PLoS ONE: Sammenhænge mellem Integrin ανβ6 Expression og klinisk-patologiske træk i Stage B og Stage C endetarmskræft

Abstrakte

Integrin ανβ6 er stærkt udtrykt i en række humane kræftformer og ofte korrelerer med patientens overlevelse. Dette studie undersøger sammenhænge mellem ανβ6 udtryk og patient klinisk-patologiske funktioner i Stage B og Stage C endetarmskræft, herunder den samlede overlevelse. Angivelse af ανβ6 blev målt i 362 Stage B eller C endetarmskræft vævsprøver på tumoren centrale region, invasive tumor foran og tilstødende ikke-neoplastisk slimhinde ved hjælp immunhistokemi. Fordeling af ανβ6 fandtes at være signifikant højere ved den invasive foran i forhold til centrale regioner i tumoren (p 0,001) eller tilgrænsende ikke-neoplastiske mucosa (p 0,001), hvilket tyder ανβ6 spiller en rolle i tumorcelleinvasion. Imidlertid blev integrin ανβ6 udtryk ikke forbundet med klinisk-patologiske funktioner eller samlet overlevelse indikerer det ikke er en uafhængig prognostisk markør differentiere Stage B eller C endetarmskræft. Tidligere ανβ6 studier tyder ekspressionen af ​​ανβ6 er involveret i de tidligere stadier (dvs. trin A /B) for tumorprogression snarere end de senere faser (dvs. Stages C /D). Men vores undersøgelse viste, at i endetarmskræft ανβ6 udtryk ikke stiger mellem Stages B og C, men kan forekomme tidligere, nemlig før eller under Stage B kræft

Henvisning:. Ahn SB, Mohamedali A, Chan C Fletcher J, Kwun SY, Clarke C, et al. (2014) Sammenhænge mellem Integrin ανβ6 Expression og klinisk-patologiske træk i Stage B og Stage C endetarmskræft. PLoS ONE 9 (5): e97248. doi: 10,1371 /journal.pone.0097248

Redaktør: Ju-Seog Lee, University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: 11. november 2013; Accepteret: 16. april, 2014 Udgivet: 12. maj 2014

Copyright: © 2014 Ahn et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Biofocus Forskningscenter, Macquarie University og tilskud fra NHMRC (1010303) og Cancer Rådets NSW. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Klassificering af sværhedsgraden af ​​kolorektal cancer (CRC) er i øjeblikket baseret på klinisk og histologisk bestemmelse af omfanget af spredning af tumoren. Tumorceller kan lokaliseres i tarmvæggen (Stage A), der strækker sig ud over den muscularis propria (Stage B), eller metastaseret til lymfeknuder (Stage C) eller fjerntliggende organer (Stage D). Femårige CRC overlevelse statistikker viser en signifikant reduktion i overlevelse mellem trin B og C, som svarer til forskellen i lymfeknudemetastaser [1]. Selvom klinisk-patologisk iscenesættelse er den nuværende guldstandarden teknik til bestemmelse af prognosen, brug af nye protein biomarkører udtrykt eller forstærkes i en Stage-specifik måde under progression kan øge præcisionen og pålideligheden af ​​histologiske bestemmelser. En kombination af en lyd CRC iscenesættelse system, og tilstedeværelsen af ​​prognostiske protein biomarkører er blevet foreslået som en mere effektiv tilgang til diagnose, prognose og behandling vejledning [2].

En nylig foreslået potentiel prognostisk biomarkør er integrin ανβ6. Dette protein udtrykkes kraftigt i mange cancertyper og er blevet foreslået at være en prognostisk indikator for ringe overlevelse i CRC, gastrisk adenocarcinom og cervikal pladecarcinom [3] – [6]. Integrin ανβ6 er en transmembranreceptor sammensat af ikke-kovalent bundne αν og β6-underenheder, hvor β6 subunit partnere udelukkende med αν og kun udtrykkes i epiteliale [7] væv. ανβ6 er ofte koncentreret i ringe differentierede tumorer proksimalt for invaderende cancerceller margener [8] – [11]. Det er også blevet identificeret som en vigtig faktor i den

“epitelial til mesenkymale overgang”

(EMT), der er karakteriseret ved tab af celleadhæsion, undertrykkelse af E-cadherin og øget celle motilitet under karcinom progression [12] . Integrin ανβ6 menes at operere på en kompleks måde, initierende celle signalering kaskader samtidig interagere med nøgle ekstracellulære matrix (ECM) proteiner og aktivering vækstsignaler såsom latent transformerende vækstfaktor β1 (TGF-p1), en anerkendt inducer af EMT [3 ], [13]. Til støtte for denne påstand, antistof-medieret hæmning af ανβ6-medieret TGF-β1 aktivering undertrykker EMT [14]. Desuden har ανβ6 integrin vist sig at spille en afgørende rolle i en CRC sfæroid EMT model medieret gennem TGF-β1 aktivering og efterfølgende migrering af celler på interstitiel fibronectin [11].

I modsætning til de fleste andre integriner, ανβ6 signaler via en unik 12-mer C-terminale cytoplasmiske sekvens, der interagerer direkte med det ekstracellulære signal-regulerede kinase (ERK2) aktivering af ERK /MAPK-vejen, der ofte stærkt overudtrykt i CRC metastase [15]. Den β6 • ERK2 interaktion er også ansvarlig for integrin-medieret matrixmetalloprotease 9 (MMP9) sekretion (via MAPK), der tillader nedbrydning af ECM, lette celle undslippe [16], [17]. Sammenfattende ανβ6 er en regulator af metastase og er fundet at være overudtrykt i mange cancerceller fænotyper. Mens den række indicier implicerer ανβ6 i metastaser er betydelig, i øjeblikket ingen studier har undersøgt, når det bliver overudtrykt, eller om der findes sammenhæng mellem ανβ6 og patient overlevelse i endetarmskræft. I denne undersøgelse vi specifikt undersøge immunhistokemisk ekspression af ανβ6 i 362 patienter med rektal cancer Stage B eller C i den centrale region af tumoren, den invasive front og tilstødende ikke-neoplastisk slimhinde.

Materialer og metoder

Patient kohorte

Alle patienter gennemgik kirurgisk resektion for endetarmskræft på Concord Hospital, en tertiær henvisning hospital i Sydney, Australien, fra januar 1988 og december 2001. Alle resektioner blev udført af specialiserede kolorektal kirurger efter en standardiseret teknik (total anatomisk dissektion) [18]. Den rektum blev defineret som herunder rectosigmoid krydset men eksklusive endetarmen. Kliniske data fra patienter blev indgået en fremadrettet database indledt i 1971, herunder oplysninger om patientkarakteristika, komorbiditet, præsentation, undersøgelser, kirurgisk ledelse, komplikationer, adjuverende behandling, patologi og opfølgning [19], [20]. CRC-projektet på Concord Hospital udføres under godkendelsen af ​​sydvestlige Sydney sundhedsområde etiske komité (CH62 /6 /2011-136) med skriftlige samtykke i overensstemmelse med kravene i NSW humant væv Act 1983 og NHMRC National Statement om etisk adfærd i human Research 2007. undersøgelsen også godkendt af Macquarie University menneskelige etiske komité (# 5201100858). Patienter, der fik neoadjuverende strålebehandling havde enten kort eller lang naturligvis behandling med eller uden tilknyttet kemoterapi. Udvælgelse til behandling var baseret på kliniske fund og diskussion i en multidiscipline møde.

Patologisk undersøgelse af de resektion eksemplar

Undersøgelse af resektion prøver fulgte en standard-protokol [1]. Tumorstørrelse blev målt som den største overflade dimension. Blokke blev taget for at demonstrere maksimale direkte tumor penetration af tarmvæggen. Ekstra blokke blev taget specielt til at demonstrere forholdet mellem tumor og andet vedhængende struktur eller væv [21] samt linjer af resektion og fri serøse overflade [22]. Tumor niveau i endetarmen blev målt fra den anale randen. Venøs invasion af tumoren henvist til involvering af tykke eller tyndvæggede vener, enten inden for eller uden for tarmvæggen. Når tvivl eksisteret, om en struktur involveret var en vene blev en negativ konstatering registreres. En apikal knude blev defineret som den mest proximale eventuelle knuder inden 1cm af ligeringen af ​​en navngiven fartøj i spidsen af ​​en vaskulær stilken. Tumor kvalitet blev vurderet under hensyntagen til graden af ​​differentiering og anaplasia, arten af ​​tumor margin (skubbe eller infiltrere) og tilstedeværelse og fremtrædende vaskulær invasion [19]. Alle patologiske karakteristika blev analyseret i hver prøve og tilstedeværelse eller fravær optaget eksplicit, uden manglende data på enhver variabel.

Tumorer blev iscenesat i henhold til den australske klinisk-Patologisk Iscenesættelse (AVS-landene) [1] for CRC, som plads sub-faser kompatible med andre clinicopathologic mellemstationer systemer såsom TNM [23]. En potentiel kurativ operation blev defineret som en, hvor der ikke var nogen systemiske metastaser på tidspunktet for operation og ingen tumor identificeres histologisk i den proksimale, distale eller rundtgående resektion histologisk (ACP’er trin A, B, C).

Tissue microarray konstruktion

væv microarrays (TMA) blev konstrueret under anvendelse af et Advanced Tissue arrayer ATA-100 (Chemicon, Temecula, CA, USA). Kerner (1,5 mm) blev taget fra nøje udvalgte, morfologisk repræsentative områder af de oprindelige paraffinblokke og klædt i frisklavede modtager paraffinblokke. Kerner blev taget fra det centrale område af tumoren (undgå luminale overflader), den invasive foran tumoren og histologisk normal slimhinde.

Immunhistokemi (IHC)

Et murint monoklonalt antistof (MAb) mod humane fuldlængde ανβ6 (klon 6.2A1, lgG1) (Biogen Idec, Cambridge, MA, USA) blev anvendt i IHC. Specificiteten af ​​anti-ανβ6 monoklonalt antistof 6.2A1 er blevet rapporteret i flere undersøgelser [14], [24] – [26]. Alle TMA sektioner blev forberedt og behandlet samtidig med samme batch af primære og sekundære antistoffer og farvningsreagenser, ikke er behov for at implementere en intern standard. IHC blev udført med to forskellige detektering amplifikationssystemer: et avidin-biotin kompleks (ABC) og en polymer-baserede IHC påvisningssystem. For ABC IHC blev 4 um paraffinindlejrede TMA sektioner deparaffinised og rehydreret, og endogen peroxidase blokeret med 3% H

2O

2 i methanol i 5 min. Antigen genfinding blev udført under anvendelse pepsin (DAKO, Carpinteria, CA) ved 37 ° C i 10 min. Snit blev inkuberet med hesteserum (Vector Laboratories, Burlingame, CA) blokerende opløsning (15 pl /ml) i TBS-Tween 20 i 20 minutter ved stuetemperatur (RT) og derefter inkuberet med 0,5 mg /ml anti-ανβ6 MAb ved stuetemperatur i 60 min . Snit blev inkuberet med biotinyleret anti-mus IgG (Vector Laboratories) i 20 minutter ved stuetemperatur og inkuberet med Elite ABC-reagens (Vector Laboratories) i 20 minutter ved stuetemperatur. Mellem hver inkubation blev TBS vask udført to gange. 3,3′-diaminobenzidin-substrat i 0,05 M Tris-HCI (pH 7,4) blev påført i 5 minutter og intensitet forstærket ved inkubering sektioner i CuSO

4 for 5min. Cellekerner blev modfarvet med Mayers Hematoxylin (Sigma, St. Louis, MO). Polymer-baserede IHC udført på en Bond-Max Autostainer (Leica Microsystems, Bannockburn, IL) som beskrevet [27], bortset fra, at antigen-genvinding blev udført med pepsin og 6.2A1 anti-ανβ6 MAb (0,5 ug /ml) anvendes som primær antistof. Isotype IgG1 (R 0,001); signifikant højere i frontal sammenlignet med normalt væv (n = 302, s 0,001); og lidt højere i den centrale sammenlignet med tilsyneladende normal mucosa (n = 253, p = 0,049) (tabel 2). Intensiteterne af ανβ6 ekspression mellem endetarmskræft Stage B og C væv viste ingen forskel i hver scoret værdi (figur 1). Ikke-specifik binding blev undersøgt ved hjælp af relevante isotypekontrol MAb’er og blev vist i alle tilfælde at være ligegyldig.

Der var ingen forskel i farvede mønstre inden for hver scoret værdi (0 eller 1 eller 2 eller 3) mellem endetarmskræft Stage B og C væv. (C): IgG1 negativ kontrol. Målestok:. 200 um

Opfølgning detalje

I 110 (30,4%) patienter, som ikke var døde, overlevelse varierede fra 103 måneder til 245 måneder med en medianen af ​​171 måneder. I 243 (67.1%) patienter, som var døde, overlevelsestiden varierede fra 2 dage til 243 måneder med en median på 45 måneder. I 9 (2,5%) patienter, der blev tabt, opfølgning tid varierede fra 3 til 178 måneder med en median på 51 måneder.

Angivelse af ανβ6 og patienterne overlevelse

Kaplan-Meier overlevelse plots viste, at den samlede overlevelse ikke var signifikant relateret til enten central eller frontal ανβ6 udtryk, hverken for trin B og C kombineret eller separat (figur 2 og tabel 3).

Samlet overlevelse af 362 rektal kræftpatienter (kombineret Stage b og C) blev ikke signifikant relateret til centrale (a) eller frontal (b) ανβ6 udtryk.

Angivelse af ανβ6 og klinisk-patologiske træk

vurderingen af korrelation mellem integrin ανβ6 udtryk og klinisk-patologiske træk viste, at ανβ6 udtryk ikke var forbundet med nogen klinisk-patologisk funktion (tabel 3).

klinisk-patologiske funktioner i Stage B og C endetarmskræft patient

Samlet overlevelse var signifikant formindsket hos patienter på 75 år eller ældre, dem, der havde en Hartmanns operation, dem med mucinøse eller signetring tumorer, når en apikal lymfeknude var involveret, da ≥4 noder var involveret, dem med Stage C tumor , i høj kvalitet tumorer, i overværelse af venøs invasion, når en tilstødende organ eller struktur var blevet infiltreret af tumor, og hos patienter, som ikke modtog adjuverende kemoterapi. Association mellem klinisk-patologiske træk og samlet overlevelse i de 362 patienter er vist i tabel 4.

Påvisning af ανβ6 hjælp polymer-baserede IHC

Polymer-baserede IHC blev udført soley til opdage ανβ6 savnet af ABC IHC test. Dette var en undersøgende redskab til at bestemme kun ανβ6 farvning intensitet og blev ikke brugt til at måle patientens overlevelse. En sammenligning af fordelinger af integrin ανβ6 farvning intensiteter af de to IHC teknikker viste, at ανβ6 udtryk ved hjælp af polymer baserede IHC fandt sted i mere end 90% af alle patienternes væv i alle vurderinger (tabel 5).

Discussion

i denne undersøgelse viser vi, at fordelingen af ​​integrin ανβ6 ekspression var signifikant højere i den invasive foran tumoren sammenlignet med den centrale region i tumoren (p 0,001) eller histologisk normal mucosa (p 0,001) i 362 rektal kræft Stage B og C. imidlertid blev klinisk-patologiske træk og samlet overlevelse ikke statistisk forbundet med integrin ανβ6 udtryk. Denne observation står i modsætning til tidligere rapporter tyder på, at ανβ6 ekspression er ofte forbundet med ringe overlevelse i forskellige cancere [3], [6], [11], [26], [28]. Imidlertid blev de øvrige ανβ6 undersøgelser udført på tumorer på tværs af flere Stages (dvs., Stages A til D), mens vores undersøgelse kun fokuseret på Stage B og C, og for første gang udelukkende på rektal cancer prøver.

CRC er en ødelæggende sygdom, hvis protein molekylære biosignaturer er langsomt ved at blive undersøgt. En forståelse og detektion af disse kan hjælpe rettidig diagnose, prognose og behandling af CRC [2]. Det er velkendt, at metastase er den største årsag til dødelighed og en førende årsag til svigt af anticancerterapier [29]. Faktisk er det fastslået, at en fænotypisk histologisk observerbar skift fra et ikke-metastatisk (fase B) til nodal metastatisk (fase C) er korreleret med dårlig overlevelse [1]. På molekylært niveau, er kontakten af ​​cancerceller fra en epitelial til en mesenchymal fænotype kombineret med nedbrydning af ECM og andre afgørende biologiske processer, der letter metastaser. Nøgleregulatorer som kan modulerer disse biologiske processer er tab af E-cadherin, aktivering af TGF-β1, stigninger i proteolytiske systemer, som MMP’er, urokinase plasminogen aktivator (uPA) og uPA receptoren (uPAR) [13], [30]. Vigtigere, integrin ανβ6 er stærkt forbundet med mange af de processer disse regulatorer virker på, herunder MAPK-vejen, en af ​​de primære signalveje impliceret i transformation, proliferation, invasion og metastase af CRC [3], [31]. F.eks ανβ6 aktiverer TGF-β1 ved at frigive dette protein fra en inaktiv kompleks [3]. Det er derfor ikke overraskende, at ανβ6 overudtrykkes primært i prolifererende epitelceller hvor den aktiverer og fremmer “drivere” af metastase. Vores seneste upubliceret arbejde tyder på, at ανβ6 interagerer med andre proteiner, der findes opreguleret i CRC (fx uPAR), og dette er nu blevet bekræftet af nærhed ligeringsassayet og peptid array. Det vides ikke, om interaktion med andre molekyler kan modulere biologi ανβ6 eftersom uPAR er en multi-funktionel celleoverfladereceptor involveret i både ECM nedbrydning og cellulær signalering [32], samt at det er en dårlig prognostisk faktor CRC overlevelse [ ,,,0],33].

Ikke kun gøre vores resultater rekapitulere tidligere undersøgelser påviser ανβ6 udtryk i prolifererende epitelceller, men de bekræfter, at ανβ6 er epitel-begrænset i endetarmskræft. Tidligere undersøgelser viste, at ανβ6 ekspression blev koncentreret ved den invaderende kant af ovarietumor og orale pladecellecarcinomer [8], [9], [34]. Vores resultater bekræfter, at ανβ6 er også mere kraftigt udtrykt på den invasive front i endetarmskræft end i centrale områder i rektal tumorer og /eller normal slimhinde tyder ανβ6 spiller afgørende roller i tumor celle invasion.

Denne undersøgelse fokuserede på afgrænse hvis i endetarmskræft udtryk for ανβ6 kunne være en markør for en tumor overgang fra Stage B til Stage C. to IHC farvningsprotokoller blev gennemført, og data fra ABC-baserede IHC bekræftet, at integrin ανβ6 var ikke en uafhængig prognostisk markør i disse to faser , var heller ikke korreleret med nogen klinisk-patologisk funktion undersøgt. Dette resultat var i strid med forventninger, fordi ανβ6 tidligere har haft en positiv sammenhæng med patientens overlevelse i en række kræftformer. Specifikt har ανβ6 blevet identificeret som en prognostisk indikator for ringe overlevelse i CRC [11], gastrisk adenocarcinom [6], [26] og cervikal pladecarcinom [28], hvor CRC og gastrisk carcinoma undersøgelser var baseret på tumor trin I gennem IV og den cervikale pladecarcinom var på patienter identificeret som FIGO Stage IA gennem IIB (svarende til TMN fase i-II). Fra dette CRC studie (n = 488) [11], Kaplan-Meier plot viste, at ανβ6 var stærkt forbundet med overlevelse i fase tumorer tidligt (fase I-II), men ikke for de senere fase tumorer (Stage III-IV). Ligeledes en undersøgelse af 300 gastrisk karcinom patienter [26] viste, at ανβ6 var en potentiel risikofaktor i både tidlige (fase I-II) og sent (Stage III-IV), med overlevelse mere signifikant associeret i tidligere end senere tidspunkt. En nylig gastrisk karcinom undersøgelse (n = 51) [6] også demonstreret ανβ6 var en dårlig prognostisk faktor, men overlevelse blev ikke signifikant associeret med stadium. Desuden livmoderhalskræft undersøgelse (n = 85) [28] angivne ανβ6 er en ugunstig prognostisk faktor hos patienter mellem FIGO Stage IA2-IB1 og IB2-IIB. Samlet set er udtryk for ανβ6 foreslået at være involveret i de tidligere stadier af tumor progression frem de senere faser, men vores data viser, at ανβ6 udtryk ikke stiger mellem endetarmskræft Stages B og C, men kan forekomme tidligere.

Desuden sammenligning af to alternative farvningsprotokoller (polymerbaseret versus en ABC IHC metode) viste mere følsom polymer-baserede amplifikationsmetode detekteret ανβ6 ekspression i næsten alle ( 90%) rektal cancer Stage B og C væv. Disse data understøtter også, at ανβ6 udtryk kan forekomme tidligere end anticiptaed i CRC progression, nemlig før eller under trin B kræft.

Tidligere undersøgelser fundet ανβ6 udtryk er lav eller udetekterbar i normal voksen epitel, men er stærkt til udtryk under sårheling og /eller kræft [3], [8], [34], potentielt forklare, hvorfor ανβ6 bliver udforsket som et interessant mål for kræft billeddannelse og terapi [35]. Her, ανβ6 blev observeret i næsten alle histologisk normale rektale slimhinde mindre end 1-2 cm fra tumoren margin (dvs. hosliggende ikke-neoplastisk slimhinde, hvilket antyder, at EMT-associerede forandringer, som sker i dette væv). Den iagttagelse, at tilsyneladende tilstødende ikke-neoplastiske slimhinde udtrykker andre antigener involveret i cancer progression (f.eks EMT) understøttes af en undersøgelse, som viser EMT markører (α-glatmuskelactin SNAIL) og EMT-induktorer (MMP2 TGF-β3 ) er udførligt udtrykkes i histologisk normale væv proksimalt til brysttumor margener (dvs. = 1 cm væk) samtidig kun sparsomt udtrykt i en afstand på 5 cm fra den samme tumor margener [36]. Denne undersøgelse nøje flugter med vores nuværende observationer af ανβ6 bliver udtrykt i 1 cm rektal kræft marginer, som ανβ6 også er kendt for at være involveret i EMT [14].

Som konklusion, integrin ανβ6 er oftere udtryk på invasiv foran rektal cancer. Selv om det sandsynligvis spiller en vigtig rolle i tumor progression, er denne integrin ikke fungere som en uafhængig prognostisk markør i endetarmskræft Stage B og C. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afgrænse proteiner udtrykkes differentielt i forskellige stadier af endetarmskræft.

tak

forfatterne takker Paul H. Weinreb og Sheila M. Violette, fra Biogen Idec Inc., Cambridge center, Cambridge, MA 02142, USA for venligt at give 6.2A1 antistof mod integrin αvβ6.