PLoS ONE: Insulin signalering i insulinresistens stater og kræft: En Modeling Analyse

Abstrakt

Insulinresistens er fællesnævneren for flere sygdomme, herunder type 2 diabetes og kræft, og undersøge de mekanismer, der er ansvarlige for insulin signalering værdiforringelse er af største betydning. En matematisk model af insulinsignalering netværk (ISN) er foreslået og anvendt til at undersøge dosis-respons-kurverne for komponenter i dette netværk. Eksperimentelle data for C2C12 myoblaster med fosfatase og tensin homolog (PTEN) undertrykt og data for L6 myorør med induceret insulinresistens er blevet analyseret af modellen. Vi fokuserede især på enkelt og dobbelt Akt phosphorylering og påpegede insulin signalændringer relateret til insulinresistens. Desuden er en ny karakterisering af opstrøms signalering af pattedyr mål for rapamycin kompleks 2 (mTORC2) præsenteres. Som det er almindeligt anerkendt, at ISN-proteiner spiller en afgørende rolle også i celleproliferation og død blev ISN model knyttet til en cellepopulation model og anvendt på data fra en cellelinje af akut myeloid leukæmi behandlet med en mammalian target of rapamycin hæmmer med antitumoraktivitet. Analysen afslørede simple relationer mellem koncentrationerne af ISN proteiner og parametrene for cellepopulationen model, der karakteriserer cellecyklusprogression og celledød

Henvisning:. Bertuzzi A, Conte F, Mingrone G, Papa F, Salinari S , Sinisgalli C (2016) Insulin signalering i insulinresistens stater og kræft: En Modeling Analysis. PLoS ONE 11 (5): e0154415. doi: 10,1371 /journal.pone.0154415

Redaktør: Cong Cao, Suzhou Universitet, KINA

Modtaget: December 14, 2015; Accepteret: April 12, 2016; Udgivet: 5 maj 2016

Copyright: © 2016 Bertuzzi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Data taget fra litteraturen og de relaterede kilder rapporteres i papiret

Finansiering:. FP blev støttet af SysBioNet, Italiensk køreplanen forskningsinfrastruktur 2012. Federica Conte blev støttet af Epigenomics Flagship Project (Progetto Bandiera Epigenomica), EPIGEN , finansieret af det italienske undervisningsministerium, universiteter og forskning (MIUR), og National Research Council (CNR). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Insulinresistens betegner fællesnævneren for en række sygdomme, herunder fedme, type 2-diabetes (T2D), metabolisk syndrom og cancer. Det skyldes nedskrivning af insulin handling, som inducerer dermed hyper-sekretion af insulin. De vigtigste veje i insulin signalering netværk (ISN) er veletablerede [1,2,3], med serin /threoninproteinkinase Akt /PKB og de to pattedyr Target Of Rapamycin Komplekser (mTORC1 og mTORC2) spiller en særlig rolle. Akt phosphoryleres på Thr308 af phosphoinositid-afhængig proteinkinase-1 (PDK1) og Ser473 af mTORC2 [4], og den maksimale Akt aktivitet opnås, når molekylet er phosphoryleret på både resterne, hvilket tillader translokation af insulin-regulerede glukosetransportører (GLUT4) i muskel og fedtvæv [5,6]. PDK1 og mTORC2 også reagere på aktivering af insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF1) [3].

kinasekaskade gennem insulinreceptoren (IR) op til mTORC1, samt mTORC1 aktivering ved aminosyrer og energi, er klart vurderes [7]. Derimod opstrøms regulering af mTORC2 endnu ikke velkarakteriseret [8]. Knolde sklerose kompleks 1/2 (TSC1 /TSC2) ser ud til at være behov for mTORC2 aktivering [2,9]. Imidlertid blev dette synspunkt spørgsmålstegn i en undersøgelse, der rapporterede eksperimentelle tidsforløb for flere proteiner ifølge ISN under aminosyrer og insulin-stimulering [10]. Fortolkning af data, som en dynamisk model af nettet, blev det fremført, at mTORC2 aktivering pathway kan stamme fra IR eller insulin receptor substrat-1 (IRS1), eventuelt via en variant af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) [10] . Endnu anden opfattelse opstået fra forsøg med ikke-diabetiske mus både in vivo og in muskelbiopsier, og i L6-celler udsat for et medium beriget med proteiner udskilt af tyndtarmen hos diabetiske rotter og til serum fra insulin resistente mennesker [11]. Denne undersøgelse viste, at jejunal faktor /s fremkalde insulinresistens og at disse faktorer aktiverer mTORC2, som afsløret af en øget værdi af Ser473 Akt fosforylering, selv i fravær af insulin stimulation. Tilstedeværelsen af ​​sådanne tarm faktorer er også foreslået af faldet af insulinresistens efter fedmekirurgi [12].

mTORC1 substrat p70S6 kinase 1 (S6K1) er involveret i reguleringen af ​​proteinsyntese og væksten af ​​cellen størrelse, og aktiv S6K1 inhiberer IRS1 i en negativ tilbagekoblingssløjfe [3]. Desuden er Akt substrat Forkhead kasse protein O1 (FoxO1) involveret i reguleringen af ​​proliferation og apoptose, så insulin signalering netværket har en stor rolle, ikke kun i fedme og diabetes, men også i kræft [3,13,14].

Efter skelsættende papirer Wanant og Quon [15] og af Sedaghat et al. [16], har flere undersøgelser undersøgt opførslen af ​​ISN induceret af insulin stimulus ved at udvikle matematiske modeller og analysere de eksperimentelle data. Nogle undersøgelser fokuseret på svar på en trinvis forøgelse af ekstracellulær insulin koncentration [15,16,17,18,19,20]. Især den matematiske model forslag Kiselyov et al. [17] udgjorde både høj og lav affinitet sites i de to monomerer af insulinreceptoren. Brännmark et al. [18] undersøgte mulige ordninger, der forklarer den ejendommelige opførsel observeret i phosphoryleringen af ​​insulinreceptoren og insulinreceptoren substrat. Mere komplette dynamiske modeller, støttet af analysen af ​​tidsforløbet for proteinkoncentrationer efter insulin stimulation, blev udviklet og undersøgt [10,19,20]. Komplekse dynamiske modeller blev foreslået at repræsentere signalering gennem ErbB receptorer op til PI3K og Akt, med henblik på at udforske reaktion på et anticancerlægemiddel [21], og at modellere insulin inducerede initiering af eukaryot translation [22].

de dosis-respons kurver, dvs. steady state koncentrationer ved givne insulin niveauer, blev behandlet i andre undersøgelser. Giri et al. [23] og Wang [24] undersøgte opførslen af ​​dosisresponskurverne af komponenter af ISN versus ekstracellulære koncentration insulin, for at bestemme de betingelser, der producerer en hysterese i kurverne som følge af samspillet mellem negative og positive feedback-sløjfer til stede i systemet. Skønt den eksperimentelle tidsforløbet for proteinkoncentrationer under konstant insulinstimulering viser, at nogle proteiner ikke kan opnå en tydelig stabil tilstand op til 2 timer [10], dosis-respons-kurver er stort set anvendes i litteraturen til at vurdere adfærd ISN komponenter på forskellige niveauer af insulin stimulation og evaluere reaktion på forstyrrende stoffer og narkotika.

Formålet med nærværende undersøgelse er at undersøge de faktorer, der påvirker de basale proteinkoncentrationer og dosis-respons kurver af ISN. Brug af Michaelis-Menten-ordningen af ​​kemiske reaktioner, vi udviklet en matematisk model af netværket på steady state, som fokuserer på enkelt og dobbelt Akt phosphorylering og opstrøms signalering af mTORC2. Baseret på data fra litteraturen af ​​skeletmuskulaturen linjer, viser vi, hvordan modellen kan repræsentere virkningerne af gendæmpning. De faktorer, der inducerer insulinresistens modelleres efter resultaterne i [11]. Forbedret modellering af Akt og mTOR komplekser anvendes også her for at simulere ISN respons i forhold såsom TSC2 null og langsigtet rapamycin behandling. I betragtning af det nære forhold mellem insulinresistens og kræft, hovedsageligt på grund af Akt og mTOR signalering, vi kombinerede insulin signalering model med en cellepopulation model for at undersøge virkningerne af mTOR inhibitorer med antitumorvirkning på ISN proteiner og på cellepopulation respons.

Resultater

ordningen af ​​vores model i figur 1 er baseret på den aktuelle visning af ISN struktur [2,3,14,25]. Da Akt kan være uafhængigt phosphoryleret i Ser473 af mTORC2 og Thr308 af PDK1 [8], vi omfattede alle de veje, der fører til den fulde Akt aktivering. antages mTORC2 at blive aktiveret af den phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphat (PIP3), som foreslået i [3,26], og med en faktor J ikke afhængig af PI3K, som eventuelt medieres gennem vækstfaktorreceptorer [11 ]. Aktiveringen af ​​mTORC1 er repræsenteret her i en temmelig enkel måde, udelade TSC inhibering med Akt og den deraf mTORC1 aktiveringen via Ras-homolog beriget i hjernen (Rheb). Ordningen indeholder også den direkte Akt substrater glycogensyntasekinase 3 (GSK3) og Forkhead kasse protein O1 (FoxO1). Den aktiverede S6K1 phosphorylerer IRS1 og Rictor i negativ feedback loops [25]. En positiv spiral fra Akt til proteintyrosinphosphatase 1B (PTP1B) er også inkluderet [16]. Mens aktiveringen vejen til mTORC2 gennem TSC2 (Huang, Dibble, Matsuzaki, Manning, 2008) ikke blev betragtet på baggrund af resultaterne i [10], er den nuværende model ikke omfatter efter enkelhed nogle etablerede veje i netværket, for eksempelvis IR intracellulære pool og receptoren genanvendelse, TSC2 aktivering fremmes af FoxO1 [27] og S6K1 aktivering ved GSK3 [28].

aktivering af insulin (i) insulin receptor (IR) katalyserer tyrosin phosphorylering af IRS1. Phosphoryleret IRS1 binder p85 regulatoriske underenhed af PI3K, aktivering af p110-katalytiske underenhed. PI3K medierer phosphorylering af PI (4,5) -bisphosphate (PIP2) til PI (3,4,5) -trisphoshpate (PIP3) nær plasmamembranen (PM) og fosfatase og tensin homolog (PTEN) dephosphorylerer PIP3 tilbage til PIP2. PIP3 rekrutterer Akt og PDK1 til PM, hvor PDK1 phosphorylerer Akt på Thr308 (fosfatase PP2A). mTORC2 aktiveres af PIP3 og af faktor J, og katalyserer Akt phosphorylering på Ser473 (phosphatase PHLPP). Maksimal Akt aktivitet opnås, når molekylet phosphoryleres på begge Thr308 og Ser473 rester, tillader translokation af GLUT4 glukosetransportører til PM. GSK3 og FoxO1 er direkte Akt substrater. Akt aktiverer også mTORC1, som igen aktiverer S6K1. Aktiveret S6K1 phosphorylerer IRS1 og Rictor i negativ feedback loops. Den positive feedback fra Akt til PTP1B er også inkluderet. Feedback loops er repræsenteret ved dristige linjer.

De kemiske reaktioner i vores ISN model er for det meste repræsenteret ved den klassiske Michaelis-Menten-ordningen [29,30], og diskuteres i S1 File (Tekst S1) . Flere af de forudsætninger tilladt os at forenkle modellen. Intracellulær lokalisering af proteiner (cytosol vs. membranassocieret), samt intracellulær transport, blev forsømt. Proteinkomplekserne (f.eks mTORC1 og mTORC2) blev behandlet som simple molekylære bestanddele.

De kinetiske ligninger for koncentrationerne af de proteiner, der også indeholder vilkårene for syntese og nedbrydning af substrater og enzymer, er rapporteret i S1 File (Text S2). Som vores mål er analysen af ​​dosis-respons-kurver, derefter afledt vi koncentrationerne af de kemiske stoffer ved ligevægt. Under den afgørende forudsætning, som foreslået i [31], at nedbrydningshastigheden konstant af en kompleks enzym-substrat er ubetydelig i forhold til summen af ​​dissociation og katalytiske konstanter, ligevægtsbetragtninger læs temmelig simpel form. De ISN model ligninger i normaliseret form, der anvendes til analyse af den muskel cellelinjer C2C12 og L6 rapporteres i afsnittet Models, ligning (1) – (16). S1 Tabel giver udtryk for parametrene i ligning (1) – (16) i form af de kinetiske parametre for ligninger i S1-fil (Tekst S2)

C2C12 myoblaster

Den eksperimentelle. data i [32] vist de normaliserede phosphoryleringsniveauerne i C2C12 myoblastceller af IR (Tyr1146), Akt (Ser473) og (Thr308), GSK3p (Ser9), S6K1 (Thr389), og AS160 (Thr642) ved nul insulin og på insulin koncentrationer på 1, 10 og 100 nM, plus de normaliserede koncentrationer af PIP3 og GLUT4

pm ved nul insulin og på en tildelt insulin værdi. Forfatterne rapporterer dataene for kontrol og PTEN-undertrykte celler, hvor PTEN proteinkoncentrationen blev reduceret med op til 10% af kontrol. Vi brugte disse data, undtagen dem, der PIP3 og AS160, der blev anvendt til forudsigelse, at estimere ISN modelparametre. Den positive feedback fra Akt til PTP1B blev ikke medtaget, fordi IR phosphoryleringsbegivenheder data var ens i kontrol og PTEN-lyddæmpet celler (Fig 2 panel A). Som gjort i [20], de normaliserede eksperimentelle data for Pakt (Ser473) blev passe med summen, givet ved miljøkvalitetskrav (10) og (11) i afsnittet Modeller, fordi det specifikke monoklonale antistof sandsynligvis binde Akt phosphoryleres på Ser473 uanset tilstedeværelsen af ​​det phosphorylerede Thr308. Ligeledes blev data fra Pakt (Thr308) passer med.

data (gennemsnit ± SEM) plottes igen fra Ref [32] for kontrol (sorte firkanter) og PTEN undertrykt (røde firkanter) celler. Solid linjer er dosis-respons kurver forudsagt af modellen for kontrol (sort) og PTEN undertrykt celler (rød). (A) Relativ pIR (Tyr1146). (B, C) Relativ Pakt (Ser473) og Pakt (Thr308). (D) Relativ pGSK3β (Ser9). (E) Relativ pS6K1 (Thr389). (F) Relativ GLUT4 ved PM ved nul (hvid boks) og 100 nM (grå boks) insulin.

Figur 2 viser data fra C2C12 celler, plottes igen fra Ref [32] og anvendes til estimering af parametrene for miljøkvalitetskrav (1) – (16), med

PTEN

n

i ligning (6) sat til en for kontrol og til 0,1 for PTEN-lyddæmpet data . Figur 2 viser også de optimale montering kurver beregnet af modellen og S2 Tabel rapporterer parameterestimaterne (med

jeg

e

, 0,5 og

S

0.5 gives i stedet for

en

0 og

en

1).

jeg

e

, 0,5 blev fundet lig med 44,68 nM. Da de eksperimentelle data er re-normaliseret til at have en enhed værdi ved koncentration maksimal insulin i kontrol, vi beregnet dosis-respons-kurver i figur 2 ifølge denne begrænsning.

En undergruppe af modelforudsigelser vises i S1 fig. Panel A viser forudsigelsen, fremstillet ved den estimerede model, af pAS160 (Thr642) sammen med de data, der ikke er blevet anvendt i forbindelse med vurdering procedure. Mens profilen af ​​pAS160 (Thr642) data blev fulgt temmelig præcist, modellen undladt at forudsige PIP3 koncentrationsdata i PTEN-lyddæmpet celler (panel B). Vi bemærker, at hvis mTORC2 blev aktiveret ved PI3K stedet for PIP3, modellen kunne ikke i tilstrækkelig grad passer Pakt (Ser473) data ved nul og lav insulin i PTEN-lyddæmpet celler, eller forudsigelse af PIP3 koncentrationsdata ville forbedre (S1 Fig, paneler C , D). Den samlede Pakt () ved 100 nM insulin i kontrol er 8,61% af den samlede Akt (S1 Fig panel F) og GLUT4 på plasmamembranen er 48,3% af den samlede GLUT4. Disse værdier er enige med modelresultater rapporteret i [16], hvor Pakt er ca. 9% af den samlede Akt og overfladen GLUT4 opnår 40% af den samlede GLUT4 efter 15 min 100 nM insulin.

S2 Figur viser følsomhed proteinkoncentrationer upon en ± 10% forstyrrelse af de estimerede parametre på den ekstracellulære insulin koncentration på 44,68 nm. Da denne koncentration er lig med

jeg

e

, 0,5, følsomheden over for

S

0.5 er forsvindende. Det samme sker for følsomheder til

en

12 (under 10

-5), mens og har små værdier (S2 tabel). De største positive følsomheder er fundet for

en

9 og

en

10, hvis værdier sættes lig (se S2 tabel) som ingen data om fosforylering af PDK1 og mTORC2 var til rådighed. Parametre, der direkte påvirker downstream proteiner, som mTORC1 og S6K1, også påvirker upstream proteiner, som IRS1 og PI3K, på grund af signalering gennem den negative feedback loop. Det modsatte adfærd

IRS

1

Y

IRS

1

S

bemærkes også.

Som forventet, PTEN sletning øger insulin respons og basisniveauet steget i næsten alle proteiner, i henhold til den negative følsomhed over for

en

8 af alle proteiner nedstrøms PTEN, mens

IRS

1

Y

PI3K er positivt reguleret (S2 fig). Især PTEN protein undertrykkelse forårsager en stigning i basal Ser473 Akt-phosphorylering, hvilket kan phosphorylere og deaktivere FoxO1 med muligheden for at øge signalering til de veje, der regulerer celleproliferation.

L6 myorør

Som vist i figur 3, dataene i [11] giver de normaliserede phosphoryleringsniveauerne i L6 celler af Pakt (Ser473) og (Thr308) ved nul insulin og ved insulin koncentrationer på 0,1, 1, 10 og 100 nM. pGSK3β (Ser9) er rapporteret ved nul og 100 nM insulin. Desuden blev Pakt (Ser473) og pS6K1 (Thr389) ved nul insulin målt i nærværelse af inhibitorerne rapamycin og PP242 at målene begge mTOR komplekser [33]. Dataene blev opnået i kontrolgruppen medium, beriget med proteiner udskilt af jejunal mucosa af ikke-diabetiske mus, og i medium beriget af proteiner udskilt af slimhinden i diabetiske mus (betegnet i det følgende som konditioneret medium eller db /db medium). Baseret på eksperimenter med ikke-diabetiske mus både in vivo og in muskelbiopsier, og i L6-celler udsat for db /db-medium og til serum fra insulinresistente mennesker, er det blevet antaget, at jejunal faktor /r inducerer insulinresistens [11] . Faktoren J, der aktiverer mTORC2, se ligning (8), er medtaget i modellen til at repræsentere virkningen af ​​denne formodede faktor.

Data (gennemsnit ± SD) plottes igen fra Ref [11], bortset fra panel D fra Ref [34]. Data (firkanter) og model fitting (fuldt optrukne linier) afbildet i sort for kontrol og med blåt i celler udsat for konditioneret (db /db) medium. (A, B) Relativ Pakt (Ser473) og Pakt (Thr308). (C) Relativ pGSK3β (Ser9) ved nul (hvid boks) og 100 nM (grå boks) insulin. (D) Relativ 2-DG optagelse i rotte L6 myoblaster. (E) Relativ Pakt (Ser473) ved nul insulin i kontrol (sort) og celler udsat for db /db-medium (rød), i fravær af inhibering og i celler behandlet med rapamycin (50 nM) og PP242 (500 nM). Den røde farve indikerer, at eksperimentelle værdier ikke bevare stigning i basal Pakt (Ser473) fra kontrol til db /db medium i fravær af hæmning, og asterisk påpege, at disse data ikke er blevet brugt i model fitting. Grøn (ingen inhibitor), gul (rapamycin), og lyserøde kasser (PP242) repræsenterer model montering. (F) Relativ pS6K1 (Thr389) ved nul insulin i fravær af hæmning og i behandlede celler (kasserne repræsenterer model fitting).

Vi passer de eksperimentelle data og forudsætter, J har ubetydelig koncentration i kontrol medium og en større koncentration, der skal estimeres, i db /db medium. Til at passe de opnåede data i db /db medium, vi hypotese, at insulinresistens øger også på grund af en øget IRS1 nedbrydning på grund af forbedring af mTORC2 signalering [35]. Denne negative feedback blev repræsenteret ved passende tuning parametrene for PI3K. Figur 3 viser de eksperimentelle data for L6 celler, plottes igen fra [11] og [34], sammen med de optimale montering kurver, og S2 tabel rapporterer parameterestimaterne. Vi observerer, at en høj værdi af Pakt (Ser473) ved nul insulin, som observeret i fig udleveres kun 3 panel A, hvis mTORC2 også aktiveres via en signaleringsvej uafhængige af PI3K, og hvis Thr308 Akt phosphorylering ikke kræves for Ser473 fosforylering.

fosforylering data målt i forsøgene med db /db medium er egnet til en værdi af

J

væsentligt større i forhold til kontrol (0,07 vs. 0,001). Pakt (Ser473) ved nul insulin er i vid udstrækning øges, men dens reaktion på insulin afstumpet (Fig 3A). Svaret fra Pakt (Thr 308) og af pGSK3β (Ser9) er også deprimeret (panel B og C). De 2-GD uptake data rapporteret i figur 3D var tilstrækkeligt passe af modellen. Den forudsagte 2-DG-optagelse i nærvær af db /db medium (felt D) blev beregnet ved at antage, at hastighedskonstanterne der regulerer GLUT4 translokation til plasmamembranen er mindre sammenlignet med kontrol [5,6], se S2 tabel.

målt i nærvær af rapamycin og PP242 data er vist fig 3 paneler EF. Modellen passer hæmning af basal (ingen insulin) pS6K1 (Thr389) både i kontrol og db /db medium (panel F) tilstrækkeligt. S6K1 inhibering fører på sin side på grund af svækket negativ feedback, til et fald i og en stigning i (S2 Fig, panel A-D), hvilket vil øge insulin signalering. I basale Pakt (Ser473) data (Fig 3, panel E), er den dårlige forudsigelse for celler udsat for db /db medium forårsaget af eksperimentel variabilitet og dataene blev ikke brugt til model montering. I celler behandlet med Rapamycin, den svækkede negativ feedback ført til en stigning på

mTORC

2

n

og dermed øge Pakt. Derimod PP242 påvirker Akt fosforylering på Ser473, så

Akt

S

og

AKT

T

,

S

er stærkt reduceret. En undergruppe af modelforudsigelser vises i S3 Fig, hvor panel F giver en 3D-gengivelse af komponenterne i Pakt. Ved 100 nM insulin, total Pakt er 78,7% af den samlede Akt i kontrol. Samlet set fremgår det, at den nuværende model giver et tilstrækkeligt montering af L6 data.

S4 Fig viser følsomheden af ​​proteinkoncentrationer til de estimerede modelparametre på den ekstracellulære insulin koncentration på 9,69 nM (estimeret

I

e

, 0,5). Det generelle mønster af følsomheder for de L6-celler i kontrol- og db /db medium ligner den, der findes for C2C12 celler, hvilket bekræfter, at modellen er i stand til at repræsentere begge typer data. Desuden følsomheder til og er små i henhold til de små værdier af estimater henviser, som forventet, sensitivitet til faktor J stigning i celler udsat for db /db-medium sammenlignet med kontrol. Følsomheden over for

en

12 er lille i både C2C12 og L6 celler, hvilket tyder på, at den negative feedback loop fra S6K1 til mTORC2 har en ubetydelig rolle i disse linier.

L6 celle data blev også analyseret i overværelse af de positive tilbagemeldinger, med den konstante

en

P

i ligning (4) indstilles til en mindre værdi for cellerne i db /db medium sammenlignet med kontrol. Resultaterne er dog ikke synes at forbedre dem, der opnås med den nuværende model.

Simuleringer med forbedrede modeller af Akt og mTOR komplekser

Tre mulige forlængelser af modeller af Akt og mTOR komplekser her anses:. sub-cellulære Akt lokalisering, mTORC1 aktivering og mTORC2 reaktion på rapamycin

handel med molekyler i cellen reguleres af diffusion og aktiv transport, processer, som kræver en kompleks matematisk behandling baseret på delvis differentialligninger [36,37]. For at give en forenklet model af sub-cellulære lokalisering af Akt, har vi kun overvejet Akt fosforylering på Thr308. Derfor har vi Akt molekyler i cytosoliske rum (Akt

cyt og Pakt

cyt), dem, der findes på PM (Akt

pm og Pakt

pm), og dem i kernen (Pakt

nuc). Figur 4 panel A viser et arrangement med modellen.

(A) PIP3 rekrutterer PDK1 og Akt til plasmamembranen. På PM, er Akt phosphoryleres med PDK1 og dephosphoryleret med PP2A. Transport af endnu ikke phosphoryleret Akt fra PM tilbage til cytosol reguleres af hastighedskonstanten

k

-13. Phosphoryleret Akt transporteres til cytosol (hastighedskonstanten

k

mc

), hvor det dephosphoryleret af PP2A eller importeret ind i kernen (

k

cn

). Eksport fra kernen er reguleret af

k

nc

. (B) Phosphoryleret Akt inaktiverer TSC2. Aktiv TSC2 fremmer Rheb binding til BNP og TSC2 inaktivering stimulerer konvertering fra Rheb /BNP til aktiv Rheb /GTP, som igen aktiverer mTORC1. mTORC1 hæmmes også ved PRAS40. Boksen herunder aktiv mTORC1 og prolin-rige Akt substrat på 40 kDa (PRAS40) tegner sig for reaktion (3) i S1 File (Tekst S3). (C) PRAS knockdown (KD:

K

mTOR

tidoblet i forhold til at styre og

φ

= 0,7, lyserøde kasser) og overekspression (OE:

K

mTOR

halveret i forhold til at styre og

φ

= -5/6, gule kasser) og påvirkning af mTORC1 aktivering ved 1 nM insulin. (D) Normaliserede koncentrationer Rheb /GTP og T389 S6K1 ved 1 nM insulin med PRAS knockdown (tifold

b

PRAS

fald, lyserøde kasser), PRAS overekspression (dobbelt

b

PRAS

stigning, gule kasser), og med både PRAS (dobbelt

b

PRAS

stigning) og Rheb (femdoblet

b

Rheb

stigning) overekspression (orange kasser). (E) Normaliserede proteinkoncentrationer i TSC2-nul-celler ved 1 nM insulin. (F) Reaktion på kort sigt og lang sigt rapamycin behandling af mTORC1 og mTORC2, og påvirkning af Akt fosforylering på 10 nM insulin. Kort- og langsigtede behandlinger:

K

mTOR

i ligning (14) af S1 File (Tekst S3) sat til 0,1 af kontrol. Langsigtet-behandling: parametre og af Akt Equities (9) – (11) indstilles til 0,1 af kontrol

De ligninger af Akt-koncentrationer er angivet i S1 File (Tekst S3) og show. at på steady state, de tre koncentrationer af phosphoryleret Akt tendens til at være lige, forudsat at

k

nc

≅

k

cn

k

mc

≅

K

15

PP

2

A

.

Akt

cyt

tendens til at være lig med

Akt

pm

forudsat der er lig med

K

13

PDK

1 og

k

-13 er meget mindre end disse to mængder også ved lave insulin niveauer. Desuden

k

mc

skal være meget større end

K

14

PP

2

A

. Selv om vi har ingen data, der sikrer, at disse betingelser er opfyldt, de garanterer, at de fleste af Akt

cyt sikkert når PM og phosphoryleres, og at Pakt

pm hurtigt omplantes fra PM til cytosolen, hvor det har at phosphorylere flere substrater . Under disse betingelser Akt model betragtes i S1 File (Text S1, Text S2) og ligning (9) – (11), hvor sub-cellulære lokalisering er blevet tilsidesat, kan betragtes som en passende model for AKT kinetik i steady state . Vi bemærke dog, at den forbigående reaktion af Akt koncentrationer til en pludselig ændring i koncentrationen insulin vil sandsynligvis være anderledes, om den sub-cellulære lokalisering anses eller ej.

Figur 4 panel B viser ordningen af den forbedrede model af mTORC1 aktivering. EQS (12) – (15) i S1 File (Tekst S3) giver de normaliserede koncentrationer af de molekylære komponenter og litteratur data giver oplysninger om protein reaktion på Akt. TSC2 phosphorylering niveau ved T1462 har en mere end 10 gange stigning i HEK-293-celler efter serumstimulering [38]. Stigningen i PRAS40 phosphorylering niveau på T246 kan variere fra ca. 10 gange til 20 gange i isoleret skeletmuskulatur med mindre værdier i hjerte, lever og fedtvæv [39]. Disse data begrænsninger i forbindelse med vurdering af parametrene i ligning (12) – (15), og entydighed af estimaterne var sikret ved at sætte

φ

= -0,67 (

b

PRAS

= 3

b

mTORC

1, dvs. hastigheden af ​​PRAS syntese er tre gange større end den heterotrimeren mTOR, raptor, mLST8) og. For at estimere de resterende parametre, tog vi profilerne af og

mTORC

1

n

som en funktion af

jeg

e

opnået fra modellen af ​​L6-celler. Profilen af ​​blev brugt som input funktion i (12) og (15) i S1 File (Tekst S3), og parameterværdierne, der optimalt gengives

mTORC

1

n

profil var som følger:

K

TSC

= 65,95,

K

Rheb

= 6,48,

K

mTORC

1 = 7,2 · 10

-3,

K

PRAS

= 16,72.

I simuleringerne præsenteret i figur 4, paneler CF, vi brugte den komplette ISN model for miljøkvalitetskrav (1) – (16) med ligning (14) i

mTORC

1

n

erstattet ved ligning (12) – (15) af S1 Fil (Text S3). Tabet af PRAS40 udtryk var repræsenteret i modellen ved en tidobbelt fald på

b

PRAS

sammenlignet med kontrol, med de deraf følgende ændringer af

K

mTOR

, og

φ

i (14) – (15) S1 File (Tekst S3). Fig 4C viser faldet i

PRAS

40

n

og stigningen i

mTORC

1

n

i denne tilstand, sammenlignet med kontrol. Derimod PRAS40 overekspression med en fordobling i

b

PRAS

hæmmer mTORC1 aktivering. I figur 4D, de normaliserede koncentrationer af T389 S6K1 under PRAS knockdown og overekspression (pink og gul kasser, henholdsvis) følge reaktion

mTORC

1

n

vist i panelet C. Under både PRAS og Rheb overekspression (Orange feltet), mTORC1 og S6K1 ikke længere hæmmede i forhold til kontrol, fordi GTP-loaded Rheb overvinder PRAS40-medierede mTORC1 hæmning, som påpeget i [38], og forudsagt af ligning (14) i S1 Fil (Text S3). Resultaterne af simuleringerne i felt D synes at være enige, kvalitativt mindst, med den øgede T389 S6K1 phosphorylering vist ved blots i fig 4E (HEK293E celler) og fig 5E (MEF’er og HT-29 coloncancer-celler) af [40] .

(A) Ordning af model, der anvendes til analyse af AML celle befolkningsdata i fravær og tilstedeværelse af AZD8055. Blokkene repræsenterer G0 /G1, S og G2M celler med × 2 blok angiver binære celledeling.

λ

1 er hastighedskonstanten for G1S overgang,

T

2 og

T

3 de transittider i S og G2M faser og

μ

‘hastighedskonstanten af ​​celletab. D

1-D

3 repræsenterer celler tabt fra levedygtige rum men stadig målbar, og A de apoptotiske organer og fragmenter, med

μ

” hastighedskonstanten af ​​celle fragmentering. (B) data, plottes igen fra Ref [44], af celle fraktioner i cellecyklus faser i kontrol og celler behandlet med 10, 100, og 1000 nM AZD8055 (lukkede firkanter), og model fitting (fuldt optrukne linjer). Panelet viser også data og montering af LI normaliseret til at styre, og af den samlede fraktion af døde celler og fragmenter. (C) Korrelation mellem data fra acridinorange-farvning i A549-celler, plottet igen fra Ref [43], og fraktion af døde celler. (D) Forholdet mellem faldet i Pakt (Ser473) (firkanter) og af

λ

1 ved stigende lægemiddelkoncentrationer. Montering linje

y

= 1,03

x

/(0.18·10

-2+

x

), med

y

= Pakt (Ser473 ) og

x

=

λ

1. En lignende funktion passer forholdet mellem GSK3p (Ser9) (trekanter) og

λ

1.