PLoS ONE: Effekter af Sulforaphane og 3,3′-diindolylmethane på Genome Wide Promotor Methylering i Normal prostata epitelceller og prostatakræft Cells

Abstrakt

Epigenetisk ændringer, herunder afvigende DNA methylering, resultere i ændrede gen udtryk og spiller en vigtig rolle i carcinogenese. Fytokemikalier såsom sulforaphane (SFN) og 3,3′-diindolylmethane (DIM) er lovende kemoforebyggende midler til behandling af prostatacancer. Begge har vist sig at inducere re-ekspression af gener, herunder tumorsuppressorgener stumme i cancerceller, via modulering af epigenetiske varemærker, der indeholder DNA-methylering. Men det forblev uklart virkningerne SFN og DIM på DNA methylering på en genomisk skala. Målet med denne undersøgelse var at bestemme de genom-dækkende virkninger af SFN og DIM på promotor-methylering i normale prostataceller epitelceller og prostatacancerceller. Både SFN og DIM behandling faldt DNA methyltransferase-ekspression i normale prostata-epitelceller (Prec), og androgenafhængige (LNCaP) og androgen-uafhængige (PC3) prostatacancerceller. Virkningerne af SFN og DIM på promoter methylering profiler i normal Prec, LNCaP og PC3 prostatacancerceller blev bestemt ved hjælp af methyl-DNA immunpræcipitering efterfulgt af genom-dækkende DNA methylering array. Vi viste udbredte ændringer i promotor methylering mønstre, herunder både øget og nedsat methylering, i alle tre prostata cellelinjer som reaktion på SFN eller DIM behandlinger. Navnlig SFN og DIM ændret promotor-methylering i forskellige sæt af gener i Prec, LNCaP, og PC3-celler, men delte lignende gen mål inden for et enkelt cellelinje. Vi viste desuden, at SFN og DIM vendt mange af cancer-associerede methylering forandringer, herunder afvigende methylerede gener, der er dysreguleret eller er stærkt involveret i kræft progression. Samlet set vores data foreslog, at både SFN og DIM er epigenetiske modulatorer, der har brede og komplekse effekter på DNA methylering profiler i både normale og ondartede prostata epitelceller. Resultater fra vores undersøgelse kan give ny indsigt i de epigenetiske mekanismer, som SFN og DIM udøver deres kræft kemoforebyggende virkninger

Henvisning:. Wong CP, Hsu A, Buchanan A, Palomera-Sanchez Z, Beaver LM, Houseman EA et al. (2014) Virkninger af Sulforaphane og 3,3′-diindolylmethane på Genome Wide Promotor Methylering i Normal prostata epitelceller og prostatacancerceller. PLoS ONE 9 (1): e86787. doi: 10,1371 /journal.pone.0086787

Redaktør: Bernard W. Futscher, The University of Arizona, USA

Modtaget: August 17, 2013; Accepteret: December 13, 2013; Udgivet: 22 Jan 2014

Copyright: © 2014 Wong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud CA90890, CA65525, CA122906, CA122959, CA80176, R01GM104977, og ved NIEHS center tilskud P30 ES00210. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epigenetisk er vigtige for at regulere og opretholde genekspressionsmønstre. Dysreguleret epigenetiske processer, herunder afvigende DNA-methylering, histon modifikation, og microRNA profiler, føre til ændret genekspression og funktion og spiller en vigtig rolle i carcinogenese. Især er omfattende ændringer i DNA-methylering mønstre observeret under kræft initiering og progression, kendetegnet ved global og site-specifik DNA hypometylering samt gen-specifik promotor hypermethylering [1], [2]. DNA hypometylering i cancer kan bidrage til genome ustabilitet og øget ekspression af onkogener. På den anden side kan DNA hypermethylering føre til silencing af tumorsuppressorgener, transkriptionsfaktorer samt gener involveret i cellecyklusregulering og apoptose. Etablering og vedligeholdelse af DNA methylering mønstre er medieret af DNA methyltransferaser (DNMTs) [3]. Overekspression af DNMTs er observeret i mange cancertyper, herunder leukæmi [4], pancreascancer [5], gastrisk cancer [6], lungecancer [7], og prostatacancer [8], og dysreguleret DNMT ekspression sandsynligvis er en af ​​de bidragende faktorer, der fører til afvigende DNA methyleringsmønstre under cancer progression. I modsætning til genetiske mutationer, epigenetiske ændringer er potentielt reversible og udgør et attraktivt og lovende mål for kræft kemoforebyggelse strategier. Mange epigenetiske lægemidler udviklet til at vende DNA methylering og histon modifikation afvigelser i kræft er i øjeblikket under efterforskning. Ud over farmakologiske midler, har et stigende antal essentielle mikronæringsstoffer og kosten fytokemikalier vist sig at virke som epigenetik modulatorer, og er attraktive kandidater til brug i epigenetisk terapi [9], [10]. Evne kostfaktorer at udøve epigenetiske effekter understreger den potentielle betydning af specifikke næringsstoffer og bioaktive fytokemikalier i epigenetiske regulering og kræft kemoforebyggelse strategier.

Prostatakræft er den næsthyppigste diagnosticeret kræft hos mænd i USA [11 ]. Kost er en modificerbare risikofaktor og kan påvirke modtageligheden for udvikling af prostatacancer. Prostatakræft risiko har vist sig at være omvendt korreleret med indtagelse af korsblomstrede grøntsager [12], [13]. Især sulforaphane (SFN) og 3,3′-diindolylmethane (DIM), har to fytokemikalier afledt af glucosinolater i korsblomstrede grøntsager blevet påvist at være effektive kemoforebyggende midler mod prostatacancer [14], [15]. SFN er et isothiocyanat afledt af hydrolyse af glucoraphanin, og DIM er en stor syre kondensationsprodukt af indol-3-carbinol (I3C), et hydrolyseprodukt af glucobrassicin. De anti-cancer effekter af både SFN og DIM er mangeartede: forskellige kemoforebyggende mekanismer, herunder induktion af Fase 2 enzymer, stigning i apoptose, induktion af cellecyklus arrest, og hæmning af celleproliferation. For nylig, stigende evidens for, at SFN og DIM også kan fungere som epigenetik modulatorer og udøve anti-cancer egenskaber ved at målrette epigenetiske mærker i prostata kræftceller. For eksempel kan SFN og DIM hæmmer histon deacetylase (HDAC) aktiviteter, ændre HDAC udtryk, og resultere i re-ekspressionen af ​​tumorsuppressorgener [16], [17]. Vi og andre har vist, at SFN kan inhibere DNMT ekspression og ændre DNA-methylering i prostata- og brystcancerceller, som repræsenterer en hidtil ukendt kemoforebyggelse mekanisme, hvormed SFN epigenetisk regulerer genekspression [18] – [20]. Den dobbelte virkninger af SFN på HDAC hæmning og DNA methylering gør det til et attraktivt kosten kemoforebyggelse agent. Imidlertid vides der kun lidt om virkningerne af SFN på andre afvigende methylerede genmål, og hvorvidt SFN har forskellige virkninger på DNA-methylering i normale og cancerøse prostataceller. Desuden er det fortsat skal bestemmes, hvis DIM tilsvarende kan udøve dobbelte epigenetiske effekter og modulere DNA-methylering i prostata kræftceller.

Denne aktuelle undersøgelse blev foretaget for at bestemme genom-dækkende virkninger af SFN og DIM på promotor methylering i normale prostataceller epitelceller og prostatacancerceller. Vi hypotesen, at både SFN og DIM er effektive kosten modulatorer af DNA methylering på grund af deres hæmmende effekt på DNMT udtryk. Vi hypotesen endvidere, at SFN og DIM kan forskelligt påvirke promoter methylering profiler i normale og ondartede prostata epitelceller, og omvendt afvigende methylerede gener i prostata kræftceller. Vores undersøgelse vil øge vores forståelse af methylering mål for SFN og DIM, og give indsigt i de epigenetiske mekanismer, som SFN og DIM udøver deres kræft kemoforebyggende virkninger.

Materialer og metoder

Cell Culture og behandlingsforhold

Normale humane prostata epitelceller (Prec) blev opnået fra Lonza (Allendale, NJ) og dyrket i Prec basale medier indeholdende PrEGM SingleQuot Kit kosttilskud og vækstfaktorer (Lonza, Allendale, NJ). Humane androgenafhængige prostatacancer epithelceller (LnCAP) og androgen-uafhængige prostatacancerceller epithelceller (PC3) blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i RPMI1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum. Alle celler blev dyrket i befugtet inkubator ved 5% CO

2 og 37 ° C. SFN (LKT Laboratories, St. Paul, MN) og DIM (Sigma, St. Louis, MO) blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO). Prec, LnCAP, og PC3-celler blev behandlet med vehikelkontrol (0,03% DMSO), 15 uM SFN, eller 15 uM DIM i biologiske triplikater til anvendelse i DNA-methylering arrays. Dosis behandling blev valgt til at afspejle fysiologisk relevante koncentrationer af SFN og DIM [21], [22]. Celler blev opsamlet ved 48 timer efter behandlinger til anvendelse i methylering assays eller chromatin Immunpræcipitation (chip) assays. Til genekspression-assays blev celler opsamlet ved 72 timer efter behandling. I grupper behandlet med DNA demethyleringsmiddel, 5-aza-2′-deoxycytidin (AZA), 5 uM AZA blev anvendt, og cellerne blev opsamlet ved 48 timer efter behandling.

Prøveforberedelse for methylering af DNA Array

Der blev indsendt i alt 27 prøver til DNA-methylering array analyse, herunder prøver fra hver af de tre cellelinjer behandlet med kontroller køretøjets (n = 3 pr cellelinje), DIM (n = 3 pr cellelinje), og SFN (n = 3 pr cellelinie). Genomisk DNA blev isoleret under anvendelse DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA). For genomisk DNA-fragmentering blev oprenset DNA fordøjet med Msel restriktionsenzym (New England Biolabs, Ipswich, MA) natten over ved 37 ° C til opnåelse af DNA-fragmenter mellem 200 til 1.000 bp. Methyleret DNA blev beriget anvendelse af methyl-DNA immunpræcipitering (MeDIP) ifølge producentens protokol (Roche NimbleGen, Madison, WI). MeDIP-beriget DNA samt input DNA blev amplificeret med GenomePlex Komplet Whole Genome Amplification kit (Sigma). Amplified MeDIP og input DNA-prøver blev forelagt Center for Genome Research Biocomputing core facilitet (Oregon State University, Corvallis, OR) for prøve mærkning, prøve hybridisering, og array scanning. Prøve hybridisering og array scanning blev udført under anvendelse NimbleGen Hybridisering System 4 (Roche) og Axon GenePix Pro 4200 A (Molecular Device, Sunnyvale, CA), henholdsvis.

DNA methylering Array Dataanalyse

NimbleGen humant DNA-methylering 3 × 720 K CpG Island Plus RefSeq Promoter Array (Roche) baseret på HG18 genomet frigivelse blev anvendt. Matrixen indeholdt 720.000 sonder på 50-75 bp i længde med en median sonde afstand på 104 bp, der dækker 30.848 udskrifter, 22,532 initiativtagere og 27,728 CpG øer. De rå intensiteter af det scannede billede for både Cy5 og Cy3 kanaler blev udvundet ved hjælp af NimbleScan (Roche). De rå intensitet par filer blev importeret til R statistiske programmeringsmiljø hjælp brugerdefinerede R software.

Identifikation af sonder med betydelig skaleret log

2 ratio.

Nøgletallene signal intensitet, blev genereret ved at trække log forvandlet IP kanal intensiteter fra log transformeret indgangskanal intensiteter. De anførte nøgletal er centreret om en per prøve basis af Tukey biweight funktion. Sonder med betydelig skaleret log

2-forholdet blev identificeret ved NimbleScan software ved hjælp af standardparametre som foreskrevet af producenten.

Differential methylering fold-change mellem cellelinjer og /eller behandlinger.

Parvis sammenligninger blev udført gennem re-parametrisering at bestemme cellelinie og behandlingseffekt. Standard fejl og grader-of-frihed blev udtrukket og anvendt til at konstruere t-statistik og bestemmelse af betydning.

methylering array-data blev deponeret i NCBI Gene Expression Omnibus, tiltrædelse nummer GSE47017.

A liste over sonder med signifikant log2 fold-ændring (p-værdi 0,05) sammenligning mellem behandling (SFN eller DIM) versus kontrol køretøj, eller sammenligne mellem prostata kræftceller (køretøj kontrol) versus normale prostata epitelceller (køretøj kontrol) blev genereret . Sonder med signifikant fold-ændring blev kortlagt til kommenteret funktioner i det menneskelige genom (HG18) og visualiseret ved hjælp Generic Genome Browser (GBrowse) [23]. Sonder inden for 2 kb opstrøms og 1 kb nedstrøms for transkriptionsstartsitet (TSS) blev inkluderet i analyserne i denne rapport. Hierarkiske klyngedannelse analyser blev udført ved hjælp MeV software [24]. Venn-diagram, der sammenligner overlapningen af ​​forskellige genprodukter lister blev dannet med BioVenn [25]. Gene berigelse og funktionelle annotation analyser blev udført ved hjælp af Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery v6.7 (DAVID) [26]. Funktionel annotation clustering værktøj blev anvendt til at bestemme betydeligt beriget Gene Ontology (GO) vilkår inden hver indføring klynger. Epigenome kortlægning af betydeligt forskelligt denatureret sonder til at kode histon modifikation databasen blev gjort ved hjælp EpiExplorer [27].

Validering af DNA-methylering data

Vælg differentielt methylerede gener som bestemt af NimbleGen methylering vifte blev valideret af pyrosekventering. Genomisk DNA blev behandlet med natriumbisulfit ved hjælp EpiTech bisulfit Kit (Qiagen). Pyrosequencing PCR og sekventeringsprimere til udvalgte differentielt methylerede gener blev konstrueret under anvendelse PyroMark Assay Design version 2.0.1 software (Qiagen) (tabel S1). PCR-amplifikation af bisulfit-konverteret genomisk DNA blev udført ved anvendelse PyroMark PCR-kittet (Qiagen) under betingelser som angivet af producenten. PCR-produkter blev forelagt Stanford University Protein og Nucleic Acid Facility (Palo Alto, CA) for pyrosekventering. Kvantitative methylering analyser blev udført ved anvendelse PyroMark Q23-version 2.0.6 software (Qiagen).

genekspression Analyser

Totalt RNA fra behandlede celler blev isoleret under anvendelse af Trizol (Life Technologies). Totalt RNA blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for QRT-PCR (Life Technologies). Genekspression blev kvantificeret ved qPCR anvendelse af følgende qPCR primere: human DNMT1 (fremadrettet: 5′-GTGGGGGACTGTGTCTCTGT-3 ‘, revers: 5′-TGAAAGCTGCATGTCCTCAC-3′), DNMT3A (fremadrettet: 5’-CACACAGAAGCATATCCAGGAGTG-3 ‘, revers: 5’-AGTGGACTGGGAAACCAAATACCC-3 ‘), DNMT3B (frem: 5′-AATGTGAATCCAGCCAGGAAAGGC-3′, omvendt: 5’-ACTGGATTACACTCCAGGAACCGT-3 ‘), GAPDH (frem: 5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3′, omvendt: 5′-TTCACACCCATGACGAACAT -3), CCR4 (frem: 5’-AATTGTGCACGCGGTGTTTT-3 ‘, omvendt: 5′-TCCAGGGAGCTGAGAACCTT-3′), CXCR4 (frem: 5’-GAACTTCCTATGCAAGGCAGTCC-3 ‘, omvendt: 5’CCATGATGTGCTGAAACTGGAAC-3′) Cyr61 (fremadrettet: 5’-CTTAGTCGTCACCCTTCTCCAC-3 ‘, revers: 5′-CAGGGTCTGCCCTCTGACT-3′), og TGFBR1 (fremad: 5’-CCTCGAGATAGGCCGTTTGT-3 ‘, revers: 5′-ATGGTGAATGACAGTGCGGT-3’). Alle qPCR reaktioner blev udført ved hjælp af Fast SYBR Green Mastermix (Life Technologies) på 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Genekspression blev normaliseret til GAPDH og relativ kvantificering blev bestemt ved anvendelse af ΔΔCt metoden i RQ manager 1.2.1 software (Applied Biosystems).

chromatin Immunfældning (chip) Analyser

chip analyser blev udført som tidligere beskrevet med mindre ændringer [28]. Kort fortalt blev behandlede celler fikseret i formaldehyd og chromatin blev forskudt ved sonikering. Protein /DNA-komplekser blev immunpræcipiteret med antistoffer specifikke mod H3K4me3 (Abcam, Cambridge, MA). Negativ kontrol Chippen blev udført under anvendelse normal IgG. Efter immunopræcipitation, krydsbinding vending, og proteinase K-behandling, blev ChIP DNA oprenset ved phenol-chloroform-ekstraktion. Chip-qPCR primere blev udformet til at opformere specifikke TGFBR1 og Cyr61 promotorområder, der viste forskellen methylering grund DIM behandling (TGFBR1 fremad: 5′-GGATCGGGAAGGGGTTTGAG-3 ‘, revers: 5′-CCCTTCACATGCGACTCACT-3′; Cyr61 fremad: 5’- CTCCCACCCCTAACCCTCTA-3 ‘, revers: 5′-GGCCCTTAGTGCTAATGCTGA-3’). Chip-qPCR reaktioner blev udført tre gange, og kvantificering af immunopræcipiteret DNA-prøver blev udført ved anvendelse af en standardkurve genereret fra serielle fortyndinger af oprenset indført DNA. Resultaterne blev beregnet som en procentdel af input DNA (% input) og rapporteres som relative fold-ændring i forhold til DMSO køretøj kontrol.

Statistisk analyse

Statistisk test af EpiExplorer overlappende værdier for at afgøre, om at vælge methylering sonder overlapper betydeligt mere end forventet tilfældigt (randomiseret kontrol) med H3K4me3 og H3K9ac toppe i Encode database blev udført ved hjælp af Sekventiel Monte Carlo multiple test (MCFDR) algoritme i Genomisk HyperBrowser [29], [30]. Statistisk forskel mellem DNA-prober er forbundet med DIM-medieret øget eller nedsat methylering og deres respektive overlapning med histon mærker blev bestemt ved de to-stikprøveproportion t-test i SciPy (https://scipy.org). Resterende statistiske analyser blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism version 5.02 (GraphPad, La Jolla, CA), hvor dataene blev rapporteret som middelværdi ± SEM, og p-værdier blev bestemt ved anvendelse uparret t-test eller envejs ANOVA følge af Tukey-Krammer Multiple Sammenligning teste hvor det er relevant. Statistisk signifikansniveau blev defineret som α på 0,05.

Resultater

SFN og DIM Nedsat DNMT genekspression og forårsagede Distinct DNA methylering Profil Ændringer Afhængigt Prostata cellelinje

Vi vurderet virkningerne af SFN og DIM på ekspressionen af ​​DNMT1, DNMT3A, og DNMT3B i normale prostata epitelceller (Prec), androgen-afhængige (LNCaP) og androgen-uafhængig (PC3) prostata kræftceller. LnCAP og PC3-celler havde signifikant højere baseline ekspression af DNMT1, DNMT3A, og DNMT3B sammenlignet med Prec celler (Fig. 1A). I Prec og LnCAP celler, både SFN og DIM behandlinger faldt DNMT1 og DNMT3B genekspression (fig. 1B og 1C). I PC3-celler, SFN faldt betydeligt ekspressionen af ​​alle tre undersøgte DNMTs, og DIM faldt ekspressionen af ​​DNMT1 (fig. 1D). Baseret på dette resultat, samt vores tidligere resultater, som SFN kan mægle promotor de-methylering i prostata kræftceller [18], vi udførte en genom-dækkende undersøgelse for at fastslå de globale virkninger af SFN og DIM på promotor DNA methylering i Prec, LNCaP, og PC3 celler.

(A) genekspression af DNMT1, DNMT3A, og DNMT3B i ubehandlet Prec, LNCaP, og PC3 celler (n = 3-5 pr gruppe). Data repræsenterer middelværdien normaliseret fold-change ± SEM forhold til Prec. (B-D) Virkninger af SFN og DIM på DNMT genekspression i Prec celler (B), LNCaP-celler (C), og PC3-celler (D). Celler blev behandlet med vehikelkontrol (DMSO), 15 uM SFN, eller 15 uM DIM (n = 6 pr gruppe i B-D). DNMT1, DNMT3A, og DNMT3B genekspression blev analyseret 48 timer efter behandling. Data repræsenterer middelværdien normaliseret fold-change ± SEM sammenlignet med DMSO. * P-værdi. 0,05

status methylering af enkelte sonder blev første gang identificeret i hver af de tre cellelinier ved at sammenligne MeDIP-beriget versus input prøver (skaleret log2 ratio). Hierarkisk klyngedannelse analyse viste, at Prec, LNCaP, og PC3 havde distinkte methylering profiler (fig. 2A). Dernæst blev forskellen methylering mellem prostatacancerceller og normale prostataceller epitelceller bestemt. Prober med signifikant skaleret log

2-forhold identificeret i LNCaP-celler og PC3-celler blev sammenlignet med dem identificeret i Prec celler via parvise sammenligning for at bestemme signifikant log2 fold-forskelle mellem prostatacancerceller og normale prostata-epitelceller (LNCaP versus Prec, og PC3 versus Prec). Alle efterfølgende analyser af cellelinje og /eller behandling omhandlede virkninger betydelige ændringer methylering baseret på log2 fold-change sammenligninger. LNCaP-celler og PC3-celler havde 78,272 prober og 54,876 prober henholdsvis som var signifikant differentielt methyleret sammenlignet med normale Prec celler (Fig. 2B). I PC3-celler, havde 64% af proberne forøget methylering, sammenlignet med 49% af proberne i LNCaP-celler, der var steget methylering forhold til Prec. Da methylering profil hvert gen blev bedømt ved multiple prober, bestemte vi det gennemsnitlige methylering niveau pr gen som gennemsnittet af betydelig log2 fold-change af alle prober er tildelt individuelle gener. Dette udgjorde 10,315 og 8.013 forskelligt methylerede gener i LNCaP og PC3 celler, henholdsvis i forhold til Prec celler (Fig. 2C). Vi observerede, at størstedelen af ​​prober inden hvert gen havde lignende methylering ændringer, hvor mere end 92%, hverken havde øges eller mindskes methylering. Kun 7,4% af proberne i LNCaP-celler og 4,2% af proberne i PC3-celler havde blandet methylering profilen hvert gen (data ikke vist). Log2 fold-ændring pr gen varierede fra -3,322 til 2,893 i LnCAP celler, og -2,411 til 2,941 i PC3 celler. Funktionel annotation analyser indikerer, at gener med ændret methylering profil i prostatacancerceller blev beriget i gener, der er dysreguleret eller involveret i cancer progression, herunder GO kategorier forbundet med cellemigrering, celleadhæsion, celle-celle-signalering, samt transkription regulering (data ikke vist). Vælg gener med differentiel methylering baseret på NimbleGen methylering vifte blev valideret af pyrosekventering (figur S1).

(A) Hierarkisk klyngedannelse analyse af sonder med betydelig skaleret log forhold

2 i Prec, LNCaP, og PC3 celler. Grønne og røde bjælker repræsenterer individuelle prober med betydelig formindsket og forøget methylering af henholdsvis MeDIP DNA-prøver i forhold til input DNA-prøver. Dataene repræsenterer de øverste 1.000 væsentligste sonder inden for hver cellelinje. (B) En sammenligning af methylering ændringer i LNCaP og PC3-celler i forhold til Prec celler. Væsentlige methylerede prober i LNCaP og PC3-celler blev sammenlignet med Prec, og fordelingen af ​​prober med signifikant log2 fold-changes er vist. (C) Gennemsnitlig methylering niveau i de enkelte gener i LNCaP og PC3 celler sammenlignet med Prec. Log2 fold-ændring pr genet blev bestemmes som gennemsnittet af log2 fold-ændring af alle forskelligt denatureret sonder tildelt hvert gen, og repræsenteret som boks og knurhår plots. Nummer over linjen angiver antallet af gener i hver gruppe. Whiskers repræsenterer maksimum og minimum værdier, og “+” repræsenterer middelværdien.

Vi næste undersøgt virkningerne af SFN og DIM på promotor methylering profiler i hver prostata cellelinje. Log2 fold-ændring blev sammenlignet mellem SFN eller DIM behandlinger i forhold til DMSO køretøj kontrol i Prec, LNCaP, og PC3 celler. SFN behandlinger resulterede i signifikant log2 fold-ændring i 6.154 sonder i Prec celler, 9,302 sonder i LNCaP-celler, og 20,783 sonder i PC3-celler (fig. 3A), der repræsenterer 2472, 3508, og 6.778 differentielt methylerede gener, henholdsvis (fig. 3B ). DIM behandlinger inducerede betydelig log2 fold-ændring i 8.970 sonder i Prec celler, 15,237 sonder i LnCAP celler og 7,386 sonder i PC3 celler, der repræsenterer 3224, 4404 og 2.394 varierende methylerede gener, (fig. 3B). Individuelle prober inden hvert gen havde lignende methylering ændringer, hvor mere end 95% af proberne enten var steget eller faldet methylering, og meget få gener havde blandet methylering profil ( 5% af proberne i SFN-behandlede celler og 2,5 % af proberne i DIM-behandlede celler) (data ikke vist). Rækken af ​​fold-ændring som følge af SFN og DIM behandlinger var mellem -1,380 til 1,243, og var smallere i forhold til dem, der observeres, når man sammenligner prostata kræftceller versus normale prostata epitelceller (fig. 2B). Fordeling af de differentielt methylerede sonder i promotoren blev undersøgt og viste ingen fortrinsret skævhed til specifikke promotorområder (data ikke vist).

(A) Virkninger af SFN og DIM på methylering profil i Prec, LNCaP, og PC3 celler sammenlignet med kontrol køretøj. I hver af de tre cellelinier blev signifikante methylerede prober i SFN eller DIM-behandlede grupper sammenlignet med deres respektive vehikelkontrol at bestemme probe-specifikke log2 fold-change. Fordelingen af ​​sonder med signifikant log2 fold-ændring er vist. (B) Gennemsnitlig methylering niveau i enkelte gener i SFN og DIM-behandlet Prec, LNCaP, og PC3 celler sammenlignet med kontrol køretøj. Log2 fold-ændring pr genet blev bestemmes som gennemsnittet af log2 fold-ændring af alle forskelligt denatureret sonder tildelt hvert gen, og repræsenteret som boks og knurhår plots. Nummer over linjen angiver antallet af gener i hver gruppe. Whiskers repræsenterer maksimum og minimum værdier, og “+” repræsenterer middelværdien.

Venn-diagram analyser viste, at SFN og DIM hver ændrede methylering i forskellige sæt af gener i hver af cellelinjer. Sammenligning af sæt af gener ændret ved SFN eller DIM viste, at kun et lille antal gener (219 og 209 gener, henholdsvis) blev delt mellem alle tre cellelinier, svarende til mellem 3% til 9% af differentielt methylerede gener inden for hver cellelinie (fig. 4A). Af denne centralt sæt af gener, der var -30% overlap mellem SFN og DIM behandlinger. I modsætning hertil var der en høj grad af overlapning af gener, der berøres af både SFN og DIM behandlinger inden Prec og LnCAP celler (1.926 gener og 2.671 gener henholdsvis), og i mindre omfang PC3 celler (1.408 gener) (fig. 4B) . Lignende resultater blev opnået når vi underopdeles datasættene i gener med forøget methylering eller nedsat methylering (data ikke vist). Funktionel annotation analyser viste forskellige sæt af beriget gener i normale prostata-epitelceller sammenlignet med prostatacancerceller, men lignende sæt af gener blev beriget ved sammenligning SFN og DIM behandling inden for hver cellelinie (fig. 5). I Prec celler, gener, der er involveret i transskription, apoptose og chromatin organisation /ændring blev beriget med både SFN og DIM behandlinger. I LnCAP celler blev to generelle kategorier af gener beriget. De første involverede gener forbundet med celle bevægelse, herunder celle migration, adhæsion, og lokalisering. Den anden involverede gener forbundet med immunrespons, herunder inflammation og forsvar, leukocyt aktivering og immune regulering. Funktionel annotation analyse i PC3-celler viste berigede gen kategorier delte lighed med både Prec og LNCaP, herunder gener involveret i transkription, apoptose, cellemigrering, og immunrespons.

(A) Venn-diagram, der viser antallet af gener, blev forskelligt methylerede i Prec, LNCaP, og PC3 celler efter behandlinger med SFN eller dæmpe forhold til kontrol køretøj. (B) Venn-diagram, der viser antallet af forskelligt methylerede gen mål for SFN og DIM inden for hver cellelinje.

Funktionel annotation af forskelligt methylerede gen mål for SFN og DIM i Prec, LNCaP, og PC3 celler blev undersøgt, og antallet af gener involveret i udvalgte biologiske processer og funktioner blev vist. Data udtrykkes som antallet af gener i hvert væsentligt beriget GO kategori.

SFN og DIM Omvendt Kræft-associerede DNA-methylering Ændringer i LNCaP-celler

Dernæst givet mere markant fald i DNMT1 og DNMT3B med både SFN og DIM behandling i LnCAP celler, valgte vi at fokusere på at karakterisere en delmængde af gener, der var forskelligt methyleret i LNCaP-celler i forhold til Prec celler, og blev vendt med SFN og /eller DIM behandlinger. Af de 10,315 gener, der havde differentiel methylering i LNCaP-celler (fig. 2C), SFN og DIM behandlinger vendt methylering profiler af 1.509 (14,6%) og 2.219 (21,5%) gener, (fig. 6A). Disse gener tilhørte to kategorier: 1) gener, der var steget promotor-methylering i LNCaP-celler i forhold til Prec celler og reducerede methylering ved SFN og /eller DIM behandling, og 2) gener, der var faldet promotor-methylering i LNCaP-celler i forhold til Prec celler og øget methylering på SFN og /eller DIM behandling. Et eksempel på et gen, der tilhører hver kategori, C-C kemokinreceptor type 4 (CCR4) og transformerende vækstfaktor-β1-receptor type I (TGFBR1), blev vist i fig. 6B. Funktionel annotation analyser viste GO berigelse for mange gener vides dysreguleret eller er stærkt involveret i kræft progression. Dette datasæt indeholdt gener involveret i celleadhæsion og kemotaxi samt immunrelaterede gener involveret i inflammation og forsvar, cytokine binding, og immun udviklingsprogrammer (fig. 6C). Venn-diagram Sammenligningen viste, at 86% af generne i SFN genet listen (1309 ud af 1509) blev delt med DIM gen listen (fig. 6D). Da hovedparten af ​​gener, der berøres af SFN blev medtaget i den DIM gen listen, analyser efterfølgende genekspression fokuseret på udvalgte gener hvor DIM behandling vendt den dysreguleret methylering profil i LnCAP celler.

(A) Antal forskelligt denatureret gener i LNCaP-celler i forhold til Prec celler, der blev vendt med SFN eller DIM behandlinger. Sort søjle repræsenterer gener, der var faldet methylering i LnCAP celler, som blev forøget med SFN /DIM behandlinger. Hvid søjle repræsenterer gener, der var steget methylering i LNCaP-celler, der var nedsat med SFN /DIM behandlinger. (B) To gen eksempler, CCR4 og TGFBR1 med dysregulerede methylering profiler i LNCaP-celler, der blev vendt med SFN og /eller DIM behandlinger. Farvede linier repræsenterer den genomiske position af DNA methylering prober, var faldet methylering (blå) eller øge methylering (rød) ved sammenligning probe-specifikke log2 fold-ændring i LNCaP-celler versus Prec, eller DIM versus DMSO vehikelkontrol i LNCaP-celler. TSS (blå cirkel) repræsenterer transkriptionsstartstedet af hvert gen. (C) Funktionel annotation af forskelligt denatureret gen mål i LNCaP-celler, der blev vendt med SFN eller DIM behandlinger. (D) Venn diagram, der viser antallet af gen-mål med promotor methylering, som blev dysreguleret i LNCaP-celler, og omvendt med SFN eller DIM.

Fire gener (TGFBR1, cystein-rige angiogene inducer 61 (Cyr61) , CCR4, og CXC kemokinreceptor type 4 (CXCR4)) blev udvalgt til yderligere at undersøge forholdet mellem ændring i promoter methylering profil og genekspression i LnCAP celler. Arrangøren methylering profiler af hver af disse fire gener blev ændret i LNCaP-celler, i forhold til Prec celler, og DIM behandling vendt kræft-associerede methylering profiler. Ekspressionen af ​​hvert af de fire kandidatgener er blevet rapporteret at blive dysreguleret i cancer, og korreleret med cancer progression.