PLoS ONE: immunadjuvansaktivitet of Pre-Resectional radiofrekvens ablation Beskytter mod lokale og systemiske Gentagelse i Aggressiv murine Colorectal Cancer

Abstrakt

Formål

Mens kirurgisk resektion er en hjørnesten i kræftbehandling, lokale og fjerne gentagelser fortsat påvirke resultatet i en betydelig andel af patienterne. Dokumentation for, at en alternativ debulking strategi med radiofrekvens ablation (RFA) inducerer antitumor immunitet bedt den nuværende undersøgelse af effekten af ​​at udføre RFA forud for kirurgisk resektion (pre-resectional RFA) i en præklinisk musemodel.

Eksperimentel Design

terapeutisk effekt og systemiske immunreaktioner blev vurderet efter pre-resectional RFA behandling af murine CT26 colon adenocarcinom.

Resultater

behandling med præ-resectional RFA betydeligt forsinket tumorvækst og forbedret samlet overlevelse sammenlignet med sham operation, RFA, eller resektion alene. Mus i den præ-resectional RFA gruppe, der opnåede komplet respons viste holdbare antitumor immunitet ved tumor re-udfordring. Manglende at opnå en terapeutisk fordel i immundefekte mus bekræftede, at tumor kontrol ved præ-resectional RFA er afhængig af en intakt adaptiv immunrespons snarere end ændringer i fysiske parametre, der gør ablaterede tumorer mere modtagelig for en komplet kirurgisk excision. RFA forårsager en markant stigning i intratumoral CD8

+ T-lymfocyt-infiltration, således i det væsentlige at øge forholdet mellem CD8

+ effektor T-celler: foxp3

+ regulatoriske T-celler. Vigtigere, pre-resectional RFA øger antallet af antigen-specifikke CD8

signifikant + T celler i tumormikromiljøet og tumor-drænende lymfeknude, men havde ingen indvirkning på infiltration af myeloide afledte suppressorceller, M1 makrofager eller M2 makrofager på tumor-sites eller i perifere lymfoide organer (dvs. milt). Endelig, pre-resectional RFA af primære tumorer forsinket vækst af fjerne tumorer via en mekanisme, der afhænger af systemisk CD8

+ T-celle-medieret antitumor immunitet.

Konklusion

Forbedret overlevelse og antitumor systemisk immunitet fremkaldt af præ-resectional RFA støtte translationel potentiale i dette neoadjuverende behandling for kræftpatienter med høj risiko for lokal og systemisk recidiv

Henvisning:. Ito F, Ku AW, Bucsek MJ, Muhitch JB, Vardam -Kaur T, Kim M, et al. (2015) immunadjuvansaktivitet af Pre-Resectional radiofrekvens ablation Beskytter mod lokale og systemiske Gentagelse i Aggressiv murine kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (11): e0143370. doi: 10,1371 /journal.pone.0143370

Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, ITALIEN

Modtaget: 10. februar, 2015; Accepteret: November 4, 2015; Udgivet: 23 November, 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (CA79765 og AI082039 til SS Evans, CA098156 og CA109480 til SO Gollnick og P30CA016056 til Roswell Park Cancer Institute); og Jennifer Linscott Tietgen Family Foundation (J. J. Skitzki og S.S. Evans). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kirurgi forbliver frontlinjen terapi og bedste helbredende mulighed for kræftpatienter med resektabel sygdom. Målet med kirurgisk excision er fuldstændig fjernelse af tumorer med mikroskopiske kræft-fri margener. Desværre er der mange patienter udvikler lokal eller systemisk tilbagefald trods fremskridt i kirurgisk teknik og adjuverende kemoterapi eller strålebehandling. I kolorektal levermetastaser, f.eks tilbagefald sats er op til 60% hos patienter, der gennemgår en potentiel kurativ resektion, formentlig på grund af mikroskopisk residual sygdom eller mikrometastaser til stede på tidspunktet for kirurgi [1-3]. Bevis for en høj sats for fornyet og metastatisk spredning i patienter efter kirurgi foreslår endvidere, at selv om systemisk antitumor immunitet er tydelig i fremskredne kræftpatienter, immunresponset steady-state er utilstrækkeligt til at opnå tilstrækkelig kontrol tumor [4]. Ved den tid tumorer er påviselige de allerede har udviklet mekanismer til at flygte fra immunologisk anerkendelse og elimination [4]. Således resektion tumor prøver viser ofte sparsomme infiltration af CD3

+ T-lymfocytter, herunder CD8

+ cytotoksiske effektor T-celler, som korrelerer med dårlig prognose i flere histologiske tumortyper herunder kolorektal cancer [5-7].

In situ

termiske ablation teknikker, såsom radiofrekvens ablation (RFA), er dukket op som lovende behandlingsmuligheder for inoperabel solide maligne tumorer [8, 9]. RFA er godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) for ablation af primære og metastatiske tumorer, og er blevet anvendt i behandlingen af ​​en række neoplasmer, herunder lever, kolorektal, lunge-, prostata-, nyre, bryst, hjerne, skjoldbruskkirtel, melanom, og knogletumorer [9]. Ved behandling af kolorektale kræft levermetastaser har RFA været brugt hyppigst

via

åbne, laparoskopiske eller billedbaserede vejledt perkutan tilgange og kan udføres under universel eller lokal bedøvelse med minimale komplikationer [8, 9]. RFA anvendes også i kombination med kirurgisk resektion i patienter med flere leverlæsioner, hvor fuldstændig resektion ikke er mulig på grund af tumor nærhed til vitale strukturer (fx blodkar eller galdegangene) eller utilstrækkelig parenkym at støtte post-hepatektomi funktion [2, 10].

Den energi leveret af RFA forårsager ionisk agitation som omdannes ved friktion til fokal høj temperatur hypertermi (≥50 ° C), hvorved der induceres uoprettelig cellulær skade og koagulerede nekrose [8]. Ud over denne direkte cytoreduktive antitumoraktivitet, er RFA blevet vist at fremkalde immunmodulerende effekt i prækliniske og kliniske undersøgelser [8, 11]. I modsætning til kirurgisk resektion, det beskadigede tumorvæv efter RFA forbliver

in situ

og tilvejebringer en kilde til tumorantigener. Disse antigener optages og behandles af lokale dendritiske celler (DC) og præsenteret for T-lymfocytter i tumor-drænende lymfeknuder (TdLN), hvilket fører til en udvidelse af en tumor-specifikke CD8

+ effektor T-celle pool [8 , 12, 13]. Især en tæt CD3

+ T-celle infiltration er blevet rapporteret ved tumor-sites efter RFA, i overensstemmelse med lokal antitumor immun reaktivitet [14, 15]. Yderligere bevis på RFA-induceret systemisk immunitet stammer fra prækliniske og kliniske rapporter om abscopal effekter involverer spontan regression af fjerne metastatiske læsioner efter primær tumor ablation [16-20]. celle-afhængige antitumor immunrespons T genereret af RFA i patienter og musemodeller synes imidlertid at være relativt svag [11, 14, 15], og et stort problem er fortsat den høje lokalt recidiv på behandlingsstedet, især for tumorer 3 cm eller tæt på store vaskulære netværk, hvor blodet indstrømning grænser termisk koncentration i målvævet via kølelegeme effekter [2, 8]

Bekymringer om tumor genvækst i overgangszonen af ​​subletale hypertermi (≤45. ° C), der omgiver den centrale nekrotiske zone har begrænset brugen af ​​RFA hovedsagelig palliation eller til patienter, som ikke kan tåle resectional kirurgi. Her testede vi den hypotese, at lokal kirurgisk resultat kunne forbedres, hvis RFA blev anvendt som en præ-resectional immunogene strategi til fremme af antitumor immunitet. Vi rapporterer, at lokal og systemisk tumor kontrol og samlet overlevelse blev forbedret betydeligt som følge af induktion af et CD8

+ cellemedieret adaptive immunrespons T efter pre-resectional RFA i en musemodel for tyktarms- og endetarmskræft.

Materialer og metoder

mus

BALB /c og C57BL /6 mus (8-12 uger) var fra National Cancer Institute eller Charles River. Svær kombineret immundefekte mus (CbySmn.CB17-Prkdc

scid /J SCID /BALB /c; Jackson Laboratory) og Klon 4 transgene mus (CBy.Cg-

Thy1a

Tg (TCRA (C14, TcrbC14) 1Shrm /ShrmJ), der udtrykker en α /β T-celle receptor specifik for influenza hemagglutinin (HA;. fra Linda Sherman, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) blev avlet i Roswell Park Department of Laboratory Animal Resources Musene blev opretholdt i pathogen- gratis barriere betingelser. Alle dyr pleje og procedurer var i overensstemmelse med de institutionelle politikker for dyrs sundhed og trivsel og godkendt af Roswell Park Cancer Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).

Transplanterbare tumormodeller og CD8

+ T-celle depletion

tumorceller (CT26 colon adenocarcinoma celler og CT26-HA-derivat transficeret med et gen, der koder hæmagglutinin [21, 22] syngene til BALB /c eller SCID-mus; B16.F10 melanom syngene til C56BL /6-mus) blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (Life Technologies, Carlsbad, CA), 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin, 50 uM β-mercaptoethanol, og G418 (400 ug /ml; for CT26-HA). Tumorceller (10

6 for CT26 eller 3×10

5 for B16, i 100 pi PBS) blev injiceret subkutant i flanken af ​​syngeniske mus, medmindre andet er angivet. Tumor mængder (der spænder fra 150 til 500 mm

3) var ikke signifikant forskellig mellem tildelte grupper på tidspunktet for den indledende behandling. Tumorvolumener blev beregnet ved at bestemme længden på kort (

l

) og lang (

L

) diameter (volumen = l

2 x L /2). Eksperimentelle endepunkter blev nået, når tumorer oversteg 20 mm i diameter, eller når musene blev døende og viste tegn på lateral recumbancy, kakeksi, manglende respons på skadelige stimuli, eller observerbar vægttab. Den ipsilaterale inguinal node blev identificeret som den sentinel TdLN ved lokalisering af Evans blåt farvestof 1 minut efter injektion af farvestof nær s.c. tumorstedet. At modellere slutstadiet lunge metastase, 10

5 CT26-celler blev injiceret i halevenen 7 dage efter primær, s.c. tumor injektion; 30 dage senere blev CT26 knuder optalt af efterforskere blindet at prøve identitet i oppustede lunger farvet med en 15% opløsning af tusch, og bleget af Fekete løsning. For udtømning af CD8

+ T-celler in vivo, blev mus injiceret i.p. med 400 ug anti-CD8a mAb (fra 53 til 6,72, BioXCell) hver 7 dage starter umiddelbart efter RFA behandling. CD8

+ T-celle depletion blev bekræftet ved flowcytometri under anvendelse af anti-CD8β mAb (YTS156.7.7, Pe-Cy7) (BioLegend); 2% af CD3

+ T-celler var CD8

+ efter antistofbehandling

RFA

Mus blev bedøvet med inhalations isofluran gas (4% isofluran til anæstesi induktion;. 1,5% for vedligeholdelse). Mus blev anbragt tilbøjelige på en el-ledende jordforbindelse pad, og tumorområdet blev våde med destilleret vand før indføring af StarBurst SDE probe (AngioDynamics) ind til centrum af tumoren. Plejetabletter en probespids temperatur på 90 ° C i 1 minut under anvendelse af RFA RITA 1500 generator (AngioDynamics) Simuleret den kliniske tumor tilbagefald efter RFA, som tidligere beskrevet af Johnson et al [23]. Sham RFA blev udført ved at indsætte sonden i tumoren uden elektrisk strøm. For yderligere kontrolgrupper RFA blev administreret i huden væk fra s.c. tumor (dvs. øvre ryg). Mus blev udvundet på et varmetæppe og givet analgetikum (buprenorphin 0,05 mg /kg legemsvægt) s.c. til smertebehandling.

Kirurgisk resektion

Mus blev bedøvet med isofluran inhalations gas og tumorer blev udskåret med 1 mM margener omkring synlig ramme af tumoren. Fascia blev reseceret sammen med tumor (

en bloc

) i alle tilfælde at minimere gentagelse fra den dybe margen. Patologisk evaluering af tumoren /stromal grænseflade på tidspunktet for udskæring i sentinel mus viste infiltrativ tumor i grænserne i 40-60% af musene, uanset om præ-resectional RFA blev administreret. Snit blev lukket med 4-0 Vicryl® sutur (Ethicon, Inc., Somerville, NJ) og /eller stål sårklemmer som blev fjernet i 7-10 dage. Som en kirurgisk fingeret kontrol, mus undergik en 1 cm incision i huden og lukning i den kontralaterale flanke uden manipulation af tumorstedet. I udvalgte eksperimenter blev partiel resektion udført, klassificeret efter påviselig makroskopiske og mikroskopiske residual sygdom, hvor ~ 50% af tumormassen blev udskåret. Mus blev udvundet på et varmetæppe og givet analgetikum (buprenorphin 0,05 mg /kg legemsvægt) s.c. for smerter kontrol.

adoptiv overførsel af klon 4 CD8

+ T-celler

Puljede splenocytter og lymfeknude (LN) celler fra Clone 4 T-celle receptor transgene mus blev positivt beriget af magnetisk celle sortering under anvendelse af en CD8a T-celle isolation kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Isolerede populationer bestod af ~ 85-90% L-selectin

hi CD44

lav naive CD8

+ T-celler, som bestemt flowcytometrisk analyse. Tilsvarende numre af klon 4 CD8

+ T-celler (5-10 x 10

6) mærket med sporing farvestof (4 uM TRITC; Molecular Probes) [22, 24] blev injiceret i.v. i individuelle mus 6 timer efter RFA eller skinbehandlingen. TdLN og tumorvæv blev frosset i optimal skæring temperatur forbindelse (Sakura Finetek).

Serum IFN-γ analyse

Serum blev erhvervet fra mus 1 dag og 7 døgn post-RFA eller simuleret behandling via retroorbital blødning. Prøver blev opbevaret nedfrosset ved -80 ° C indtil analyse af kommercielle ELISA for IFN-γ (R BD Biosciences) [22]. Immune komplekser blev visualiseret under anvendelse af Vectastain Elite ABC og DAB substrat kits (Vector Laboratories). For immunfluorescens histologi blev 9 um kryosektioner fastsat ved -20 ° C i methanol /acetone (3: 1) og farvet med monoklonale antistoffer (anti-muse PNAd antistof, MECA-79; anti-muse CD31-antistof, MEC 13,3, BD Biosciences) og fluorochrom-konjugeret sekundært antistof (Jackson ImmunoResearch) som beskrevet [22, 24]. Digitale billeder af ≥10 tilfældigt udvalgte felter (arealenhed = 0,34 mm

2 pr felt), blev taget til fange af observatører blindet at prøve identitet ved hjælp af et Olympus BX50 opretstående fluorescensmikroskop udstyret med en SPOT RT kamera (Spectra Services). Antallet af adoptivt overført celler beliggende inden for parenchym af TdLN eller tumorer (dvs. betegnet med placeringen af ​​fluorescensmærkede T-celler uden PNAd

+ eller CD31

+ fartøjer henholdsvis) blev kvantificeret med ImageJ software som beskrevet [ ,,,0],21, 24, 25].

flowcytometri

CT26 tumorer fra 1,100-1,700 mm

3 blev anvendt til RFA behandling for at have tilstrækkelig resterende tumorvæv at analysere ved flowcytometri . Tumorer eller milte blev opdelt (Medimachine, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) og fænotypisk analyse blev udført ved anvendelse af multiparameter flowcytometri efter farvning med monoklonale antistoffer: anti-CD8a (53-6.7, Pe-Cy7), anti-CD4 (RM4- 5, PerCP eller V450), anti-CD25 (PC61, APC), anti-L-selectin (Mel-14, APC eller PE), anti-CD44 (IM7, FITC), anti-CD3 (17A2, FITC), anti -CD11b (M1 /70, Pe-Cy7), anti-Gr-1 (RB6-8C5, APC), anti-F4 /80 (T45-2342, PE), anti-MHC II (2G9, FITC), anti- CD45 (30-F11, BUV395) (BD Biosciences); anti-Foxp3 (FJK-16, PE) (eBioscience); anti-CD8β (YTS156.7.7, Pe-Cy7), og anti-CD206 (C068C2, BV421) (BioLegend). Flowcytometrisk analyse blev udført ved hjælp af en LSR II eller LSRFortessa med FACSDiva software (BD Biosciences) og WinList behandlingsprogram (Verity Software House).

Statistisk analyse

Statistisk signifikans af tumorvækst blev bestemt ved 2-vejs ANOVA for gentagne målinger. Overlevelse blev analyseret med Kaplan-Meier-metoden og grupper blev sammenlignet ved anvendelse log-rank test eller ved Gehan-Breslow-Wilcoxon test. Alle andre gruppe forskelle blev evalueret af to-halet uparret Students

t

-test. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM og

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Pre-resectional RFA forbedrer lokal tumor kontrol og overlevelse

for at bestemme om RFA behandling forud for kirurgisk resektion kan mindske lokalt recidiv og forbedre overlevelsen anvendte vi en musemodel for CT26 colonadenocarcinom at simulere kliniske omgivelser, hvor RFA tilbyder oprindelige tumor kontrol, men følges ofte af lokalt recidiv. I pilotundersøgelser optimerede vi størrelsen af ​​tumoren på tidspunktet for ablation sammen med temperaturen og varigheden af ​​RFA. Til disse undersøgelser s.c. CT26 tumorer af omtrent ækvivalent størrelse (~ 150-500 mm

3 i volumen) blev behandlet med RFA (1 minut af ablation ved 90 ° C) på dag 10 efter implantation. Resektion af samme læsion blev udført på dag 17, som angivet i det skematiske vist i fig 1A og 1B. Vi valgte at bruge denne 7-dages interval mellem RFA og kirurgi for at give tilstrækkelig tid til en immunrespons primær antitumor skal genereres efter ablation [11, 13, 26]. Kontrol mus havde resektion eller RFA kun på dag 10 efterfulgt af fingeret operation (uden tumor-regionen) på dag 17, eller fingeret operationer på både dag 10 og 17 (figur 1A).

(A) Tidsplan skitserer forskellige behandlinger anvendes. BALB /c-mus (10-12 mus /gruppe) blev injiceret s.c. med 10

6 CT26 celler i venstre flanke på dag 0. Behandlinger blev udført 10 dage efter tumor inokulering. Primære tumorer blev behandlet som angivet med sham kirurgi, resektion (Rxn) eller RFA på dag 10 eller 17. (B) Skematisk viser sekvensen af ​​indgivelse af RFA (90 ° C i 1 minut) 7 dage før kirurgisk resektion. Tumorvækstkurver (C) og overlevelseskurver (D) af mus, der bar CT26 tumorer i forskellige behandlingsgrupper. I (C), er antallet af langvarige overlevende uden tumor tilbagefald på 150 dage er angivet for hver forsøgsgruppe; for (D) *

P

0.001 for pre-resectional RFA gruppen sammenlignet med alle andre grupper. (E) Overlevende mus (n = 9) i den præ-resectional RFA gruppe blev de igen fik 10

6 CT26 celler i den kontralaterale (højre) flanke på dag 150. Tumor vækstkurver er afbildet i hvilken

T

= 0 svarer til tidspunktet for injektion af sekundære tumorer. Som en kontrol blev tumorvækst overvåges efter podning med samme tumorcelle dosis til ikke-tumor (NT) -experienced naive BALB /c-mus (n = 10); *

P

0,005 som bestemt ved Kaplan-Meier-analyse. Et repræsentativt eksperiment af ≥ tre uafhængige eksperimenter er vist.

Brug denne forsøgsplan vi fundet, at behandling af CT26 med RFA alene resulterede i 60-80% nekrose af individuelle tumor læsioner efterfulgt af ≥ 75% tumor gentagelse hvis ingen yderligere behandling blev givet (fig 1C). Ligeledes kirurgisk excision alene var forbundet med en ≥ 75% lokalt recidiv rate. I modsætning hertil kombinationen af ​​RFA efterfulgt af resektion markant forsinket tumorudvækst sammenlignet med enkelte behandlingsgrupper eller sham-excision kontrolgrupper (Fig 1C). Især blev tumortilbagevenden ikke detekteret i mere end 150 dage i ~ 80% (9 af 11 mus) af mus behandlet med kombinationen af ​​RFA og efterfølgende kirurgi. RFA efterfulgt af resektion yderligere viste signifikant forbedret overlevelse sammenlignet med alle andre grupper i denne dødbringende CT26 tumor model (figur 1D). I denne henseende RFA efterfulgt af resektion resulterede i ~ 80% lokalt recidiv overlevelse sammenlignet med ~ 20% overlevelse efter enkelt behandling med enten RFA eller resektion alene.

Yderligere eksperimenter udelukkede den mulighed, at den observerede terapeutiske fordel af kombineret RFA og resektion kunne tilskrives

(1)

forskelle i den samlede tid værten blev eksponeret for tumorantigener i forskellige behandlingsgrupper (dvs. 10 dage for resektion efterfulgt af skinkirurgi versus 17 dage for RFA + resektion gruppe),

(2)

mere effektiv kirurgi på grund af indledende tumor debulking under pre-resectional RFA, eller

(3)

betændelse udløst af sonde indsættelse (S1A fig). Til disse eksperimenter observerede vi ingen forbedring i CT26 tumorvækstforsinkelse eller overlevelse hvis den oprindelige tumor-debulking blev opnået på dag 10 ved partiel resektion (dvs. 50% reduktion af tumormasse) efterfulgt af excisional resektion på dag 17 eller efter sham RFA i hvilken ablation probe blev indsat i tumorer uden elektrisk strøm (S1B og S1c fig). Yderligere undersøgelser i B16 melanom i syngene C57BL /6 mus (S2A-S2C Fig) fastslået, at RFA i neoadjuverende indstilling forud for operationen har en lignende terapeutisk fordel som observeret for CT26 kolon tumorer. Således er de beskyttende aktiviteter af præ-resectional RFA ikke begrænset til en bestemt histologisk tumortype.

Et kendetegn for adaptiv immunitet er udviklingen af ​​immunologisk hukommelse defineret ved evnen af ​​tidligere eksponering for tumorantigener at udløse en huske respons ved re-eksponering. Derfor undersøgte vi, om mus, der overlevede efter kombineret RFA og resektion af CT26 tumorer udviklet antitumor-reaktivitet ved genbelastning langtidsoverlevende (dvs. 150 dage efter primær tumor implantation) med s.c. CT26 tumor i den kontralaterale flanke. Aldersmatchede, ubehandlet ikke-tumor (NT) -experienced naive mus blev anvendt som kontroller. Som vist i figur 1E, blev en betydelig forsinkelse i udvækst af CT26 tumor observeret i genoptage behandlingen mus, der tidligere var blevet behandlet med RFA efterfulgt af kirurgisk excision. Tilsammen disse data er i overensstemmelse med udviklingen af ​​et adaptivt immunrespons efter pre-resectional RFA som reducerer lokalt recidiv og forbedrer overlevelsen ved at fremme langvarig, systemisk immunitet.

Survival gavn af præ-resectional RFA afhænger på adaptiv immunitet

for at formelt undersøge, om RFA aktivering af en tumor-specifik adaptive immunrespons forud for kirurgisk excision er kausal at begrænse tumorvækst vi undersøgt virkningerne af denne kombinerede terapeutiske regime på CT26 tumor progression i svær kombineret immundefekt (SCID) mus, der mangler funktionelle T-celler og B-celler (fig 2A). Overlevelse blev anvendt som det primære endepunkt til bestemmelse virkningsfuldhed eftersom analyse af primær tumorvolumen ikke var informativ i immundefekte mus, som ofte bukket under for dissemineret sygdom (dvs. i peritoneum), uanset primær tumorstørrelse eller typen af ​​terapi. I skarp kontrast til forøget overlevelse observeret i immunkompetente mus (Fig 1D), vi kunne ikke påvise nogen overlevelsesfordel i SCID mus behandlet med kombineret RFA og resektion sammenlignet med enten alene behandling (Fig 2B). Denne afhængighed af adaptive immunrespons giver yderligere bevis for, at fordelen af ​​præ-resectional RFA ikke alene kan forklares på grundlag af de cytoreduktive virkninger af termisk ablation.

(A) Tidsplan skitserer behandlingsgrupper. SCID-mus (5 mus /gruppe) blev implanteret s.c. med 10

6 CT26 celler i venstre på dag 0. Behandling grupper incuded fingeret operation, resektion (Rxn) eller RFA på dagen 10 eller 17. (B) Overlevelseskurver er repræsentative for to uafhængige forsøg; ns, ikke signifikant som bestemt ved Kaplan-Meier analyse.

Pre-resectional RFA forøger cirkulerende Th1 /CD8

+ T-celle-rettet cytokiner og forholdet mellem CD8

+ T-celler til regulatoriske T-celler i tumormikromiljøet

at få indsigt i den rolle, immunresponset i mediering antitumoraktiviteten af ​​præ-resectional RFA vi vurderet cirkulerende immun cytokinniveauer efter indgivelse af RFA i CT26 tumorer. Vi fandt en tendens til en stigning i cirkulerende koncentrationer af det prototypiske Th1 /CD8

+ T-celle-rettet cytokin IFN-γ så tidligt som 1 dag efter RFA sammenlignet med sham-behandlede mus og endnu stærkere IFN-γ-induktion var tydelig 7 dage efter RFA behandling (fig 3A). Disse data er i overensstemmelse med bidrag fra Th1 /CD8

+ T-celle-rettet cytokiner i generering af et systemisk antitumor immunrespons.

(A) IFN-γ profil i serum fra CT26 tumorbærende mus på 1 og 7 dage efter RFA behandling. *

P

0,02, sham versus RFA. (B) Repræsentative mikrofotografier af immunfarvet endogene CD8

+ T-celler og kvantificering af CD8

+ T-celle-infiltration i tumorvæv sektioner 7 dage efter fingeret kirurgi eller RFA. Scale bar, 100 pm. (C)

Venstre panel

, kvantificering af infiltrerende leukocytter i tumorer 7 dage efter behandling ved flowcytometri; CD8

+ T-celler (CD3

+ CD8

+), CD4

+ T-celler (CD3

+ CD4

+), regulatoriske T-celler (CD3

+ CD4

+ Foxp3

+ CD25

+ T

reg), myeloid-afledte suppressor celler (CD11b

+ Gr-1

+ F4 /80

-); M1 (CD11b

+ Gr-1

-F4 /80

+ CD206

loMHCII

hi) og M2 (CD11b

+ Gr-1

-F4 /80

+ CD206

hiMHCII

lo) makrofager. Data for 10

3 af total celler i tumor prøver.

Right panel

, forholdet mellem CD8

+ effektor T-celler (T

eff, L-selectin

lav CD44

hi): T

reg i tumorer bestemt af flow cytometri. (D)

Venstre panel

, kvantificering af totale leukocytter i milt fra tumorbærende mus ved 7 dage efter RFA behandling ved flowcytometri.

Right panel

, forholdet mellem CD8

+ effektor T-celler (T

eff, L-selectin

lav CD44

hi): T

reg i milten. Data (B-D) er repræsentative for ≥ 2 uafhængige forsøg (

n

= 3-5 mus pr gruppe); tumorvolumener varierede fra 1,100-1,700 mm

3) på tidspunktet for RFA behandling. *

P

0,05, fingeret versus RFA; ns, ikke signifikant.

Disse resultater, sammen med dokumentation for langvarig tumor kontrol efter kombineret RFA og kirurgi, førte os til at hypotesen, at den forbedrede lokale tumor kontrol kan indebære ændringer i andelen af ​​intratumoral T-celler delmængder, som ikke tidligere er blevet undersøgt efter RFA. Prækliniske studier i kaniner har rapporteret forøget intratumoral infiltration af CD3

+ T-celler i behandlede læsioner efter RFA selvom specifik CD4

+ eller CD8

+ T-celle delmængder blev ikke undersøgt [14, 27]. Kliniske studier har desuden vist en stigning i cirkulerende tumor-specifikke CD4

+ og CD8

+ T-celler i levercellecancer patienter (HCC) ved 4 uger efter RFA behandling [15]. Omvendt RFA sigende forårsager et fald i cirkulerende CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ immunosuppressive regulatoriske T-celler (T

reg) 30 dage efter behandling i patienter med lungecancer, som er bemærkelsesværdigt, da T

reg modvirke funktionen af ​​cytotoksiske CD8

+ effektor T-celler [6, 28]. Desuden har højt cirkulerende niveauer af suppressive immune celler, herunder T

reg eller myeloide afledte suppressorceller (MDSC) for nylig blevet vist at være prognostisk tumor tilbagefald efter RFA i ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) patienter og HCC patienter [29, 30]. Imidlertid har konsekvenserne af disse resultater forblev uklart, da udsving i cirkulerende immunceller er ikke nødvendigvis afspejler deres niveau af intratumoral lokalisering efter RFA.

For at bestemme om præ-resectional RFA påvirket intratumoral infiltration af specifikke immuncelleundergrupper på tidspunktet for kirurgisk excision, vi kvantificeret CD8

+ T-celler 7 dage efter ablation i reseceret CT26 tumorer samt i milten som et eksempel på en perifer lymfoidt organ, der er en side af immunaktivering. Immunhistokemisk analyse viste minimal baseline intratumoral infiltration af endogene CD8

+ T-celler i sham-behandlede mus (Fig 3B), i overensstemmelse med rapporter fra vores gruppe, og andre, at CT26 tumorer ikke er eftergivende til intensiv T-celle akkumulation [21, 22 , 31]. Imidlertid blev en markant stigning i intratumoral CD8

+ T-celle infiltration detekteret efter RFA behandling sammenlignet med sham kontroller (Fig 3B). Flowcytometrisk analyse viste også, at infiltrering af CD8

+ T-celler i forhold til den samlede intratumoral cellepopulation var signifikant forbedret 7 dage efter RFA henviser den relative massefylde af den samlede CD4

+ T-celler eller CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T

reg delmængde forblev uændret (figur 3C)

Vi undersøgte effekten af ​​RFA på CD8

+ T-celle:. T

reg nøgletal inden tumorer da dette er efter sigende en stærk prognostisk indikator for et positivt resultat i metastatisk kolorektal cancer [32]. RFA viste sig at øge den samlede andel af CD8

+ effektor (L-selectin

lav CD44

hi) T-celle: T

reg inden RFA behandlede tumorer (Fig 3C). En betydelig stigning i CD8

+ T-celle: Treg-forholdet blev også observeret i milten 7 dage efter RFA (figur 3D); men dette mere gunstigt forhold var en følge af et samlet fald i andelen af ​​T

reg i milten rum og ikke en stigning i CD8

+ T-celler som blev observeret i tumormikromiljøet (Fig 3C). Nedsat T

reg i milten potentielt kunne afspejle den reducerede tumorbelastning, at resultaterne fra ablation terapi. Den relative massefylde af myeloide celler, der udtrykker fænotypiske markører for CD11

+ Gr1

+ MDSC, CD11b

+ Gr-1

-F4 /80

+ CD206

loMHCII

hi M1 makrofager eller CD11b

+ Gr-1

-F4 /80

+ CD206

hiMHCII

lo M2 makrofager delmængder uændret ved RFA behandling enten inden tumorer eller milten. (Fig 3C og 3D). Kollektivt antyder disse resultater, at RFA-inducerer ændringer i immunsystemet contexture begunstige Th1 /CD8

+ T-celleaktivering i tumormikromiljøet og perifere lymfoide organer bidrager til forbedret lokal og systemisk tumor kontrol efter kirurgisk resektion.

Antigen-afhængig ekspansion af CD8

+ T-celler forekommer i tumor-drænende lymfeknuder og tumormikromiljøet efter forud resectional RFA

Vi ræsonnerede, at stigningen i CD8

+ effektor T-celler påvist i tumorer efter RFA kan skyldes dannelsen af ​​en antigenspecifik adaptiv immunreaktion, som tidligere rapporteret [11, 14, 15], eller alternativt fra en stigning i ikke-antigen-begrænset lokalisering på grund af den akutte inflammation, som indledes efter den katastrofale celledød forårsaget af termisk ablation. For at skelne mellem disse muligheder blev musene implanteret s.c. med murint CT26 colon adenocarcinom manipuleret til at udtrykke et surrogat tumor-associerede antigen, hæmagglutinin (CT26-HA), så vi kan overvåge tumor-antigen (HA) -specifik CD8

+ T-celle respons. En anden gruppe mus blev implanteret med den parentale CT26 tumor linje mangler HA-antigen. *

P

0,001; *

P

0,001; svulst.