PLoS ONE: humant papillomvirus Mutationsanalyse Indsættelse: Specifik Marker af cirkulerende tumor DNA i livmoderhalskræft Patients

Abstrakt

Introduktion

I de fleste tilfælde af livmoderhalskræft, HPV-DNA er integreret i genomet af carcinomceller. Denne mutations insertion udgør en yderst specifik molekylær markør for tumor-DNA for hver patient. Cirkulerende tumor DNA (ctDNA) er en ny markør for tumor dynamik som afsløring kræver specifik molekylær motiv. For at afgøre om rækkefølgen af ​​cellen-virale krydset kunne anvendes i klinisk praksis som en specifik markør for ctDNA, vi analyseret en række livmoderhalskræft patient sera.

Metoder og Resultater

Serum enheder af 16 patienter diagnosticeret med HPV16 /18-associeret cervixcancer, og for hvilke den virale integration locus tidligere er blevet lokaliseret, blev analyseret. Sekventielle serumprøver, taget på forskellige tidspunkter under forløbet af sygdommen, var også tilgængelige for to af disse tilfælde. ctDNA blev fundet i 11 ud af 13 patienter med tumorstørrelse på mere end 20 mm ved diagnose, og analyse af sekventielle serumprøver viste, at ctDNA koncentrationen i patienter serum var relateret til tumor dynamik.

Konklusioner

Vi rapporterer, at HPV-mutations indsættelse udgør en meget specifik molekylær markør for ctDNA i HPV-associeret tumor patienter. Ved anvendelse af denne oprindelige fremgangsmåde blev ctDNA påvist i de fleste cervikale cancerpatienter end trin I og ctDNA koncentration viste sig at afspejle tumorbelastning. Ud over sit potentiale prognostisk og prædiktiv værdi, HPV mutation indsættelse må formodes at udgøre en ny molekylær surrogat af minimal residual sygdom og af subklinisk tilbagefald hos HPV-associeret tumor. Dette er af stor betydning i lyset af specifikke anti-HPV terapi

Henvisning:. Campitelli M, Jeannot E, Peter M, Lappartient E, Saada S, de la Rochefordière A, et al. (2012) human papillomavirus Mutationsanalyse Indsættelse: Specifik Marker af cirkulerende tumor DNA i livmoderhalskræft patienter. PLoS ONE 7 (8): e43393. doi: 10,1371 /journal.pone.0043393

Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal

Modtaget: Februar 23, 2012; Accepteret: 20 juli 2012; Udgivet: August 24, 2012 |

Copyright: © Campitelli et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af et partnerskab med La Maison Goyard og af en generøs gave fra Ms. A. Mauresmo. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dette arbejde blev støttet delvist af partnerskabet af La Maison Goyard, luksus bagage- maker, gennem event ‘Un Bagage pour Curie «. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Specifikke typer af humane papillomavirus (HPV) er anerkendt som den vigtigste ætiologiske faktor i livmoderhalskræft neoplasier [1]. I præ-invasive læsioner, de virale genomer til stede som episomale molekyler i kernen af ​​inficerede celler. I de fleste tilfælde af invasiv carcinom, er imidlertid HPV DNA-sekvenser integreret i det cellulære genom [2], [3], [4]. Virale genom integration udgør således et afgørende skridt i tumorigenese [5]. En enkelt unikt viral integration websted er blevet fundet i mere end 80% af livmoderhalskræft [6].

Den karakteristiske klonalitet, specificitet og stabilitet over tid af HPV-DNA insertion i genomet af carcinomceller udgør en yderst specifik genetisk markør af tumor-DNA. Nylige data har vist, at kunne detekteres mutant DNA i blodet hos patienter med tumorer, og at mængden af ​​cirkulerende tumor-DNA (ctDNA) var relateret til tumor dynamik [7]. Dette åbner store perspektiver for brugen af ​​ctDNA som en tumor biomarkør hos kræftpatienter [8]. I fremskredent stadium livmoderhalskræft, har flere undersøgelser rapporteret beviser for cirkulerende HPV-DNA (c-HPV-DNA) [9], [10], [11] eller cirkulerende HPV-RNA [12]. Disse undersøgelser viste, at det var muligt at påvise virale nukleinsyrer i blodet hos patienter med cervikal cancer, men på grund af manglende følsomhed [10], [13], [14] og tvivlsom specificitet [11], [13], den data var af ringe klinisk virkning. I denne sammenhæng har vi designet en undersøgelse for at vurdere værdien af ​​insertionsmutation af HPV-DNA som markør til påvisning og kvantificering af ctDNA ved diagnose i serum fra patienter med invasiv livmoderhalskræft. Vi så også for variationer af ctDNA koncentration under forløbet af sygdommen. Desuden at sammenligne følsomheden af ​​vores oprindelige og specifikt assay til at baseret på påvisningen af ​​HPV-DNA-sekvenser, vi også søgte c-HPV-DNA ved anvendelse af primere placeret i E7 HPV16 /18-gen.

Materialer og metoder

Patienter og tumorer

fra en række HPV16 (14 tilfælde) eller HPV 18 (2 tilfælde) livmoderhalskræft akkumuleret mellem 2001 og 2011, vi bestemt den virale indsættelse locus ved hjælp af DIPS- PCR-metoden [15]. I de 16 sager, serumprøver taget på diagnose før behandling var til rådighed. I to af disse tilfælde yderligere sekventielle serumprøver taget i løbet af sygdommen var også tilgængelige. Fjorten tumorer var invasive pladecarcinom og to var glandulær. I overensstemmelse med fransk lovgivning, blev alle patienter informeret og gjorde ikke indsigelse mod deres biologiske prøver, der anvendes til forskning. Den virale belastning, i tumorbiopsier blev vurderet ved kvantitativ PCR (qPCR) under anvendelse af primere designet i E7 HPV16 /18-genet, som beskrevet tidligere [6]. Eftersom integrerede HPV DNA-sekvenser kan præsentere amplifikation ved insertion locus, blev mutations insertion kopital også vurderet af qPCR anvendelse af primere og reagenser i tabel S1.

KLK3

gen status blev taget som en to kopier reference.

DNA serum analyser

DNA blev isoleret fra 200 pi serum med QIAamp Min Eluer Virus Spin Kit (Qiagen® , Courtaboeuf, Frankrig) ifølge producentens anvisninger. Elueringen blev udført med 25 pi medfølgende buffer. Isolerede DNA-koncentrationer blev målt ved hjælp af et Real-Time kvantitativ PCR (RT-qPCR) system baseret på Long indbyrdes afstand Nuclear Elements (LINE) sekvens afsløring [16]. Fortyndinger af normalt humant DNA blev anvendt som standarder og PCR blev udført i 25 pi med SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Villebon-sur-Yvette, Frankrig), primere mix (1 pM) og 2 pi af elueret DNA med følgende cyklusbetingelser: 15 minutter ved 95 ° C og 45 cykler (15 sekunder, 95 ° C, 15 s, 61 ° C; 1 min, 72 ° C) efterfulgt af en dissociation fase (15 s, 95 ° C; 15 s , 60 ° C; 15 s, 95 ° C). RT-qPCR assay under anvendelse Sybr®Green (Applied Biosystems) blev designet til specifikt at amplificere celle-virus junction DNA-sekvenser (elueret DNA 2 pi) eller HPV16 E7-DNA (elueret DNA 2 pi) med 400 nM af hver primer i et slutvolumen på 25 pi. Hvert sæt primere blev testet på seriefortyndinger (fra 50 ng /pl til 0,5 pg /pl) for at matche tumor-DNA i Tris-EDTA-puffer med thermocycler betingelser i 15 minutter ved 95 ° C og 45 cykler (15 sekunder, 95 ° C ; 1 min, 62 ° C) efterfulgt af en dissociation fase (15 s, 95 ° C; 1 min, 60 ° C; 15 s, 95 ° C). Primer sekvenser og MgCl

2-koncentrationer er angivet i tabel S1. Følsomheden af ​​PCR-assayet skulle være lig med eller større end 5 pg /pl at validere primersæt. For at forøge følsomheden af ​​påvisningen blev 10 gentagelser af RT-qPCR assay udført på hver serumprøve til påvisning af ctDNA og af c-HPV-DNA. Mængden af ​​ctDNA i 200 pi serum svarede til summen af ​​ctDNA detekteret i hver positiv replikat. Koncentrationen af ​​ctDNA blev endelig udtrykt i kopier /ml serum.

Resultater

Klinisk Figo stadier var fra Ib til IVa og et tilfælde var en underlivsbetændelse tilbagefald af livmoderhalskræft SCC (tabel 1). Tumorstørrelse varierede alligevel fra 10 mm til 120 mm. De tilgængelige planocellulært karcinom antigen (SCC) værdier varierede fra 1,1 ng /ml til 17,4 ng /ml (tærskel af positivitet: 1,5 ng /ml). HPV-DNA blev integreret i forskellige loci (tabel 1). Den virale belastning i tumor prøver varierede fra 0,5 til 160 HPV16 genomer per celle (0,8 10

6 til 24 10

6 HPV16 kopier /ug DNA). Koncentrationen af ​​cirkulerende værts-DNA varierede fra 6 10

1 til 77 10

3 kopier /ml serum (tabel 1). Vi var i stand til at påvise ctDNA i 11 ud af 16 patienter diagnosticeret med invasiv livmoderhalskræft. Tre negative sager svarede til den tidlige fase (Ib) karcinom med en størrelse fra 10 til 20 mm (tabel 1). Serumkoncentrationen af ​​ctDNA varierede fra 5 til 890 kopier /ml serum, der repræsenterer fra 0,01% til 25% af cirkulerende værts-DNA. c-HPV-DNA blev påvist i 13/16 tilfælde, de tre sager tidlige fase resterende negativ. Værdier lå mellem 5 og 8,5 10

3 kopier /ml serum (tabel 1). De tre højeste værdier (8,5, 3,5 og 3,4 10

3 kopier /ml), svarede til tilfælde med høj virusmængde i tumorbiopsier, hvilket antyder, at DNA afledt fra episomale molekyler blev også påvist ved analysen.

ctDNA dynamik blev analyseret på sekventielle serumprøver i to patienter. Den første patient modtog kombineret kemo- og stråleterapi efterfulgt af livmoderen-vaginal brachyterapi og kirurgi (figur 1, sag nr 6). Den ctDNA værdi faldt under behandlingen og var nul ved udgangen af ​​behandlingen, på hvilket tidspunkt der blev observeret en fuldstændig histologisk respons på hysterektomi prøven. To måneder senere, at patienten udviklet en 8 mm levermetastaser og ctDNA blev påviselig igen. Stigende niveauer af ctDNA blev senere fundet, når patienten udviklede abdominal node gentagelse. De samme dynamik blev observeret i den anden patient udelukkende behandlet med strålebehandling (Figur 1, sag nr 13). Af interesse i opfølgningen, mens bækken MRI viste ingen signifikant ændring, blev der observeret en stigning på ctDNA. Lidt efter patienten præsenterede en abdominal tilbagefald forbundet med høje niveauer af ctDNA. De samme dynamik blev observeret med c-HPV-DNA.

Diskussion

Vi rapporterer her, at ved anvendelse af HPV integration mutation som en molekylær markør, kan ctDNA detekteres i serummet fra de fleste patienter diagnosticeret med invasiv livmoderhalskræft i stadie Ib og at mængden af ​​ctDNA reflekteret tumor dynamik. Da den virale integration site er unik for hver patient, denne markør er meget specifik, meget mere end SSC markør [17]. Med hensyn til følsomhed, kunne vi opdage ctDNA i 11 ud 13 (85%) patienter med stadie II-IV tumorer, en sats høj grad højere end de 12% [9], 18% [13], 20% [14] og 50% [ ,,,0],11] af positivitet rapporteret så langt for c-HPV-DNA. Praksis med 10 replikater til påvisning af ctDNA i hver serumprøve kan forklare den øgede følsomhed af vores assay. For eksempel i de fleste af vores positive tilfælde, mindre end 50% af replikater fremlagt dokumentation for ctDNA. Men i 2 af de 13 tilfælde med en tumorstørrelse 20 mm, blev der ikke ctDNA fundet henviser c-HPV blev påvist DNA. Begge tilfælde svarede til tumorer med lav HPV indsættelse belastning (≤1 kopi /celle). I modsætning hertil cervikale carcinomceller ofte harbor gratis HPV genomer som også udgivet i det generelle kredsløb, hvilket øger hastigheden af ​​påvisning af cirkulerende viralt DNA. Ikke desto mindre dette aktiv kan opvejes af en risiko for falsk positivitet. For eksempel, assays baseret på detektion på HPV-DNA forudsat falsk positive satser på 13,5% i normale individer og 33% i CIN3 patienter [11]. Desuden blev også rapporteret hyppige uoverensstemmelser mellem HPV-genotyper fundet i livmoderhalskræft og i serum fra de samme patienter [13]. Disse vanskeligheder skal overvindes af tilstrækkelig kontrol af specificitet, og til klinisk formål kan c-HPV DNA-analyse repræsenterer et nyttigt alternativ, hvor det er vanskeligt at identificere eller brug af viral-celle junction-sekvenser.

Analyse af sekventiel serumprøver udviste dynamik resultaterne: koncentrationen af ​​ctDNA faldt under behandlingen og forøget på tidspunktet for tilbagefald. Den positivitet af ctDNA forud radiologiske tilbagefald i det ene tilfælde og var forbundet med en 8 mm levermetastaser i den anden. Tumor-DNA kan være lettere frigøres fra tumorvæv svarende til tilbagefald eller metastaser end primær læsion. Det kan også stamme fra cirkulerende tumorceller. En specifik og kvantitativ molekylær markør for ctDNA kan anvendes til at følge forløbet af livmoderhalskræft. Under den første behandling, kan ctDNA bidrage til at vurdere sygdommens prognose og tumor følsomhed over for terapi. Større prospektive undersøgelser vil være nødvendige for at validere dette værktøj. Under opfølgning, kunne ctDNA koncentration være en meget specifik surrogat markør for minimal residual sygdom og subklinisk tilbagefald. Dette er af stor betydning i lyset af specifikke anti-HPV-behandling [18], hvis potentielle effektivitet er i høj grad afhængig af tumor masse. Disse fremgangsmåder kan let udvides til andre typer af HPV-associerede tumorer, endetarmen og hoved og hals-carcinom, f.eks. Lokalisering af HPV integration site er ikke i øjeblikket vurderes i klinisk praksis. Nye teknologier som Next Generation Sequencing [19], men bør fremme denne beslutsomhed og giver optimal molekylær karakterisering af tumorer at tilpasse håndteringen af ​​patienter. Derudover kan følsomheden af ​​påvisningen af ​​ctDNA let forøges, blot ved at analysere en større mængde serum og /eller ved at øge effektiviteten af ​​PCR-assay, for eksempel ved anvendelse af digitale PCR [20] .Disse fremskridt vil lette vurderingen af brugen af ​​ctDNA i klinisk onkologi og vil forbedre den biologiske opfølgning af patienter behandlet med livmoderhalskræft.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Primere sekvenser og reagenser til påvisning af ct-DNA.

doi: 10,1371 /journal.pone.0043393.s001

(DOC)

Tak

Vi takker hr F Radvanyi for frugtbare diskussioner og fru A. Le Cunff og Z. Maciorowski for deres hjælp i udarbejdelsen af ​​manuskriptet.