-30c-inhibitor (fig 3A -3D).

(A). En MTT assay viser, at MIR-30c efterligner undertrykt cellelevedygtighed (øvre), hvorimod MIR-30c inhibitor fremmet cellelevedygtighed (lavere). (B). MIR-30c-efterligner reducerer relative celleproliferation (øverst), hvorimod miR-30c-inhibitor øger relative celleproliferation (lavere), henholdsvis 72 og 96 timer efter transfektion. (C). Repræsentative fotografier af sårhelende assay viser migreringsevnen af ​​de transficerede celler ved 0, 24 og 48 timer efter sårdannelse. (D). Repræsentative fotografier af celleinvasion i en transwell assay. Det gennemsnitlige antal celler blev talt fra 5 tilfældige mikroskopiske felter (× 200). De viste værdier er middelværdier ± SD af relative celleinvasion. (* P 0,05, ** P 0,01).

Således variable udtryk for miR-30c fremkaldte forskellige effekter på de maligne karakteristika Ishikawa celler. Vi mener, at MIR-30c virker som en tumorsuppressor ved at påvirke proliferation, migration og invasion af EC-celler.

MIR-30c fungerer som en tumor suppressor via MIR-30C-MTA-1-signalvejen

Vi har tidligere bestemt, at mIR-30c mål MTA-1, som er overudtrykt i EF [37], og som virker som et onkogen i mange humane tumorer [38], [39]. Men funktionen af ​​MTA-1 i EF forblev udefineret. Derfor har vi undersøgt, om miR-30c funktioner via miR-30C-MTA-en signalvej. Undertrykkelse af MTA-1 af Sir-MTA-1 inhiberede proliferation af Ishikawa-celler, som indikeret af vores MTT resultater (figur 4A). Endvidere tab af MTA-1 også reduceret cellemigration og invasion, som angivet ved vores sårheling og transwell assayresultater (Fig 4B og 4C). Disse resultater viste, at MTA-1 spiller en pro-tumorigen rolle i EC-celler ved at regulere proliferation, migration og invasion af Ishikawa-celler. Fordi MIR-30c direkte kan undertrykke ekspressionen af ​​MTA-1, og fordi MTA-1 er et onkogen i EF, mener vi, at MIR-30c fungerer som en tumorsuppressor ved at målrette MTA-1.

(A ). En MTT assay viser cellelevedygtigheden (venstre) og relativ celleproliferation (højre) blev undertrykt ved transfektion af Sir-MTA-1 ved 72 og 96 timer. (B). Repræsentative fotografier af sårhelende assay viser migreringsevnen af ​​de transficerede celler ved 0, 24 og 48 timer efter sårdannelse. (C). Repræsentative fotografier af celleinvasion i en transwell assay. Det gennemsnitlige antal celler blev talt fra 5 tilfældige mikroskopiske felter (× 200). De viste værdier er middelværdier ± SD af relative celleinvasion. (D) og (E). Cotransfektion af miR-30C-hæmmer og Sir-MTA-1; cotransfektion af miR-30C-hæmmer og Sir-sc tjente som kontrol. (D). Sammenlignet med kontrolgruppen transfektion cellelevedygtighed (øvre) og relativ celleproliferation (lavere) blev undertrykt ved 96 timer. (E). Repræsentative fotografier af celleinvasion i en transwell assay. Det gennemsnitlige antal celler blev talt fra 5 tilfældige mikroskopiske felter (× 200). De viste værdier er middelværdier ± SD af relative celleinvasion. Forskellene i relativ celleproliferation mellem grupperne optrådte efter 96 timer efter transfektion. (* P 0,05, ** P 0,01).

For at udvide vores undersøgelse, vi cotransficeres miR-30c-hæmmer og Sir-MTA-1 ind i Ishikawa-celler og fandt, at reduktionen af ​​MTA -1 svækket celledeling og invasion medieret af miR-30c-inhibitor sammenlignet med kontrolgruppen-transficerede gruppe (figur 4D og 4E). Vores resultater tyder på, at miR-30c funktion afhænger af MTA-1 og valideret eksistensen af ​​miR-30C-MTA-en signalvej.

østrogen nedregulerer ekspressionen af ​​miR-30c i EF-celler

Efter at have demonstreret tumor undertrykkende evne miR-30c, vi næste undersøgt reguleringen af ​​miR-30C. Forskellen i miR-30c udtryk mellem ER-positive Ishikawa celler og ER-negative HEC-1-B-celler tyder på, at E

2 og ER kunne spille vigtige roller i reguleringen af ​​miR-30C. Således har vi undersøgt, om MIR-30c udtryk ændringer på E

2 behandling.

Sammenlignet med den blanke kontrol, ekspressionen af ​​MIR-30c var markant nedreguleret på en tids- og dosisafhængig måde ved 6, 12, 24 og 48 timer upon 10

-8 M og 10

-10 ME

2 behandling af ER-positive Ishikawa celler (fig 5A). Ændringerne i MIR-30c ekspression induceret af E

2 behandling blev delvis vendes ved samtidig behandling med ICI182780 i Ishikawa-celler (Fig 5B). Ud over de E

2 behandlings-induceret undertrykkelse af MIR-30C, PRI-MIR-30C og præ-MIR-30c blev også nedreguleret (Fig 5C), hvilket antyder, at E

2-ER kan inhibere transkriptionen af ​​mIR-30C i Ishikawa-celler.

(A). MIR-30c blev reduceret ved behandling med 10

-8 M og 10

-10 M E

2 ved 6, 12, 24 og 48 timer efter behandling af QRT-PCR-analyse i Ishikawa-celler. Behandlingen med 10

-8 M E

2 udøvede en mere signifikant hæmning undtagen på 48 t. (B). 10

-8 M ICI182780 delvist vendt reduktionen af ​​miR-30c niveauer induceret af behandling med 10

-8 M og 10

-10 M E

2 ved 24 timer efter samtidig behandling i Ishikawa-celler. (C). Pre-miR-30c niveauer blev reduceret med E

2 behandling i både Ishikawa og HEC-1-B-celler (øverste). Pri-MIR-30c niveauer blev reduceret med E

2 behandling i Ishikawa, men ikke i HEC-1-B-celler (lavere). (D). MIR-30c niveauer blev reduceret ved 10

-8 M og 10

-10 ME

2 behandling ved 6, 12, 24 og 48 timer efter behandling af QRT-PCR-analyse i HEC-1-B-celler . Virkningen af ​​de to koncentrationer afveg på 12 timer efter behandling. (E). 10

-8 M ICI182780 ikke omvendt reduktion af miR-30c niveauer induceret af behandling med 10

-8 M og 10

-10 ME

2 ved 48 timer efter samtidig behandling i HEC-1 -B celler. (F). Behandling med 10

-8 ME

2 opreguleret mRNA ekspression af MTA-1 for både Ishikawa-celler og HEC-1-celler efter 24 og 48 timer henholdsvis en effekt, der blev vendt ved samtidig behandling med 10

-8 M ICI182780 i Ishikawa-celler (øverst), men ikke de HEC-1-B-celler ((lavere) (* P. 0,05, ** P. 0,01)

men fandt vi, at E

2 også reduceret mIR-30c ekspressionsniveauer i eR-negative HEC-1-B-celler (figur 5D). det var expectable at inhiberingen af ​​mIR-30C ekspression af E

2 behandling var ikke er blokeret af ICI182780 i HEC-1-B-celler (figur 5E). Forskellige fra Ishikawa-celler, E kun reduceret

2 ekspressionen af ​​præ-mIR-30c men ikke PRI-mIR-30C i HEC-1-B-celler (fig 5C), hvilket tyder på, at E

2 bør hæmme modningen af ​​miR-30c i en ER-uafhængig måde.

Desuden E

2 opreguleret ekspression af MTA-1 mRNA i både Ishikawa og HEC-1-B-celler, en effekt, der blev vendt ved ICI182780 i Ishikawa-celler kun på udvalgte koncentration og tid (fig 5F). Dette kan tilskrives enten reduktion af MIR-30c induceret ved behandling med E

2 eller et andet som i endnu uidentificeret signalvej.

Tilsammen vores resultater viser, at E

2 betegner en regulatorisk faktor for ekspressionen af ​​mIR-30c, som fungerer i både ER-afhængige og ER-uafhængige måder. Men den præcise underliggende molekylære mekanisme, hvormed E

2 regulerer ekspressionen af ​​miR-30c kræver yderligere detaljerede undersøgelser.

Diskussion

deregulering af miRNA i kræft kan fremme angiogenese, vækst fordel, vævsinvasion og metastase. Men vores forståelse af afvigende udtryk og potentielle roller miRNA i kræft fortsat begrænset. MIR-30c, et medlem af MIR-30 familien, har vist sig at være nedreguleret i EF i microarray analyser [16] og i brystcancer [23] i forhold til normale væv, men opreguleret i ovariecancer sammenlignet med benign eller borderline ovarietumorer [18] og i lungehindekræft celler [29]. MIR-30c kan også tjene som en potentiel biomarkør grundet dens deregulering i forskellige undertyper og maligne stadier af tumorer, herunder brystcancer [21], ovariecancer [18] og mesotheliom [28], [29]. Desuden forøget ekspression af miR-30c korrelerer med gunstige prognose og kliniske effekt af tamoxifen terapi i brystkræft [22] samt længere progressionsfri overlevelse i klar celle renal karcinom [25], men værre overlevelse i malignt mesotheliom [29] og kemoterapeutisk modstand i lungecancer [24]. Især i forhold til rollen som miR-30c i kemoterapeutisk modstand i ovariecancer, Eitan et al. og Sorrentino et al. har gjort kontrasterende konklusioner [40], [41]. De kontroversielle resultater vedrørende miR-30c bekræfte sin vigtige rolle i tumorudvikling og progression, uanset den konkrete tumorigen eller tumor undertrykkende natur.

I denne undersøgelse har vi undersøgt yderligere rolle miR-30c i EF. Vi fandt, at MIR-30C blev nedreguleret i EF-prøver sammenlignet med normale prøver, som angivet ved QRT-PCR-analyse, i overensstemmelse med den tidligere microarray analyse af Boren et al [16]. Desværre havde vi ikke nok sager til værdsætter deregulering af miR-30c udtryk blandt forskellige undertyper og klinisk-patologiske træk. Vores fremtidige studier vil sigte mod at belyse dette spørgsmål. Ikke desto mindre fandt vi, at MIR-30C-ekspression var højere i en ER-negative cellelinje, hvilket indebærer, at MIR-30c kan korrelere med E

2 og ER, samt med specifikke undertyper af EF.

for at udvide vores tidligere undersøgelse, vi grundigt undersøgt sammenhængen mellem miR-30C og MTA-1. Vi har tidligere udført en Luciferase reporter assay, demonstrerede 3′-UTR af MTA-1 målrettet af MIR-30C. Desuden viste vi, at overekspression af miR-30C faldt MTA-1-ekspression på mRNA og protein niveauer i både Ishikawa og HEC-1-B-celler [17]. Her har vi ikke kun restaureret, men også reduceret ekspression af miR-30C og vurderet de deraf følgende ændringer i MTA-1. Vi bruges Ishikawa-celler kun i denne undersøgelse, fordi MIR-30c fungerede den samme i de to cellelinier i vores tidligere undersøgelse. Resultaterne af denne undersøgelse er i overensstemmelse med de af vores tidligere undersøgelse, og vi fandt også, at Sir-MTA-1 og den miR-30c hæmmer arbejdet i et antagonistisk måde. Som vi bekræftet direkte undertrykkelse af MTA-1 ved Sir-MTA-1, var vi i stand til at udlede et funktionelt forhold mellem miR-30C og MTA-1. Bemærkelsesværdigt, identificerede vi også en feedback-sløjfe, hvor undertrykkelsen af ​​MTA-1 forøgede niveauer af MIR-30c, en feedback-effekt, der også forekom med MIR-145 og dens målgen, OCT4 [42]. MIR-30c er tidligere rapporteret at spille en suppression rolle i tumorcelleproliferation, metastase og lægemiddelresistens ved at målrette BCL9 [19], TWF1, vimentin [21] og KRAS [20]. I denne undersøgelse har vi bekræftet, at MIR-30C-MTA-1-signalering pathway repræsenterer en funktionel mekanisme, ved hvilken MIR-30c undertrykker EF. Men Mirs arbejder normalt i reguleringen af ​​flere mål, og vi kunne ikke sige, at der ikke er nogen anden signalvej arbejder med miR-30c i EF.

I øjeblikket reguleringen af ​​miRNA er et emne, der har høstet stigende opmærksomhed. Onconase [43], lysophosphatidsyre (LPA) [19], og EGF og MET receptorer [24] er blevet rapporteret at modulere ekspression af miR-30C. I betragtning af den differentielle ekspression af miR-30c mellem ER-positive og ER-negative EF-cellelinjer, der anvendes i vores undersøgelse og forholdet mellem EF og E

2, valgte vi at undersøge E

2 som kandidat regulator af miR-30c udtryk.

i EF, miR-206 [44] og Lad-7 familie af miRNA [9] korrelerer med E enten ved

2 og eR målrettet ERa eller ved at være omfattet af gradueringen af E

2. Gradueringen af ​​miRNA ved E

2-ER er endeligt påvist [45]. Yamagata et al [6] viste, at ERa, ikke ERp, der inhiberede modning af miRNA ved at forhindre PRI-miRNA-til-pre-miRNA konvertering. Denne interaktion forekommer ved en posttranskriptionel niveau gennem deres tilknytning til drosha og p68 /p72, som kan aktiveres af E

2. Men selv i fravær af E

2, en fysisk forbindelse mellem ERa og drosha stadig forekommer, eventuelt tegner sig for undertrykkelsen af ​​miR-30C i Ishikawa-celler sammenlignet med de HEC-1-B-celler, som vi observeret i dette studere. En anden nylig undersøgelse antydede, at ERa undertrykte MIR-140-ekspression på det transskriptionelle niveau ved at binde til en specifik promotor element (-79 /-50) af MIR-140 [10]. Bortset ERa, ERp [14] og Dicer [13] blev også rapporteret at være relevante i forhold til E

2 i reguleringen af ​​miRNA. Ikke desto mindre blev alle disse resultater afledt af bryst MCF-7-celler. foreslår derfor, vi, at yderligere mekanistiske undersøgelser i EF-celler ønskede.

Vores undersøgelse viste, at E

2 negativt reguleret miR-30c og ​​induceret sit mål gen, MTA-1, i EF-celler, en regulerende hvorefter også blev udvist af mIR-140 og dens målgen, SOX2, i brystcancerceller [10]. Induktion af MTA-1 ved E

2 i EF-celler kan tilskrives et fald i miR-30c eller direkte stimulation af E

2, som begge kræver yderligere undersøgelser.

I derimod har en undersøgelse vist, at miR-30C er opreguleret af E

2 i eR-positiv brystkræft MCF-7cells [13], viser de forskellige modulerende mekanismer, som E regulerer

2 miR-30c i forskellige cancerceller.