PLoS ONE: Vurdering af kemosensibiliserende Aktivitet af TAT-RasGAP317-326 i barndommen Cancers

Abstrakt

Selvom de nuværende anti-cancer protokoller er rimeligt effektive, behandling-associerede langsigtede bivirkninger, fremkaldt af mangel på specificitet procedurerne for anti-cancer, er fortsat et udfordrende problem i pædiatrisk onkologi. TAT-RasGAP

317-326 er en RasGAP-afledt celle-permeable peptid, der fungerer som en sensibilisator til forskellige anti-cancer behandlinger hos voksne tumorceller. I den foreliggende undersøgelse vurderede vi virkningen af ​​TAT-RasGAP

317-326 i flere barndommen cancercellelinier. RasGAP peptid-induceret celledød blev analyseret i flere neuroblastom, Ewings sarkom og leukæmi-cellelinier (såvel som i normale lymfocytter). Celledød blev vurderet ved anvendelse af flowcytometri fremgangsmåder i fravær eller i nærvær af peptidet i kombination med forskellige genotoxins anvendes i klinikker (4-hydroperoxycyclophosphamid, etoposid, vincristin og doxorubicin). Alle testede pædiatriske tumorer, som reaktion på mindst en genotoxin, blev sensibiliseret TAT-RasGAP

317-326. RasGAP peptid forøgede ikke celledød af normale lymfocytter, alene eller i kombination med de fleste af de testede kemoterapier. Derfor TAT-RasGAP

317-326 kan gavne børn med tumorer ved at øge effektiviteten af ​​anti-cancer behandlinger, navnlig ved at tillade reduktioner i anti-cancer medicin dosering og de tilknyttede lægemiddelinducerede bivirkninger.

Henvisning: Chevalier N, Gross N, Widmann C (2015) Vurdering af kemosensibiliserende Aktivitet af TAT-RasGAP

317-326 i barndommen kræftformer. PLoS ONE 10 (3): e0120487. doi: 10,1371 /journal.pone.0120487

Academic Redaktør: Salvatore Papa, Institut for Hepatology – Birkbeck, University of London, England

Modtaget: Oktober 3, 2014 Accepteret: 23 januar 2015; Udgivet: Marts 31, 2015

Copyright: © 2015 Chevalier et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Data vedrørende de CGH array-profiler af de NB1 neuroblastom afledt-cellelinjer blev opnået fra en tredjepart: Dr. Aurélie Coulon ([email protected]) fra Pædiatrisk Oncology Research Unit, University Hospital center (CHUV), Lausanne, Schweiz) hvor læserne kan sende anmodninger om data

Finansiering:. Finansiering fra FORCE fundament – https://www.force-fondation.ch/(NC NG); MD-ph.d.-stipendium fra den schweiziske National Science Foundation (n ° 158.116) (NC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft repræsenterer den anden dødsårsag hos børn efter ulykker i de industrialiserede lande [1, 2]. Vores forståelse af barndommen kræftformer har nydt godt af betydelige fremskridt i løbet af de fire sidste årtier. Standard behandlinger til at helbrede pædiatrisk tumor omfatter kirurgi, strålebehandling og intensiv multi-agent kemoterapi, såsom etoposid, vincristin, doxorubicin, og cyclophosphamid [3].

I de udviklede lande, firs procent af børn, der er diagnosticeret med kræft forventes at overleve inden for 5 år efter behandlingen. Imidlertid vil de fleste af dem lider af kroniske sygdomme med 40 år [4]. Udvidet overvågning af pædiatriske kræft overlevende viser en høj risiko for livstruende senfølger fra sekundære maligniteter, hjertesygdomme og lungesygdomme [5, 6]. Risikoen for tidlig mortalitet er for det meste bestemt af behandlingsrelaterede faktorer såsom den kumulative dosis kemoterapi [7]. Derfor behandlingsrelaterede associeret langsigtede bivirkninger forårsaget af skade på ikke-tumorceller er et udfordrende problem, og stort set uløste. Da børn er per definition langsigtede overlevende, er der et stærkt behov for at udvikle lav toksicitet, mere målrettet og effektiv nye terapeutiske strategier for alle typer af kræft hos børn [8]. Der kan omgå sådanne hindringer omfatte forbedring af anticancerlægemiddel følsomhed og specificitet over for cancerceller [9-11].

I den forbindelse vi tidligere rapporteret, at en celle-permeable peptid afledt fra p120 RasGAP protein , kaldet TAT-RasGAP

317-326, er en tumor-sensibilisator til forskellige anti-cancer medicin. Selv om det ikke viser nogen toksicitet over for celler på egen hånd, er det effektivt og specifikt sensibiliserer voksne tumorceller

in vitro

in vivo

til forskellige anti-cancer behandlinger, herunder kemoterapi [ ,,,0],12,13], og fotodynamisk terapi [14]. Vigtigere, det viser specificitet for cancerceller, da det ikke sensibilisere ikke-tumorceller til genotoxin-induceret apoptose [12, 14]. TAT-RasGAP

317-326 synes at have yderligere anti-cancer aktiviteter end tumorceller sensibilisering som det har været for nylig vist, at dette peptid kan hæmme celle migration og invasion

in vitro

[15, 16], og at denne aktivitet kan hæmme metastatization proces

in vivo

[17]. Dette indikerer, at RasGAP peptid har evnen til at fungere som en anti-metastatisk forbindelse på toppen af ​​sine tumor overfølsomhedsreaktioner. For nylig er det blevet vist, at anti-cancer egenskaber af TAT-RasGAP

317-326 er afhængige af to tryptophanrester i position 317 og 319 [16]. Imidlertid er virkningsmekanisme TAT-RasGAP

317-326 ikke fuldt karakteriseret. Det er tidligere blevet vist, at dette peptid ikke begunstiger død af tumorceller ved at modulere Ras aktivitet, MAPK signalveje, NF-KB transkriptionel aktivitet, Akt proteinniveauer og phosphorylering status [18, 19]. Desuden er Bcl-2-familiemedlemmer, som regulerer mitokondrie-afhængig celledød, blev vist at være individuelt undværlig for sensibiliserende aktivitet af peptidet [20].

Virkningen af ​​dette peptid i barndommen kræft er imidlertid ikke kendt. Molekylærbiologi pædiatriske tumorer er forskellig fra cancere hos voksne på mange måder. Som tilblivelsen af ​​de fleste barndom kræftformer synes at komme fra forstyrrelser af normal tidlig udvikling, de ophobes færre mutationer end voksne tumorer. På den anden side fremgår det, at udviklingen af ​​pædiatriske tumorer er stærkt afhængige epigenetiske ændringer [21-23]. I den foreliggende undersøgelse, har vi derfor undersøgt, om TAT-RasGAP var

317-326 i stand til at gengive barndom tumorer mere følsomme over for klinisk relevante anti-tumor narkotika.

Metoder

Cellelinjer og dyrkning af celler Salg

CCRF-CEM [24], THP-1 [25] og A673 [26] cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) (referencer CRL-8436, TIB-202 , CRL-1598 henholdsvis). LAN-1 [27] og M-07E [28] cellelinjer blev opnået fra Leibniz Institute DSMZ-tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (referencer ACC655 henholdsvis ACC104). EW-11 [29], TC252 [30] og NB1-afledte [31] cellelinjer blev beskrevet tidligere. Alle cellelinier blev dyrket i 5% CO

2 ved 37 ° C. De neuroblastomcellelinier (LAN-1, NB1-FBS, NB1-FBS-Re) og EW-11 Ewing sarkom-cellelinjen blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) (Gibco, Paisley, UK) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco). De NB1-NBM neuroblastom primære tumorceller blev holdt i neurale basisk medium lavet af DMEM /F12 (Gibco) suppleret med 2% B27 serumfrit supplement (Invitrogen, Carlsbad, CA), 20 ng /ml human rekombinant basisk fibroblast vækstfaktor ( bFGF) (Peprotech), og 20 ng /ml human rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF) (Peprotech). The CCRF-CEM og THP-1 akutte leukæmi-cellelinier, og A673 og TC252 Ewing sarkom-celler, blev dyrket i RPMI 1640 (Gibco) indeholdende 10% FBS. M07e, en akut myeloid leukæmi-cellelinje, blev opretholdt i Minimum Essential Medium alpha (MEMα) (Gibco) suppleret med 10% FBS og 5 ng /ml rekombinant human granulocyt makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) (Peprotech). Humane lymfocytter fra perifert blod (PBL’er) blev isoleret ved densitetscentrifugering over en Ficoll-Paque gradient (Lymphoprep, StemCell Technologies) fra buffy coats fra raske donorer, opnået fra staten Vaud blodtransfusion service. Donorerne gav skriftligt samtykke til potentiel anvendelse af deres blod til medicinsk forskning. PBL’er blev dyrket i RPMI 1640 (Gibco) suppleret med 8% af samlet humant serum og suppleret med 100 U /ml rekombinant human interleukin-2 (Proleukin, Roche Pharma AG).

Kemikalier Salg

de lægemidler, der anvendes var vincristin (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), etoposid (Sigma-Aldrich), 4-hydroperoxycyclophosphamid (4-HC) (Niomech, Bielefeld, Tyskland) og doxorubicin (Pfizer AG, Zürich, Schweiz). Farvningen anvendes til at udføre flowcytometri var 7-aminoactinomycin D (7-AAD) og Annexin V-FITC (Annexin V-FITC /7-AAD kit, Beckman Coulter, Miami, USA).

Peptidsyntese

TAT-RasGAP

317-326 (GRKKRRQRRRGGWMWVTNLRTD), TAT

48-57 (fra nu af benævnt TAT) (GRKKRRQRRR), TAT-Scrambled (GRKKRRQRRRGGWLDMTTVNRW) og TAT-muterede (GRKKRRQRRRGGAMWVTNLRTD ) blev syntetiseret ved Institut for Biokemi, University of Lausanne, Schweiz som tidligere beskrevet [12].

Cytotoksisk assay

for celler, der vokser i suspension (THP-1, M07e, CCRF-CEM og lymfocytter), tre hundrede tusinde celler blev podet i plader med 6 brønde og gælder behandlet med de angivne doser af 4-HC, etoposid, vincristin eller doxorubicin i nærværelse eller i fravær af 10 uM TAT-RasGAP

317-326, TAT, TAT-Scrambled eller TAT-muteret. For vedhængende cellelinier (NB1-NBM, NB1-FBS, NB1-FBS-Re, LAN-1, EW-11, TC252, og A673) blev to hundrede tusinde celler lov til at klæbe i 48 timer i 6-brønds plader og blev derefter behandlet som celler, der vokser i suspension. Fireogtyve timer efter lægemiddeladministration inkubation blev cellerne underkastet flowcytometri for at evaluere celledød. Kort fortalt blev adhærente cellelinier løsgøres ved trypsin-EDTA (Gibco) og encellede suspensioner blev behandlet og farvet med 1 pg /ml 7-AAD og 50 ng /ml Annexin V-FITC i 500 pi bindingsbuffer. Mindst ti tusinde celler blev analyseret. 7-AAD dye-afledte signal kunne ikke anvendes, når celler blev behandlet med doxorubicin, fordi 7-AAD og doxorubicin har lignende fluorescerende egenskaber (7-AAD emissionsbølgelængde: 525 nm; doxorubicin emissionsbølgelængde: 530 nm [32]).

Statistisk analyse

Med mindre andet er nævnt, er alle forsøg blev afledt fra tre eller flere uafhængige forsøg. Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± 95% konfidensintervaller. Signifikans blev vurderet ved hjælp t-test udført med Microsoft Excel 2010 efterfulgt af Bonferroni-metode (dvs. forskelle blev betragtet som signifikante, når p-værdier 0,05 /n, hvor n er antallet af sammenligninger). Asterisker repræsenterer statistisk signifikante forskelle. I det sidste tal, blev signifikans vurderet ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni (Dunn) t post-hoc tests med SAS 9.2 software (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

Resultater

I denne undersøgelse blev analyseret tre typer af kræft hos børn: neuroblastom, leukæmi, og Ewing sarkom. Blandt barndommen maligniteter, neuroblastom er den hyppigste extrakraniel solid cancer. Dødsfald som følge af neuroblastom tegner sig for 15% af al tumor dødsfald hos børn [33]. Multiresistens, erhvervet under eksponering for kemoterapi, spiller en stor rolle i denne dårligt resultat [34, 35]. Leukæmi er den mest almindelige børnekræft type og udgør en tredjedel af alle pædiatriske tumorer [36]. Selv mindre udbredt end leukæmi, Ewing sarkom er en aggressiv cancer med en dårlig prognose og en høj tilbagefald med metastatisk sygdom [37]. De lægemidler, der anvendes her, er alle brugte i klinikkerne. Deres egenskaber er vist i tabel 1.

TAT-RasGAP

317-326 sensibiliserer akut lymfoblastisk og myeloide leukæmiceller til forskellige kemoterapeutiske midler uden at vise nogen virkning mod tumorceller i sig selv

for at undersøge sensibilisering effekt af TAT-RasGAP

317-326 i leukæmiceller blev tre forskellige cellelinier udsættes for stigende koncentrationer af cytostatiske midler i fravær eller i nærvær af 10 uM TAT-RasGAP

317 -326. Etoposid, vincristin, doxorubicin og 4-hydroperoxycyclophosphamid (4-HC), den aktive form af cyclophosphamid, var de lægemidler, der anvendes her, og er hver for øjeblikket anvendes i klinikken. Celledød blev vurderet under anvendelse af 7-AAD, som mærker døde celler, der er permeabiliseret plasmamembranen og med Annexin V, som binder til phosphatidylserin eksponeret på døde celler. Nogle af de anti-cancer lægemidler, der anvendes her inducerede en samtidig forekomst af de 7-AAD og Annexin V-signaler (Fig 1A viser repræsentative tilfælde af 4-HC). Med andre ord, så snart en celle blev Annexin V-positive det også hentede 7-AAD farvestof. Derfor, i vores hænder, anti-cancer stoffer som 4-HC inducerede en nekrose-lignende type døden. I de næste figurer er 7-AAD data rapporteret som vi fandt dem at være forbundet med en lavere varians end dem, der opnås med Annexin V-farvning (Fig 1B). Den eneste undtagelse var, da doxorubicin blev anvendt. Faktisk dette farvestof fluorescerer ved lignende bølgelængder som 7-ADD. I dette tilfælde derfor er de Annexin V data præsenteret. Disse forsøg viste, at TAT-RasGAP

317-326 signifikant sensibiliserer leukæmiceller til næsten alle testede lægemidler (Fig 2A). I visse betingelser (for eksempel når THP-1 celler behandles med vincristin) tumorceller ikke reagerer godt på TAT-RasGAP

317-326. Et begrænset sensibilisering effekt af RasGAP peptid er ikke nødvendigvis en konsekvens af indre resistens over for et lægemiddel som CCRF-CEM-cellelinie, som er vincristin-resistente, blev effektivt sensibiliseret ved TAT-RasGAP

317-326. Dette punkt er af særlig klinisk betydning, da det indikerer, at TAT-RasGAP

317-326 kan udøve en overfølsomhed effekt i kemo-resistente celler.

A. Tre hundrede tusinde CCRF-CEM-celler blev podet i plader med 6 brønde og gælder behandlet med 50 pM 4-HC. Celledød blev evalueret efter adskillige tidspunkter (0, 3, 6, 12 og 24 timer) under anvendelse af 7-AAD og Annexin V-FITC-farvning. B. CCRF-CEM-celler blev podet i plader med 6 brønde og gælder behandlet med de angivne doser af 4-HC, etoposid eller vincristin i nærværelse eller i fravær af 10 uM TAT-RasGAP

317-326. Efter 24 timers lægemiddel inkubation 7-AAD og Annexin V-FITC-farvning blev udført for at vurdere celledød. 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamid.

A. To akut myeloid leukæmi-cellelinier (THP-1 og M-07E) og en T akut lymfoblastisk leukæmi cellelinje (CCRF-CEM) blev podet i plader med 6 brønde og gælder behandlet med 4-HC, etoposid, vincristin eller doxorubicin på angivne koncentrationer i tilstedeværelse eller i fravær af 10 uM TAT-RasGAP

317-326. Efter 24 timers lægemiddel inkubation 7-AAD eller Annexin V-FITC-farvning blev udført for at vurdere celledød (sidste fire søjler). Alternativt (første kolonne), blev cellerne behandlet med stigende koncentrationer af TAT eller TAT-RasGAP

317-326 alene. Efter 24 timer blev evalueringen af ​​celledød udføres under anvendelse af 7-AAD-farvning. B. Isolerede lymfocytter fra tre forskellige raske forsøgspersoner blev behandlet som beskrevet i fig. 2A. Doseringerne af kemoterapeutiske midler anvendt til behandling af raske lymfocytter fra de tre emner er de samme som anvendes til behandling af T-ALL CCRF-CEM-celler. Bemærk, at graferne er afledt fra enkelte forsøg, hvor lymfocytter er straks anvendes efter deres isolation (hvis dyrkes

in vitro

, de ville opleve høje niveauer af spontan apoptose, der ville forhindre nøjagtig måling af anti-cancer narkotikarelaterede og peptid -inducerede død). T-ALL, T-akut lymfoblastisk leukæmi; AML, akut myeloid leukæmi; 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamid. * P. 0,05 t-test efter Bonferroni korrektion

TAT-RasGAP

317-326 af sig selv ikke inducere celledød i de testede leukæmi-cellelinjer, selv på en to-gange højere koncentration (20 uM) end den, der anvendes til at inducere en sensibilisering virkning (10 uM) (fig 2A).

TAT-RasGAP

317-326 viser ikke toksicitet over for ikke-tumor-lymfocytter fra raske forsøgspersoner .

Det blev tidligere vist ved anvendelse af ikke-tumor immortaliserede humane keratinocytter (HaCaT) og umbilical vaskulære endotel (HUV-EC-C) celler, som TAT-RasGAP

317-326, i kombination med forskellige genotoxins, ikke sensibiliserer ikke-tumorceller [12]. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi isolerede lymfocytter fra fuldblod af raske patienter til at undersøge selektiviteten af ​​RasGAP peptid mod cancerceller. Vi anvendte de samme doser af kemoterapeutiske midler til behandling af raske lymfocytter som dem anvendes til behandling af CCRF-CEM T-akut lymfoblastisk leukæmi (T-ALL) cellelinje (figur 2A). Fig 2B viser responset af blod lymfocytter (PBL’er) perifere afledt fra tre forskellige raske forsøgspersoner (fag A-C) til RasGAP peptid i kombination eller ikke med de genotoxins anvendes i fig 2A. Den RasGAP-afledt peptid i sig selv ikke vise nogen toksicitet mod PBL’er. Følsomheden af ​​de ikke-tumor-lymfocytter for de testede kemoterapier alene svarede til følsomheden af ​​CCRF-CEM-cellelinien (endda lidt forøget i tilfælde af doxorubicin for de raske A og C). Den iagttagelse, at cancer og normale lymfocytter blev ligeledes følsomme over for genotoxins eller anden måde var overraskende, fordi rationalet at benytte en bestemt kemoterapi er, at det vil målrette fortrinsvis de maligne celler. Ikke desto mindre er de vigtige oplysninger hentet fra figur 2B er, at TAT-RasGAP

317-326 ikke bevidstgøre PBL at etoposide-, vincristine- og doxorubicin-medieret død. Peptidet dog har nogle gange bevidstgøre PBL til 4-HC (Fig 2B), hvilket tyder på, at TAT-RasGAP

317-326 kan påvirke levedygtigheden af ​​normale celler i nogle behandlingskombinationer.

TAT-RasGAP

317-326 kan potensere genotoxin-induceret celledød i Ewing sarkom

for at udvide undersøgelsen på TAT-RasGAP

317-326 i ikke-leukæmi børnekræft, effekten af ​​TAT-RasGAP

317-326 blev også testet i Ewing sarkom-celler. Resultaterne viser, at RasGAP peptid er også i stand til at sensibilisere disse celler til forskellige genotoxins, omend i mindre grad end i leukæmier (figur 3). I nogle tilfælde blev der ikke sensibilisering observeret (for eksempel når vincristin blev anvendt i A673 og TC252 cellelinier). Også her TAT-RasGAP

317-326 alene ikke vise nogen toksicitet mod Ewing sarkom celler (Fig 3).

Tre Ewing sarkom cellelinier (EW-11, A673 og TC252) blev udsået i 6-brønds plader og efter 24 timer blev behandlet med 4-HC, etoposid, vincristin eller doxorubicin i de angivne koncentrationer i nærvær eller i fravær af 10 uM TAT-RasGAP

317-326. En dag senere blev celledød evalueret. 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamid. * P. 0,05 t-test efter Bonferroni korrektion

De NB1 neuroblastom afledt-cellelinjer direkte dræbt af TAT-RasGAP

317-326

Erhvervet kemoresistens er en vigtig årsag til svigt af behandling af neuroblastom. For at vurdere effekten af ​​TAT-RasGAP

317-326 i celler, der blev udsat for høje doser af kemoterapi og derfor potentielt har erhvervet resistens over for disse cytostatika, udvalgte vi primære tumorceller af en enkelt patient på forskellige stadier af sygdom. De NB1 celler er høj risiko fase 4 primære neuroblastomceller afledt af knoglemarv prøver, der blev fastlagt ved den indledende diagnose (NB1-NBM og NB1-FBS) og ved efterfølgende tilbagefald efter multi-agent kemoterapi (NB1-FBS-Re) (Fig 4A ). NB1-FBS og NB1-FBS-Re cellelinjer blev dyrket i 10% føtalt bovint serum (FBS) -holdige DMEM-medium, mens NB1-NBM-celler blev etableret i neurale basisk medium (NBM). NBM er en stamcelle eftergivende serum-frit, bFGF-, EGF- og B27-suppleret medium til at understøtte væksten af ​​neurale crest celler, væv oprindelseslandet for neuroblastom [38, 39].

A. Den lysegrå tykke pil på toppen af ​​figuren repræsenterer behandlingsplanen administreres til patienten, fra hvem de tre NB1-afledte cellelinier blev etableret. De NB1 cellerne stammer fra primære høje risiko neuroblastom knoglemarv prøver. NB1-NBM og NB1-FBS blev etableret ved første diagnosticering og dyrket i NBM og DMEM medier, hhv. NB1-NBM-Re blev etableret på et efterfølgende tilbagefald og dyrket i DMEM. De tre NB1-afledte cellelinier blev behandlet som beskrevet i fig 3. B. LAN-1-cellelinien er afledt fra en høj risiko neuroblastom. LAN-1 celler blev behandlet som beskrevet i figur 3. M, måned; BM, knoglemarv; 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamid. * P. 0,05 t-test efter Bonferroni korrektion

Fig 4A viser, at NB1-NBM og NB1-FBS cellelinjer ikke vise den samme følsomhed mod de testede kemoterapier. Endvidere til effektiviteten af ​​TAT-RasGAP

317-326 forbedre aflivning effektiviteten af ​​4-HC varierer mellem disse to cellelinier: De NB1-FBS celler viste sig at være meget følsomme over for sensibilisering virkning af peptidet, mens de NB1-NBM celler blev ikke påvirket af tilstedeværelsen af ​​TAT-RasGAP

317-326. Som den eneste forskel mellem de NB1-NBM og NB1-FBS cellelinier er det medium, hvori de dyrkes, kunne man hypotesen, at metabolismen af ​​NB1 celler varierer fra kultur tilstand til den anden, og at dette differentielt modulerer følsomhed tumorcellerne til TAT-RasGAP

317-326.

for at undersøge, om overfølsomhed effekt af TAT-RasGAP stadig var

317-326 effektiv på recidiverende neuroblastomceller, vi sammenlignet dens effektivitet mellem NB1-FBS celler og NB1-FBS-Re celler. Begge cellelinier dyrkes i det samme dyrkningsmedium. Behandlingsplanen, der blev anvendt til at behandle patienten er illustreret i fig 4A. Patienten, de tilbagefald celler som blev afledt, blev udsat for de fire lægemidler (4-HC, etoposid, vincristin og doxorubicin) testet i denne undersøgelse. Men bortset fra de 4-HC-behandlede betingelser, hvor vi kan iagttage en svag modstand mod dette stof i NB1-FBS-Re celler, de tilbagefald celler ikke mere modstandsdygtige over for etoposid, vincristin og doxorubicin end de celler afledt fra første diagnose (fig 4A). Tværtimod NB1-FBS-Re celler viser en forøget følsomhed over for doxorubicin sammenlignet med NB1-FBS celler. Alligevel TAT-RasGAP

317-326 sensibiliserer de tre primære NB1-afledte cellelinier, men i forskelligt niveau af effekt ifølge det cellelinien og testet kemoterapi (Fig 4A).

I de fleste tilfælde har TAT-RasGAP

317-326 fremprovokere tumor celledød af sig selv. Vi fandt imidlertid, at de tre NB1 afledt-cellelinier kan direkte dræbt af RasGAP peptid (Fig 4A). Den er nødvendig for at inducere celledød (20 uM) dosis er imidlertid højere end den dosis, der anvendes til at bevidstgøre, at cellerne genotoxins (10 uM).

For at afslutte undersøgelsen af ​​effekten af ​​TAT-RasGAP

317 -326 i neuroblastom tumortype, testede vi også peptidet på LAN-1, et andet neuroblastoma cellelinie afledt fra en aggressiv trin 4 neuroblastom. Fig 4B viser, at RasGAP peptid viser en svag sensibilisering virkning mod denne cellelinie. I modsætning til de NB1 afledt-cellelinjer, TAT-RasGAP

317-326 alene var ikke i stand til at dræbe LAN-1-celler (Fig 4B), hvilket betyder, at TAT-RasGAP

317-326-induceret celledød er ikke en specificitet deles af alle neuroblastomaer.

den sensibiliserende aktivitet af TAT-RasGAP

317-326 bæres af RasGAP-afledte sekvens

for at vurdere specificiteten af ​​kemo-sensibiliserende aktivitet TAT-RasGAP

317-326, blev tre forskellige kontrol-peptider testet: et peptid sammensat af TAT-sekvensen kun (TAT), et peptid, hvori RasGAP sekvensen var krypteret (TAT-scrambled), og et peptid, hvori første tryptophan af RasGAP sekvensen blev erstattet i en alaninrest (TAT-muteret). Denne tryptofan blev for nylig vist sig at være afgørende for sensibiliserende aktivitet af TAT-RasGAP

317-326 i voksne tumorer [16]. Virkningen af ​​TAT-RasGAP

317-326 og de tre kontrol- peptiderne blev testet i CCRF-CEM-celler i kombination med forskellige anti-cancer-lægemidler ved doser, der tillod den største sensibilisering aktivitet, der skal påvises. CCRF-CEM-celler blev anvendt, fordi denne leukæmicellelinie var den ene mest effektivt sensibiliseret ved RasGAP peptid. Fig 5A viser, at alle tre kontrolpunkter peptider havde en tendens til let favorisere død CCRF-CEM-celler, når det kombineres med de forskellige anti-cancer-lægemidler, men i de fleste tilfælde ikke nåede statistisk signifikans. I modsætning hertil TAT-RasGAP

317-326 markant, og altid væsentligt, lysfølsomme disse celler til narkotika. Den lette sensibilisering virkning af kontrol- peptiderne er mest sandsynligt på grund af den cellepenetrerende aktivitet af TAT-delen, som har potentiale til at indvirke negativt på cellulær homeostase [40]. Lignende resultater blev opnået, når anvendtes den TC252 Ewing sarkom-cellelinjen og NB1-FBS neuroblastomcellelinje: TAT-RasGAP

317-326 øget deres følsomhed over for 4-HC, mens de tre kontrolpunkter peptiderne ikke, eller kun minimalt (fig 5B og 5C). Disse data indikerer, at tumoren sensibiliserende aktivitet af TAT-RasGAP

317-326 kun marginalt afhængig af sin evne til at trænge celler via TAT celle-permeable sekvens. Derfor kan det konkluderes, at den sensibiliserende aktivitet af TAT-RasGAP

317-326 hovedsageligt båret af RasGAP-afledte sekvens.

A. CCRF-CEM-celler blev podet i plader med 6 brønde og gælder behandlet med 10 pM TAT-RasGAP

317-326, TAT, TAT-Scrambled eller TAT-muteret i fravær eller i nærværelse af 4-HC, etoposid, vincristin eller doxorubicin i de angivne koncentrationer. Efter 24 timers lægemiddel inkubation 7-AAD eller Annexin V-FITC-farvning blev udført for at vurdere celledød. B-C. De TC252 (B) og NB1-FBS (C) cellelinier blev behandlet på lignende måde, men i kombination med kun 4-HC. P10, TAT-RasGAP

317-326; TAT-S, TAT-Scrambled; TAT-M, TAT-muteret; 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamid. Midler med det samme bogstav er ikke signifikant forskellige.

Diskussion

De aktuelt anvendte terapier til behandling af barndommen solide kræftformer, såsom neuroblastom og Ewing sarkom, nødt til at være mere effektiv og specifik at forbedre det kliniske resultat. Leukæmi har normalt en bedre 5-års overlevelse end pædiatriske solide tumorer, men de langsigtede virkninger af behandlingen fortsat være en vigtig årsag til sygelighed og dødelighed. Endvidere erhvervet resistens til de konventionelle behandlinger er ansvarlig for tilbagefald og dårligt resultat. Følgelig finde mindre toksiske og mere effektive terapeutiske midler til behandling af pædiatriske cancere er en nødvendighed for at mindske lægemiddelinducerede skadelige bivirkninger og den tilhørende dødelighed [3].

I den foreliggende undersøgelse vurderede vi virkningen af ​​TAT -RasGAP

317-326 i flere barndom kræft cellelinjer. Dette RasGAP-afledt peptid blev allerede kendt for at bevidstgøre voksen tumorceller

in vitro

og

in vivo

til forskellige anti-cancer behandlinger [12]. Vores resultater viser, at TAT-RasGAP

317-326 signifikant sensibiliserer barndommen cancerceller i de fleste af de testede betingelser. Men i nogle tilfælde, tumorceller ikke, eller minimalt, svare til peptidet. Den pædiatriske tumor-sensibiliserende virkning er illustreret i denne undersøgelse blev nået med halvdelen af ​​peptidkoncentrationen tidligere anvendt til at sensibilisere voksen cancerceller (10 uM TAT-RasGAP

317-326 i denne undersøgelse i stedet for 20 pM i papiret af Michod et al. [12]). Muligvis dosen af ​​TAT-RasGAP

317-326 kunne fordobles for at forøge sensibiliserende effekt af peptidet i de forhold, hvor det var mindre effektivt. Da primære tumorceller repræsenterer en mere klinisk relevant tilstand, vi også testet peptidet i primære neuroblastomceller stammende fra knoglemarv fra en enkelt patient (de tre NB1-afledte cellelinier viste i figur 4). Resultaterne viser, at RasGAP peptid sensibiliserer primære tumorceller, hvilket antyder, at det kunne udøve sin anti-cancer aktivitet på tumorer i en

in vivo

sammenhæng.

Virkningsmekanismen af ​​TAT -RasGAP

317-326 mangler at blive præcist bestemt [18-20]. Vi oprindeligt antaget, at arbejdet med et stort panel af cellelinjer og cytostatika ville tillade os at tegne et mønster, der kunne bruges til at forudsige, hvilken type barndom tumorer viser følsomhed over for TAT-RasGAP

317-326 som reaktion på en given medicin. Sådanne oplysninger ville være nyttigt at dechifrere virkningsmekanisme TAT-RasGAP

317-326. Til dette formål har vi undersøgt, hvordan den halvmaksimal inhiberende koncentration (IC

50) for hver kemoterapeutiske middel blev modificeret ved tilstedeværelsen af ​​TAT-RasGAP

317-326 for en given cellelinje (tabel 2). RasGAP peptid faldt IC

50 for de fleste genotoxins i de fleste cellelinjer. Dog kunne ingen specifik mønster baseret på tumor oprindelse eller stoftype udledes af de data, der præsenteres i tabel 2. Vi har også set, om der var nogle fælles specifikke mutationer i velkendte onkogener eller tumorsuppressorgener (f.eks HRAS, KRAS, nationale tilsynsmyndigheder, HDM2, N-myc, c-myc, TAL1, FLI-1, MLL, p53 og RB1) i de analyserede cellelinier. Igen kunne ingen sammenhæng findes mellem tilstedeværelsen af ​​specifikke mutationer i en cancercellelinie og dens evne til at blive sensibiliseret ved RasGAP-afledt peptid.

Et interessant aspekt af denne forskning er, at sensibiliseringen effekt af TAT-RasGAP

317-326 kan forskelligt moduleres af de celle dyrkningsbetingelser. Dette træk er illustreret ved det faktum, at NB1-FBS-celler, men ikke de NB1-NBM celler, er følsomme over for virkningen af ​​peptidet. Disse to cellelinjer afledt af den samme neuroblastom tumor ved første diagnosticering (se figur 4), men de var dyrket i forskellige medier. Disse to cellelinjer synes at have de samme genomiske forandringer. Faktisk de besidder identiske matrix-CGH profiler med de samme typiske neuroblastom-associeret segmenter chromosomic forandringer (upublicerede data). Så hvis disse to cellelinjer har identiske vifte-CGH-profiler, hvad der kunne forklare deres forskellige følsomhed over for TAT-RasGAP

317-326? En mulighed er, at det medium, hvori de dyrkes modulere deres stofskifte differentielt. Dette kan igen påvirke deres følsomhed over for anti-cancer behandlinger. Der er faktisk akkumulere beviser for, at den metaboliske tilstand af kræftceller spiller en vigtig rolle i den måde de reagerer på kræftmedicin [41]. En anden hypotese er, at forskellige cellepopulationer er udvalgt på passager i andet medium.