PLoS ONE: Identifikation af Gene Expression Signature moduleret af Nicotinamid i en mus blærekræft Model

Abstrakt

Baggrund

Urinary blærekræft er ofte et resultat af udsættelse for kræftfremkaldende kemiske stoffer såsom rygning. På grund af histologisk lighed, blev kemisk induceret kræft gnaver model i vid udstrækning anvendt til humane studier blærekræft. Tidligere undersøgelser har antydet, at nikotinamid, vandopløseligt vitamin B3, kan spille en central rolle i forebyggelse af kræft gennem aktiviteterne i cellulær reparation. Men til dato, beviser til at identificere de genetiske ændringer af nikotinamid i forebyggelse af kræft er ikke blevet givet. Her vil vi søge efter de molekylære signaturer for forebyggelse af kræft ved nicotinamid hjælp af en N-butyl-N- (4-hydroxybutyl) -nitrosamine (BBN) -induceret urin blærekræft model i mus.

Metode /vigtigste resultater

Via microarray genekspression profilering af 20 mus og 233 humane blære prøver, vi udførte forskellige statistiske analyser og immunhistokemisk farvning for validering. De ekspressionsmønstre for 893 gener associeret med nikotinamid aktivitet i forebyggelse af kræft, blev identificeret ved microarray dataanalyse. Gene netværk analyser af disse 893 gener viste, at

Myc

og dens tilknyttede gener kan være den vigtigste regulator af forebyggelse blærecancer, og genekspression signatur korrelerede godt med protein udtryk data. Sammenligning af genekspression mellem mennesker og mus afslørede, at BBN-inducerede muse blære kræft udviste genekspressionsprofiler der var mere ligner dem af invasive humane blære kræft end for dem med ikke-invasive humane blære kræft.

Konklusioner /betydning

Denne undersøgelse viser, at nikotinamid spiller en vigtig rolle som en kemo-forebyggende og terapeutisk middel i blærekræft gennem regulering af

Myc

onkogen signatur. Nicotinamid kan repræsentere en lovende terapeutisk modalitet i patienter med muskel-invasiv blærekræft

Henvisning:. Kim SK, Yun SJ, Kim J, Lee OJ, Bae SC, Kim WJ (2011) Identifikation af Gene Expression Signature moduleret ved Nicotinamid i en mus blærekræft Model. PLoS ONE 6 (10): e26131. doi: 10,1371 /journal.pone.0026131

Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA

Modtaget: Juni 2, 2011; Accepteret: September 20, 2011; Udgivet: 10. oktober 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (2011 til 0.001.042 og R16-2003-002-01001-02006). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mange blære kræft kan knyttes til kemiske carcinogener, og i de vestlige populationer ca. en tredjedel til halvdelen af ​​blære kræft er forbundet med cigaretrygning [1], [2]. Selvom det forårsagende stof i cigaretrøg er endnu ikke blevet identificeret, er α- og β-naphthylamin mistænkes midler. Som formodede carcinogener for blærekræft, kan aromatiske aminer, såsom β-naphthylamin, 4-aminobiphenyl, benzidin og 2-amino-1-naphthol udgøre op til 20 til 30% af blærekræft tilfælde [3], [4]. Der er to primære kemisk inducerede modeller af urinblæren kræft hos gnavere, som induceres ved indgivelse af N-butyl-N- (4-hydroxybutyl) -nitrosamine (BBN) i enten mus eller rotter [5], [6]. De resulterende tumorer er histologisk ligner den humane sygdom, og manifesterer sig via to forskellige kræftfremkaldende veje; nemlig ikke-muskel-invasiv blærekræft (NMIBC) hos rotter og muskel-invasiv blærekræft (MIBC) i mus [7], [8]. Da humant blærekræft er ofte et resultat af eksponering for kemiske carcinogener, disse gnavermodeller er nyttige for forståelsen human blærecancer. Williams et al illustreret de samlede genekspressionsprofiler af gnavertumorer og forudsat en liste af gener, der er sandsynlige kandidater til at drive blærekræft udvikling og progression [9].

Nicotinsyre er et vandopløseligt vitamin, der tilhører vitamin B familie. Det findes i mange dyre- og plantevæv, og har antihyperlipidæmisk aktivitet. I kroppen er nikotinsyre omdannes til dets aktive form nikotinamid, som er en komponent af coenzymer nikotinamidadenindinukleotid (NAD) og dets phosphatform, NADP. Disse coenzymer spiller en vigtig rolle i væv respiration og i glycogen, lipid, aminosyre, protein, og purin metabolisme. Aktuel forskning tyder på, at nikotinamid, eller vitamin B3, kan spille en central rolle i forebyggelse af kræft gennem sine aktiviteter i cellulære reparation. Førende forskere studerer nikotinamid ernæring tror vitamin viser lovende for behandling og endda forebygge kræft. Myron et al viste, at celler depleteret for nikotinamid udvikle kræft ti gange hurtigere end dem, der fik tilstrækkelige mængder af vitamin [10]. Kost er en vigtig faktor i forekomsten af ​​blærekræft, med både gavnlige og skadelige komponenter, og nikotinamid er en af ​​de gavnlige komponenter. Selvom den optimale dosis af nicotinamid stadig er uafklaret, nicotinamid er også et lovende supplement til kemoterapi på grund af dens forhold til tumor nekrose (aflivning) faktor, en relativt ny faktor, der selektivt dræber cancerceller [11], [12], [13] . I den aktuelle undersøgelse, søgte vi at identificere de genetiske underskrifter nikotinamid i forebyggelse af kræft ved hjælp af et BBN-induceret mus blærekræft model, og undersøgt den potentielle effekt af nikotinamid behandling hos patienter blærekræft.

Materialer og metoder

Mus vævsprøver

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Institutional Animal Care udvalg Chungbuk nationale Universitet (tilladelse numre: CBNUA-030-0901-02). C3H /He-mus blev opnået fra Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japan) ved 6 uger gamle og blev holdt i bure (fem i hvert bur). Dyrene blev holdt i et oplyst rum i 12 timer hver dag, holdt ved 23 ± 2 ° C og 55% ± 5% fugtighed. BBN blev opnået fra Tokyo Kasei Kogyo Co. (Tokyo, Japan), og nicotinamid blev købt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). BBN blev fortyndet med ledningsvand til en slutkoncentration på 0,05%. Til analyse af de forebyggende virkninger af nikotinamid blev drikkevand suppleret med 0,1%, 0,25%, 0,5% eller 1% nicotinamid med eller uden 0,05% BBN i 20 uger. Alle mus modtog den første behandling ved 7 uger gamle, og blev aflivet efter 20 uger efter den første behandling. Ved obduktion blev de urinblærer af mus oppustet med normalt saltvand og derefter fjernet, og under en høj intensitet lys blev undersøgt for makroskopiske læsioner. Efter inspektion blev alle blærer frosset til histopatologisk undersøgelse og efterfølgende molekylære analyser. En portion af hvert væv blev fikseret og forarbejdet til rutinemæssig paraffin indlejring, skåret i 5-um snit, og monteret til hematoxylin og eosin-farvning for histopatologi. Blære tumorer blev klassificeret i NMIBC og MIBC baseret på omfanget af invasionen i musklen.

RNA ekstraktion, microarray eksperimenter, og databehandling

Samlet RNA blev isoleret ved hjælp TRlzol reagens (Life Technologies, NY) ifølge fabrikantens protokol. Kvaliteten og integriteten af ​​RNA blev bekræftet ved agarosegelelektroforese og ethidiumbromidfarvning, efterfulgt af visuel undersøgelse under ultraviolet lys. Fem hundrede ng total RNA blev anvendt til mærkning og hybridisering ifølge fabrikantens protokoller (Illumina Mouse-6 BeadChips, version 1.0). Arrays blev scannet med en Illumina Bead Array Reader konfokal skanner (BeadStation 500GXDW, Illumina, Inc., San Diego, CA) ifølge producentens instruktioner. Efter scanning blev microarray data filtreres af detektion

P

-værdi (

P

0,05), som blev leveret af Genome Studio

TM software (Illumina, Inc., San Diego , CA) og blev normaliseret ved hjælp fraktil normalisering i R-sproget miljø (version 2.10.0, tilgængelig på https://www.r-project.org/). Målt genekspression værdier blev log2 transformeret og median-centreret tværs gener og prøver. Det fulde microarray datasæt er tilgængelige i National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) offentlig database under dataserier tiltrædelse nummer GSE21636. Alle microarray data Mindste oplysninger om en Microarray Experiment (MIAME) kompatibel.

Menneskelig blære kræft microarrays

For sammenlignende analyse af mus og human cancer, vi brugte en tidligere offentliggjorte data sæt af menneskelige blære cancer microarrays (koreansk kohorte), GSE13507, fra den offentlige database NCBI GEO [14]. Datasættet bestod af 165 primære blærekræft prøver (103 NMIBCs og 62 MIBCs), 58 prøver af histologisk normalt udseende omgivende væv, og 10 normal blære slimhinde fra patienter med benigne sygdomme. Disse genekspression data blev bygget på Illumina HumanWG-6 BeadChips (version 2). For yderligere validering, vi brugte også et andet menneske blærekræft datasæt (spansk kohorte, Affymetrix U133A GeneChip), som bestod af 24 NMIBCs, 66 MIBCs og 38 normale blære slimhinder [15].

Fast tid revers transkriptase-polymerase kædereaktion (RT-PCR) analyse

RT-PCR blev udført under anvendelse af en Rotor Gene 6000 PCR-system (Corbett Research, Mortlake, Australien). RT-PCR-reaktioner i mikro-reaktionsrør (Corbett Research) indeholdt primere og SYBR Premix EX Taq (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). Spektrale data blev taget til fange og analyseret ved hjælp af Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0 Build 14 (Corbett Research). Genekspression blev normaliseret til

GAPDH

udtryk.

immunhistokemisk analyse

immunhistokemisk farvning blev udført på formalinfikserede, paraffinindlejrede eksemplarer af mus normale og tumor blærer. Snit blev inkuberet med de primære antistoffer anti-Myc (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) og anti-PMP22 (Abcam, UK). For automatisk farvning, Benchmark XT autostaineren (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) blev anvendt. Efter farvning vi evalueret både farvningsintensitet og andelen af ​​farvede epitelceller. Farvning intensitet blev klassificeret som følger: 1, svag; 2, moderat; og 3, stærk. Andelen af ​​positive celler blev udtrykt som en procentdel af det samlede antal epitelceller undersøgte, og henføres til en af ​​fem kategorier: 0, 5%; 1, 5-25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; og 4, 75%. Scores for procentdelen af ​​positive celler og farvningsintensitet blev ganget sammen om at producere immunoreaktiviteten score (IS) til hver prøve. IS af Myc og PMP22 blev målt i kernen og cytoplasmaet, hhv. Hver prøve blev undersøgt og scoret separat af tre efterforskere, og afvigende scoringer blev drøftet indtil der blev opnået enighed.

Western blot-analyse

Efter skylning i destilleret vand, prøver i glasrør indeholdende 1 ml cellelysebuffer var mekanisk homogeniseret med en vævshomogenisator. Homogenatet blev overført til et 1,5 ml rør og blev centrifugeret ved 14.000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Den øvre vandige fase blev kasseret, og blandet med 2 yl phenylmethylsulfonylfluorid og 200 ul af proteinanalyse puffer. Efter inkubation i 1 time ved 4 ° C blev prøverne centrifugeret ved 14.000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C. Den øvre vandige fase blev overført til nye rør og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Proteinkoncentrationer blev bestemt ved Bio-Rad proteinassay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Hver prøve (70 ug) blev sat på 10% (vægt per volumen) natriumdodecylsulfat-gel og overført til polyvinylidenfluoridmembran (GE Healthcare, San Antonio, TX). Western blots blev analyseret med antistoffer mod PMP22 (Abcam, Cambridge, UK) og Myc (LifeSpan Biosciences, Seattle, WA).

Statistisk analyse

For at sammenligne de molekylære egenskaber mellem forskellige mus grupper, udførte vi en hierarkisk klyngedannelse analyse. En hierarkisk clustering algoritme, ved hjælp af den centrerede korrelationskoefficienten som mål for lighed og gennemsnitlig binding klyngedannelse, blev påført som beskrevet i Eisen et al [16]. Vi identificerede gener, som blev differentielt udtrykt mellem to grupper anvendelse af et vilkårligt varians to stikprøver t-test [17]. Gener blev anset for at have statistisk signifikante forskelle i ekspression hvis P-værdien var mindre end 0,001. Vi udførte også en global test af, om de udtryk profiler afveg mellem klasserne ved at udføre permutationer. For hver permutation blev

P Salg -værdier genberegnes og antallet af gener signifikant på 0,001 niveau blev bemærket. Andelen af ​​permutationer, der resulterede i mindst lige så mange væsentlige gener som de faktiske data blev taget som signifikansniveau den globale test. Mens opnå differentielt udtryk gener, valgte vi gener, der havde en 1,2 gange eller mere forskel på betyde udtryk værdier på to grupper.

At udforske forholdet mellem tumorigene gener, der responderede på nikotinamid, vi undersøgte funktionelle foreninger blandt generne og genererede gen netværk baseret på, om de havde flere indbyrdes forbundne gener, end man ville forventes at forekomme ved en tilfældighed. Betydningen af ​​hvert netværk blev estimeret ved hjælp af den scoring system, som Ingenuity Pathway Analysis Tool (version 7.5). Pointene blev bestemt ved antallet af differentielt udtrykte gener inden for hver af de netværk og styrken af ​​foreninger blandt netværkets medlemmer.

Som et middel til at sammenligne genekspressionsmønstre mellem humane og murine prøver, den microarray data af mus modeller blev samlet med datasættet af humane blære kræft ved hjælp HomoloGene (NCBI), et system til detektering af de homologe gener i flere eukaryote genomer [18]. Før integration af de to datasæt blev ekspressionsniveauerne af hvert gen i hvert datasæt standardiseret uafhængigt til en middelværdi på nul og en standardafvigelse på 1. For at forudsige musemodeller mod humane væv, vi anvendt fire forskellige forudsigelsesmodeller: forbindelse kovariat forudsigelse [19], lineær forskelsbehandler analyse [20], nærmeste tyngdepunkt klassificering [20], og support vektormaskine [21]. Modellerne indarbejdet gener, blev differentielt udtrykte mellem de to klasser med en to-prøve t-test. Gener blev anset for at have statistisk signifikante forskelle i udtryk, hvis

P

-værdi var mindre end 0,001. Vi skønnede forudsigelse fejl af hver model med leave-one-out cross-validering (LOOCV), som beskrevet af Simon et al [22]. For hver LOOCV træningssættet blev hele model-bygning procedure gentages, herunder genet udvælgelsesprocessen. forudsigelse procedure Cross-arter blev udført i BRB ArrayTools (version 3.8.0).

Resultater

Effekten af ​​nikotinamid som et beskyttende middel mod BBN-inducerede muse blære kræft

for at undersøge effekten af ​​nicotinamid på tumordannelse i BBN-induceret blærekræft model, fik mus 0,05% BBN alene eller BBN plus stigende koncentrationer af nikotinamid i deres drikkevand i 20 uger (figur 1A). Mærkbart, nicotinamid tilskud inhiberede tumordannelse. Supplering med 0,5% nikotinamid reduceret tumordannelse forhold fra 100% til 74%, og 1% nikotinamid reducerede forholdet yderligere til 52% (figur 1B). Histologisk analyse af blæretumorer fra de forskellige behandlingsgrupper viste, at udviklingen af ​​MIBC blev markant inhiberet af nikotinamid. Behandling med 0,1% nikotinamid reducerede forekomsten af ​​MIBC fra 88 til 42%, og 1% nikotinamid reduceret det yderligere, at 12% (figur 1B), hvilket indikerede, at nikotinamid kraftigt inhiberer blære tumorprogression. Tumorvolumen blev også bemærkelsesværdigt reduceret med nikotinamid. De fleste af de BBN-behandlede mus udviklede store tumorer (gennemsnitlig størrelse, 129 mm

3). Forøgelse behandling af nikotinamid reducerede signifikant den gennemsnitlige tumorstørrelse (99 til 18 mm

3 når 0,1 til 1% nicotinamid blev behandlet, figur 1C). Disse resultater viste, at nikotinamid effektivt forhindrer tumor dannelse og undertrykker tumorvækst og progression til MIBC.

(A) Eksperimentel protokol for analyse af de præventive virkninger af NC. Mus blev behandlet med BBN alene eller i kombination med de angivne mængder af NC i 20 uger. “N” angiver antallet af mus i hver gruppe. En dosis på 0,1% NC i drikkevand svarer omtrent til 100 mg /kg /dag. (B) Oversigt over forekomsten af ​​tumor dannelse, non-muskel invasiv blærekræft (NMIBC), og muskel invasiv blærekræft (MIBC) for hver behandlingsgruppe. Antallet over hver bar angiver antallet af mus i hvert histologiske kategori. (C) Boksen plot sammenligne tumorvolumener af behandlingsgrupperne.

P

-værdier blev opnået ved to sample t-test mellem gruppe G1 og andre grupper.

Differential genekspressionsmønstre blandt forsøgsgrupper

For at karakterisere genekspression mønstre af nikotinamid i forebyggelse af kræft, vi tilfældigt vælge 20 mus blærer og udført en genekspression profilering; fem BBN-inducerede muse blæretumorer (MIBCs fra gruppe G1, figur 1A), fem ikke-tumorbærende blærer behandlet med BBN og nikotinamid (normale prøver fra gruppe G5, figur 1A), fem normale blærer behandlet med 1% nikotinamid (Gruppe G6 i figur 1A), og fem normale blærer uden behandling (gruppe G7 i figur 1A). De 5 prøver i hver gruppe var histologisk identiske hinanden. Vi anvendes først hierarkisk clustering analyse af genekspressionsmønstre at vurdere de molekylære karakteristika af de forskellige forsøgsgrupper. Som forventet hierarkisk klyngedannelse analyse af genekspression data fra alle væv viste tre store klynger, hvoraf den ene er normal blære, en anden repræsenterer BBN-inducerede muse blære tumor gruppe, og en tredje repræsenterer BBN + nicotinamid-behandlede ikke-tumorigene blære gruppe (figur S1). Således genekspressionsmønstre afspejler den molekylære konfiguration er let skelnes mellem blæretumorer og ikke-tumorvæv.

Vi næste formål at identificere gensæt der blev differentielt udtrykte blandt de tre forskellige grupper. Før analyse blev normale blærer behandlet med nikotinamid udelukket, da der var ingen histopatologiske eller molekylære forskelle mellem normal og nikotinamid-behandlede blære (Figur S1). Vi anvendte Venn-diagram sammenligning af to gen lister at vælge genekspression mønstre fælles for carcinogenese og forebyggelse af kræft. Først genererede vi to forskellige gen lister ved at anvende to-stikprøve t-test (figur 2A,

P

0,001). Gene liste A repræsenterer de gener, som blev differentielt udtrykt mellem den normale blære og BBN-inducerede tumor-grupper, og gen liste B repræsenterer de gener der blev differentielt udtrykte mellem BBN- og BBN + nicotinamid-behandlede grupper. Når man sammenligner de to gen lister blev tre forskellige mønstre observeret: A ikke B (3.344 gener), A og B (893 gener), og B ikke A (1.115 gener) (Figur 2B). Gener i A ikke B kategori viste BBN-inducerede tumor-specifikke ekspressionsmønstre, mens gener i B ikke en kategori vises udtrykket mønstre af gener, der reagerede på nikotinamid. Generne i A og B kategori udviste både BBN-induceret tumorigene samt nicotinamid-responsiv ekspressionsmønstre. Disse resultater betød, at 893 gener i A- og B-kategori var fælles for både carcinogenese induceret af BBN og til forebyggelse af kræft fremkaldt af nikotinamid.

(A) Venn-diagram af gener udvalgt af to stikprøver t-test i musemodellen. Den lilla cirkel (gen liste A) repræsenterer gener udtrykkes differentielt mellem normale blære væv og N-butyl-N- (4-hydroxybutyl) -nitrosamine (BBN) -inducerede blæretumorer. Den blå cirkel (gen liste B) repræsenterer gener udtrykkes forskelligt mellem BBN-inducerede blæretumorer og BBN + nikotinamid (NC) behandlet ikke-tumorvæv. Vi anvendte en cut-off

P

-værdi på mindre end 0,001 for at vælge gener, hvis udtryk var signifikant forskellig mellem de to grupper. (B) ekspressionsmønstre for udvalgte gener i Venn-diagram. Blandt generne i A ikke B kategori, 1.525 gener (45,6%) viste up-down mønstre og 1.819 gener (54,4%) viste down-up mønstre i normal og BBN-induceret kræft. I A og B kategori, 290 gener (32,5%) og 603 gener (67,5%) udgjorde ned-up-down mønstre og op-ned-op mønstre henholdsvis i normal, BBN-induceret kræft, og BBN + NC behandlede blære grupper. I B ikke en kategori, 606 gener (54.3%) vises down-up mønstre og 509 gener (45,7%) udstillet up-down mønstre i BBN-induceret kræft og BBN + NC-behandlede blære grupper. Dataene er præsenteret i matrix-format, hvor rækker repræsenterer individuelle gener og kolonner repræsenterer hver væv. De røde og grønne farver afspejler høje og lave ekspressionsniveauer henholdsvis.

Biologisk indsigt til genekspression mønstre for forebyggelse af kræft

For at identificere de fremherskende signalering netværk er aktive i forebyggelsen af blærekræft ved nikotinamid, gen netværk analyse af de 893 gener i forebyggelse af kræft signatur (figur 2) blev udført under anvendelse Ingenuity

TM Pathways Analysis software. Af de 893 gener, blev 477 kortlagt til gen net defineret som dette værktøj. Denne analyse afslørede en række formodede net og tilhørende funktionelle kategorier. De 10 formodede netværk med den højeste score er anført i tabel S1 og deres tilknyttede funktioner er illustreret i figur S2.

Som forventet, gener involveret i carcinogenese-relaterede funktioner som cellulær vækst og proliferation, cancer, celledød , og DNA-replikation og -reparation blev beriget, giver tillid til vores resultater. Vi fandt også, at gener involveret i inflammatorisk respons, cellemedieret immunrespons, infektionssygdom, inflammatorisk sygdom, og immunologisk sygdom var også til stede i stort antal. Interessant nok blev observeret en signifikant overflod af gener involveret i skelet /muskulære system udvikling og lidelser (figur S2).

Undersøgelse af de berigede gener afslørede flere vigtige signalsystemer netværk (tabel S1), det mest slående, som viste fremherskende aktivering af

Myc

, en af ​​de onkogene signaturer (figur 3).

Myc

dannede primære hub af genet netværk, med den højeste tilslutning til resten af ​​generne i netværket, hvilket antyder, at

Myc

kunne være en kritisk molekylær betydning både carcinogenese induceret af BBN og cancer forebyggelse induceret af nikotinamid. Mange af de satellit gener forbundet til

Myc

(dvs.

MSH6

[

MSH6

],

MetAP2

[

MetAP2

] ,

LMNB1

[

Lmnb1

],

HK2

[

HK2

],

PPAT

[

Ppat

],

PGK1

[

PGK1

],

CCT2

[

Cct2

], og

PMP22

[

PMP22

]) (Figur 3) deltage i tumorigenese, celledeling, cellevækst eller apoptose, som svarer til de mest kendte aktiviteter

Myc

. Disse resultater kraftigt indikerede, at onkogen funktion af

Myc

og dens tilknyttede gener kan være reguleret af nikotinamid behandling for at forhindre blære carcinogenese.

Up og ned-regulerede gener i mus blære kræftformer er angivet i rød og grøn, hhv. Intensiteten af ​​farven er indikativ for graden af ​​over- eller under-ekspression. Gener uden fremhævede farve er ikke en del af progression signatur, men er forbundet med de regulerede gener. Hver linje og pil repræsenterer funktionelle og fysiske samspil mellem generne og retningen af ​​regulering rapporteret i litteraturen.

Validering af

Myc

signatur for forebyggelse af kræft ved nikotinamid

for at validere vores nyligt identificerede genekspression signatur for forebyggelse af kræft ved nikotinamid, vi desuden udført genekspression og protein udtryk analyser. Blandt generne i

Myc

signatur identificeret ved hjælp af gen-netværk analyse (figur 3),

Myc

som en primær hub onkogen og

PMP22

som et tumor-undertrykt gen, som har det stærkeste signal intensitet blev valgt til validering, og resultaterne er vist i tabel 1 og figur 4.

realtid revers transcriptase polymerase kædereaktion (RT-PCR) analyse blev udført efter

Myc

(A) og

PMP22

(B). Forskelle (

P

-værdier) mellem muse-grupper blev opnået ved to-prøve t-test. Y-aksen viser (udtryk forholdet hvert gen /

GAPDH

) × 1000. Immunohistokemisk analyse af Myc (C) og PMP22 (D) blev udført for at bekræfte protein ekspressionsniveauer. Påvisning af Myc (E) og PMP22 (F) proteinekspression blev også bestemt ved Western blot analyse.

Vi først udført genekspression analyse ved RT-PCR. Ekspressionsniveauerne af

Myc

i BBN-induceret blærekræft gruppe var signifikant højere end normalt eller BBN + nicotinamid-behandlede grupper (

P

0,001 og P = 0,02 ved to prøve t test henholdsvis figur 4, A). På den anden side, ekspressionsniveauerne af

PMP22

i BBN-induceret blærekræft gruppe blev signifikant reduceret sammenlignet med normal eller BBN + nicotinamid-behandlede grupper (

P

= 0,02 og P = 0,03 af to prøve t-test henholdsvis figur 4, B).

For at afgøre om genekspression signatur identificerede vi enige med protein udtryk niveauer blev immunhistokemisk analyse. Vi observerede, at Myc blev højt udtrykt i cytoplasmaet af normale muse urothelium celler, men blev ikke udtrykt i kernen. Myc var primært lokaliseret til kernen af ​​tumorcellerne i BBN-inducerede muse blære tumor. Både en nuklear og et cytoplasmisk fordeling af Myc blev observeret; Imidlertid er antallet af Myc-positive kerner i muse urothelium behandlet med BBN og nikotinamid var signifikant lavere end i BBN-induceret blære tumor, og den cytoplasmatiske farvning intensitet Myc i enten BBN gruppe var svagere end i normalt urothelium (figur 4, C og tabel 1). Vi fandt også, at PMP22 blev fordelt i cytoplasmaet af normal mus urothelium, mens der ikke var nogen beviser for enten cytoplasmatisk eller nukleær ekspression af PMP22 i BBN-inducerede muse blære tumor. I BBN + nicotinamid-behandlede urothelium, blev cytoplasmatisk PMP22-ekspression observeret; dog var niveauet af PMP22 udtryk reduceret i forhold til at det ved normal urothelium (figur 4, D og tabel 1).

Vi udførte også western blots for Myc og PMP22 til strengt kontrollere vores genekspression profilering analyse. På Western blot-analyse, blev Myc stærkt udtrykt i BBN-inducerede muse blære tumor gruppen sammenlignet med normale og BBN + nicotinamid-behandlede ikke-tumorigen blære gruppe, men Myc ekspression viste ingen forskel mellem den normale og den BBN + nicotinamide- behandlet nontumorigene blære gruppe. På den anden side, PMP22 ekspressionsniveau i normal blære-gruppen var signifikant højere end i BBN-inducerede muse blære tumor gruppe. Selv PMP22-ekspression blev observeret i BBN + nicotinamid-behandlede ikke-tumorigen blære gruppe, blev niveauet af PMP22-ekspression reduceres i forhold til det ved normal. Disse resultater indikerede, at ændringer i protein ekspressionsniveauer af

Myc

og de tilknyttede gener stemte godt med ændringerne i genekspressionsniveauer afsløret af microarray analyse. Resultaterne gav også stærke beviser for pålideligheden af ​​identifikation genekspression signatur.

Sammenligning af genekspression mellem menneskelige og mus blære kræft

I betragtning af de tre forskellige undergrupper af musen eksperimentelle model, vi undersøgt, hvor godt disse modeller rekapitulere menneskelige blærekræft fænotyper som defineret af genekspression mønstre. Fordi to forskellige microarray platforme blev brugt til at studere mus og human blærekræft (koreansk kohorte), valgte vi homologe gener, der var til stede i begge microarrays bruger HomoloGene, der indeholdt oplysninger om homolog mus og humane gener. I alt 11,565 homologe gener var til stede i begge microarrays. I hierarkisk klyngedannelse analyse af de integrerede data blev de tre subgrupper godt adskilt fra hinanden (figur 5). Undtagen for kun én mus prøve, gen-ekspressionsmønstre for blæren i normale mus og BBN + nicotinamid-behandlede mus var meget lig dem af den normale slimhinde eller slimhinden omkring (støder op til) cancere i human (klynge I i figur 5). I modsætning hertil ekspressionsmønstre for muse blære kræft fra BBN-inducerede tumor gruppe var meget lig dem af MIBCs hos mennesker (klynge III i figur 5).

Gener med udtryk værdier, der havde en standardafvigelse på mindst 0,9 blev udvalgt til hierarkisk analyse (1.059 gen faciliteter). De røde og grønne farver afspejler høje og lave ekspressionsniveauer hhv. BBN, NC, NMIBC, og MIBC indikerer N-butyl-N- (4-hydroxybutyl) -nitrosamine, nicotinamid, non-muskel invasiv blærekræft, og muskel invasiv blærekræft, henholdsvis.

Vi næste anvendt overvågede læringsmetoder at validere opsyn cluster analyse. Vi anvendte fire uafhængige forudsigelse metoder til at afgøre, hvilke af musemodeller bedst kan efterligne menneskelige fænotyper. Vi brugte genekspression datasæt fra de to underklasser af menneskelige blærer til at træne forudsigelse metoder (Normal vs MIBC, NMIBC vs. MIBC, og Normal vs NMIBC). Alle forudsigelsesmetoder forudsagt, at de fleste normale og BBN + nicotinamid-behandlede mus blærer er forholdsvis magen til normal slimhinde eller slimhinden omkring (støder op til) cancere i human, hvorimod BBN-inducerede muse blære kræft er forholdsvis magen til MIBC i human (tabel 2) . Hertil kommer, når vi anvendte beregningsmetoder trænet med NMIBCs og MIBCs observerede vi, at alle BBN-inducerede muse blære kræft blev forudsagt som MIBC (tabel 2). Endvidere ved anvendelsen forudsigelsesmetoder trænet med normal og NMIBCs fleste BBN + nicotinamid-behandlede mus blærer var forholdsvis ligner normal slimhinde eller slimhinden omkring (støder op til) kræftformer i human (tabel 2).