PLoS ONE: Stanniocalcin-1 Regulerer Ekstracellulær ATP-induceret Calcium Waves i Human epitelcancerceller ved at stimulere ATP Frigivelse fra tilskuerplacering Cells

Abstrakt

Baggrund

epitelcelle reaktion på stress involverer transmission af signaler mellem tilstødende celler, som kan visualiseres som en calcium bølge. I nogle celletyper, denne bølge er afhængig af frigivelsen af ​​ekstracellulære trinukleotider fra beskadigede celler. Især har ekstracellulær ATP blevet rapporteret at være kritisk for epitelcelle reaktion på stress og er for nylig blevet vist at være opreguleret i tumorer

in vivo

. Salg

Metodologi /vigtigste resultater

Her identificerer vi stanniocalcin-1 (STC1), et udskilt pleiotropiske protein, som en kritisk mediator af calcium bølge formering i monolag af pulmonal (A549) og prostata (PC3) epitelceller. Tilsætning af STC1 forbedret og blokering STC1 faldt den afstand, som et ekstracellulært calcium bølge ATP-afhængig. blev observeret de samme virkninger, når calcium blev stimuleret ved tilsætning af exogene ATP. Vi afdækker en positiv spiral, hvor STC1 fremmer frigivelse af ATP fra cellerne

in vitro

in vivo

.

Konklusioner /Betydning

resultaterne viste, at STC1 spiller en vigtig rolle i den tidlige respons på mekanisk skade ved epitelceller ved at modulere signalering af ekstracellulær ATP. Dette er den første rapport til at beskrive STC1 som en modulator eller purinergisk receptor signalering

Henvisning:. Block GJ, DiMattia GD, Prockop DJ (2010) Stanniocalcin-1 Regulerer Ekstracellulær ATP-induceret Calcium Waves i Human epitelcancerceller ved at stimulere ATP Frigivelse fra bystander Cells. PLoS ONE 5 (4): e10237. doi: 10,1371 /journal.pone.0010237

Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget: 16. december 2009; Accepteret: 16 marts 2010; Udgivet: 20. april, 2010

Copyright: © 2010 Block et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af NIH tilskud P40 RR 17447 og P01 HL 075161. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerer eksisterer interesser.

Introduktion

Stanniocalcin-1 (STC1) er en 247 aminosyre protein, der udskilles fra celler, som et glycosyleret homodimer. STC1 blev oprindeligt beskrevet som en endokrin regulator af calcium og phosphat homeostase i fisk [1], [2]. I hvirveldyr, kan STC1 regulere mineralmetabolismen [3] gennem sin modulation af phosphat resorprtion i nyre [4] og tarmen [5]. STC1 blev også impliceret i frakobling af oxidativ phosphorylering [6], inhibering af makrofag migration

in vitro

[7] og

in vivo

[8], forebyggelse af vaskulær permeablization [9], og begge pro- og anti-apoptotiske virkninger [10], [11], [12]. Til dato har en mekanisme, hvormed STC1 udøver sine pleiotropiske virkninger ikke fastlagt. For nylig er det blevet klart, at STC1 er en stress responsiv faktor (Chang et al., 2003), i overensstemmelse med nylige observationer, at STC1 transkriptet hurtigt opreguleret efter skadelige signaler [10], [13], [14] .

rolle STC1 på calcium homeostase og vævsskade antyder det kan være involveret i calcium bevægelse og signalering, der er udløst af en række mekaniske og andre påvirkninger til celler. For eksempel reparation af epitel monolag efter mekanisk afbrydelse er afhængig af en intercellulær kalcium bølge formeret fra stedet for afbrydelse af tilstødende celler [15], [16], [17], [18], [19]. Udbredelsen af ​​calcium bølge er blevet tilskrevet enten til gap-junction medieret overførsel af calcium- eller lav molekylvægt sekundære budbringere, eller til frigivelse af intracellulære nucleotider fra beskadigede celler, der derefter binder til receptorer på naboceller [20], [ ,,,0],21], [22]. Adskillige rapporter vist, at ekstracellulær adenosintriphosphat (ATP) fremmes reparation i de sprængte kulturer ved at stimulere migrering og proliferation af epitelceller [15], [18]. For nylig blev forøgede niveauer af ekstracellulær ATP visualiseret i at udvikle tumorer

in vivo

, og kan bidrage til cancercelleoverlevelse [23].

Ekstracellulære nukleotider modulerer intracellulær calcium ved binding til en familie af receptorer kaldet P2 purinergiske receptorer, som hver har en forskellig affinitet til specifikke nukleotider. Der er to underklasser af P2-receptor: de P2X trimere gatede ionkanaler og P2Y G-protein koblede receptorer (GPCR’er). Binding til en P2X receptor fører til en konformationel ændring i den kanal, der tillader indstrømning af calcium og andre ioner, hvorimod P2Y er en G-protein-koblet receptor, der bruger energien af ​​GTP-hydrolyse til phosphorylere phospolipase C (PLC) efter ligandbinding . PLC kan derefter spalte lipid, phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2), i inositol 1,4,5-trisphosphat (IP3) og diacylglycerol (DAG). IP3 binder specifikke calciumionkanaler på det endoplasmatiske retikulum til at frigive calcium i cytosolen. Af de 12 P2Y-receptorer, kun P2Y

2 har vist sig at både binder ATP og par med G

q G-protein-subunit at initiere frigivelsen af ​​calcium fra intracellulære lagre [24].

her demonstrerer vi, at forbehandling af epitelceller i monolagskultur med STC1 dramatisk forøget calcium bølgeudbredelse efter mekanisk sønderdeling af kulturer. Den samme forbedring blev set, når celler blev forbehandlet med STC1 og eksponeret for eksogen ATP. Vi dokumenterer, at STC1 sensibiliserede cellerne til ATP opstrøms for PLC, og at blokering endogen STC1 anvendelse af et neutraliserende antistof inhiberede progressionen af ​​calcium bølge. Dette arbejde giver den første bevis på, at STC1 kan modulere en tidlig signalering begivenhed efter en mekanisk skade, og implicerer STC1 som en regulator af purinergisk receptor signalering.

Resultater

STC1 Forbedret Calcium Wave Propagation Efter Mekanisk Stimulering af A549 celler

for at undersøge effekten af ​​STC1 om skade-induceret calcium modulation, sammenflydende monolag af lunge epitelceller (A549) var mekanisk stimuleret til at indlede en calcium bølge. Bølgeudbredelse blev visualiseret ved præinkubering monolaget med en membran permeabel farvestof, der fluorescerede efter binding calcium (Fluo-4).

Figur 1A (Film S1 og S2) viser repræsentative billeder af udbredelsen af ​​en calcium bølge stammer fra skrabe websted til tilstødende celler i løbet af 30 sekunder. Afstanden blev kvantificeret ved at måle afstanden mellem de afskårne stedet og forkanten af ​​calcium bølge på hvert tidspunkt. Forbehandling af monolag med STC1 resulterede i en 4-dobling af calcium bølge formering på 40 sekunder efter Skrab (figur 1B), der fortsatte med at udbrede forbi 40 s tidspunkt (Film S2). For at teste, om virkningen var celletypespecifik gentog vi disse undersøgelser i en prostatacancer-cellelinie (PC3, Movie S3, S4). STC1 også forbedret calcium bølgeudbredelse i PC3-celler.

A) Sammenflydende A549-monolag blev mærket med Fluo-4 og præ-inkuberet med eller uden 500 ng /mL STC1 i 10 minutter før mekanisk sprængning. Vist er billeder opnået -1, 0, 10, 20 og 30 s efter afbrydelse. Billeder i hver gruppe blev manipuleret ligeligt hjælp tærsklen funktion i Adobe Photoshop for at falske farver bølgen for klarhed (rød). Pil peger på forkant med bølge. B) Middel distance calcium bølge over tid i kontrol og STC1 behandlingsgrupper fra A. Fejl Bars = SD. * = P 0,05. n = 5 film. C) Gennemsnitlig maksimal afstand nås med calcium bølge med eller uden forbehandling med 500 ng /mL STC2. NS = ikke signifikant. n = 3.

Vi næste undersøgt, om STC2, det eneste andet medlem af stanniocalcin familie af proteiner [25], kan påvirke calcium bølge progression under de samme betingelser. STC2 påvirkede ikke calcium bølge (figur 1C).

Calcium Wave Formering var uafhængig af gap junctions, men Afhængig Ekstracellulær ATP

Calcium bølge formering mellem tilstødende celler har tidligere været tilskrevet lille molekyle overførsel af gap junction intercellulære kommunikation (GJIC) [20], [26]. For at undersøge om GJIC var ansvarlig for calcium bølgeudbredelse, blev A549 monolagene forbehandlet med 10, 25 eller 50 uM glycyrrhetinsyre (GA), en kendt inhibitor af connexin-medieret GJIC [27]. Udbredelsen af ​​calcium bølge blev ikke påvirket, hvilket indikerer, at calcium svar var uafhængig af GJIC (figur S1).

Andre har rapporteret, at calcium bølgeudbredelse var afhængig frigivelse af ATP fra beskadigede celler i det ekstracellulære miljø [18], [28]. For at bekræfte at beskadigede celler frigivet ATP blev monolag skrabet med en pipettespids og det konditionerede medium blev målt for ATP-indhold. Det konditionerede medium indeholdt 400 gange mere ATP end konditioneret medium fra celler, der ikke var blevet skadet (figur 2A). For at bekræfte, at A549-celler var i stand til at reagere på ATP ved at indlede en calcium respons blev Fluo-4 mærkede monolag behandlet med ATP og analyseret af levende celler fluorescerende mikroskopi. ATP behandling hurtigt øgede den gennemsnitlige pixelintensitet af den målte regionen af ​​interesse (Figur 2B). For at undersøge om ATP frigivet fra skrabet celler var ansvarlig for calcium reaktion i levedygtige celler, medier blev fjernet fra A549 monolag og erstattet med PBS. Den monolag blev efterladt uforstyrret at generere “Ingen skade ‘konditioneret medium, eller såret ved at skrabe til at generere” Skade “konditioneret medium. Ingen Skade og skade konditioneret medium blev derefter anbragt på friske Fluo-4 mærkede A549 celler og calcium respons blev målt ved fluorescerende mikroskopi. Skade medium inducerede en mere robust calcium respons end Ingen Skade kontrol (figur 3A; første to rækker). Forbehandling af skade konditioneret medium med et enzym, som hydrolyserer trinukleotider til mononukleotider (250 mU /ml apyrase) fuldstændigt ophævede calcium respons. De samme data blev opnået ved at måle calcium respons i individuelle celler. Igen, forbehandling af skade konditioneret medium med apyrase afskaffet calciumreaktionen (figur 3B). Skade medium også øget den maksimale calcium reaktion i forhold til Ingen Skade kontrol i individuelt målte celler, som blev ophævet ved forbehandling med apyrase (figur 3C).

A) Mean ATP indhold af konditioneret medier fra kontrol eller mekanisk stimuleret A549 monolag. RLU, relative luciferaseenheder. Fejl Bars = SD. * = P 0,05. n = 3. B) ATP (50 uM) alene blev tilsat til konfluerende Fluo-4 mærkede A549-celler (vertikal linje). Calcium respons blev målt ved fluorescensmikroskopi. n = 4 film.

A) konditioneret medium fra levedygtig (Ingen skade), mekanisk forstyrret (Skade) eller mekanisk afbrudt lysat behandlet med 250 mU /ml apyrase i 10 min. (Skade + apyrase) blev anbragt på en sammenflydende lag af Fluo-4 mærkede A549-celler. Venstre kolonne: Før tilsætning af konditioneret medium. Højre kolonne: 10 s efter behandling med konditioneret medium. Forstørrelse = 4 ×. Indsat for hver: Pixel intensitet profil for hele synsfeltet. Inset billeder for hver behandlingsgruppe blev manipuleret ligeligt hjælp tærsklen funktion i Adobe Photoshop for at falske farver toppene for klarhed (rød). n = 3 film. B) Calcium respons på 10 individuelle celler efter tilsætning af Skade eller skade + apyrase (250 mU /ml i 10 min) behandlet konditioneret medium. Sort pil: Tilsætning af konditioneret medium. Red Arrow: Baggrund Intensitet Måling. C) Gennemsnitlig maksimal intensitet for individuelle celler efter tilsætning af Ingen Traumer, Skade, eller Skade + apyrase konditioneret medium. * = P 0,05; n = 30.

STC1 Forbedret ATP-induceret Calcium svar

For at undersøge om STC1 påvirkede ATP-induceret calcium respons, Fluo-4 mærkede A549 monolag blev forbehandlet med 500 ng /mL STC1 i 10 minutter og derefter stimuleret med 50 pM ATP. Calciumreaktionen blev derefter målt ved fluorescensmikroskopi. STC1 forbedret middelværdien fluorescens af et defineret område af interesse med mere end 2-fold (figur 4A). For at underbygge vores mikroskopi resultater, vi kvantificeret calcium respons med fluorescerende spektroskopi, som tilladt os at teste en bredere vifte af koncentrationer af ATP og STC1. A549-celler blev præ-inkuberet med 0, 50, 250, eller 500 ng STC1 i 10 minutter. Efter en 4-sekunders baseline læsning, blev ATP injiceret automatisk i brønde ved en slutkoncentration på 0,5, 2, 10 og 50 uM. STC1 forøgede calcium respons på en dosisafhængig måde; dog ved højere doser af ATP, blev STC1 påkrævet ved højere koncentrationer til at have en forstærkende virkning. Data vises som middelværdi endepunkt calcium respons (figur 4B) samt en kontinuerlig assay spanning 30 s (figur 4C).

A) Mean calciumrespons af Fluo-4 mærkede konfluerende monolag af A549-celler blev analyseret ved levende celler mikroskopi efter tilsætning af 50 uM ATP til at kontrollere (ATP) eller monolag forbehandlet med 500 ng /mL STC1 i 10 minutter (ATP + STC1). Fejl barer = SD. * = P 0,05. n = 3 film. B) Middel calciumrespons af Fluo-4 mærkede A549 monolagene analyseret ved fluorescerende spektroskopi efter tilsætning af forskellige koncentrationer af ATP og STC1. Data er vist som gennemsnit signalintensitet på 25 s efter tilsætning af ATP. Fejl barer = SD. * = P 0,05. n = 4 for hver betingelse. C) vedvarende analyser fra B). n = 3 for B, C. D) Måling af de enkelte celler fra A afsløret længerevarende calcium svingninger i STC1 forbehandlede prøver.

Vi har bemærket, at ATP-induceret calcium svingninger i en lille fraktion (ca. 20%) af celler i hver betingelse. Når cellerne blev behandlet med STC1, disse svingninger fortsatte forbi tre minutter, hvorimod kontrolceller ikke svinge ud over 1,5 minutter. Der var ingen observerbar forskel i hyppigheden af ​​oscillationerne (figur 4D).

STC1 Enhanced calciumrespons Opstrøms PLC Aktivering

nukleotid signalering fører til intracellulær calcium frigivelse kan induceres ved binding af ATP til enten P2X familien af ​​ionkanaler, eller P2Y G-protein-koblede receptorer [24]. For at undersøge, hvilke af disse veje var ansvarlige for calcium induktion i vores model blev Fluo-4 mærkede A549-monolag behandlet med en P2X-antagonist (NF023), eller P2Y pathway antagonister (phosphatidylinositol-specifikke (PI) PLC-hæmmeren, D609, og PLC-hæmmeren , U73122). D609 og U73122 reducerede afstand og intensitet calcium bølge efter mekanisk stimulering ved 20 s efter skrabe (figur 5A, B); dog måling af maksimal afstand tilbagelagt af den bølge viste, at kun U73122 fuldstændigt inhiberede calcium bølge (figur 5C). D609 og U73122 inhiberede også aktiveringen af ​​calcium efter tilsætning af exogent ATP, hvorimod tilsætning af NF023 havde ingen virkning (data ikke vist). Selv D609 reducerede afstand og intensitet calcium bølge, præinkubation af celler med STC1 restaureret afstanden af ​​bølgen. STC1 var ikke i stand til at øge calcium bølge efter inkubation med U73122 indikerer, at STC1 var afhængig af kanoniske PLC aktivering (figur 5D).

A) Fluo-4 mærkede A549-celler blev mekanisk stimuleret i fravær (kontrol) eller nærvær af enten en P2X-inhibitor (50 uM NF023), PI-PLC pathway inhibitor (50 uM D609), eller PLC-hæmmeren (12,5 uM U73122) t = 20 s efter skaden. n = 5. B) Kvantificering af afstand, som calcium bølge fra A ved t = 20 s. Fejl barer = SD. * = P 0,05. n = 5. C) Fluo-4 mærkede A549-celler forbehandlet i 30 minutter med NF023, D609, eller U73122 blev inkuberet med 500 ng /mL STC1 i 10 minutter før skrabe. Maksimal afstand af calcium bølge vises. Fejl barer = SD. * = P 0,05. n = 3.

STC1 var nødvendig for Formering for Mekanik og ATP-induceret Calcium Wave

Den iagttagelse, at STC1 handlede opstrøms af PLC fik os til at undersøge effekten af ​​endogen STC1 på calcium bølgeudbredelse efter mekanisk stimulering. A549-celler blev præ-inkuberet med 1 ug /ml polyklonalt anti-STC1 antistof, som vi tidligere havde vist sig at være effektiv til at blokere STC1 [10]. Cellerne blev derefter mekanisk stimuleret og afstanden af ​​calcium bølge blev målt. Forbehandling af cellerne med anti-STC1 antistof reducerede afstand, som calcium bølge sammenlignet med celler forbehandlet med et isotype kontrol-antistof. Tilsvarende forbehandling af cellerne med apyrase reducerede afstand, som calcium bølge (figur 6A, B). Endvidere anti-STC1 behandlede gruppe udviste en hurtig tilbagegang af calcium wave (figur 6B), samt nedsat calciumrespons støder op til skrabe site, som målt ved fluorescensmikroskopi (Figur 6C; Movie S5).

A) Fluo-4 mærkede A549-monolag blev mekanisk stimuleret i nærvær af isotype antistof (kontrol), en STC1 blokerende antistof (anti-STC1; 1 pg /ml) eller apyrase (250 mU /ml) og analyseret ved levende celler mikroskopi. B) Afstand af calcium bølgeudbredelse fra A. Fejlsøjler = SD. * = P 0,05. C) Kvantificering af signalintensitet hosliggende at skrabe stedet efter mekanisk stimulering. Fejl barer = SD. * = P. 0,05

STC1 Forbedret Release af ATP fra celler

in vitro

in vivo

Vi næste testede, om STC1 påvirkede udgivelsen af ​​ATP fra stimulerede epitelceller. Medium fra A549-celler blev erstattet med serumfrit medium med eller uden 500 ng /mL STC1 i 10 minutter og en ATP-assay blev udført. Medium fra STC1 behandlede celler indeholdt 2 gange mere ATP (figur 7A). Ingen signifikant forskel blev set i lysater fra disse celler. ATP-niveauer blev normaliseret til DNA-indhold i hver brønd. Lignende resultater blev opnået fra muse embryonale fibroblaster fra vildtype og STC1 transgene mus (figur 7B).

A) A549-celler blev stimuleret med 500 ng /mL STC1 i 10 minutter. Konditioneret medium blev opsamlet og analyseret for ATP. Adhærerende celler blev lyseret og målt for ATP og DNA-indhold. ATP-værdier blev normaliseret til DNA-fluorescens. * = P 0,05; n = 3. B) A549-celler blev stimuleret med 10 pM ATP i 2, 5 og 10 minutter. Assay af konditioneret medium og cellelysater af vildtype og STC1 overudtrykker MEF’er. * = P 0,05; n = 3. B) Serum blev isoleret fra vildtype og STC1 transgene mus og analyseret for ATP indhold. * = P 0,05; n . 17

Resultatet foreslog den mulighed, at systemisk niveau af ATP kan være forhøjet i STC1 transgene mus. For at undersøge denne hypotese, plasma fra vildtype- og transgene mus overudtrykker STC1 blev opsamlet, og en ATP-assay blev udført. Mus, der udtrykker den menneskelige STC1 transgen viste forhøjede niveauer af blod ATP sammenlignet med vildtype kontrol (Figur 7C).

Diskussion

Tidligere observationer foreslog, at STC1 er stress respons protein. Den STC1 protein er 80% identisk mellem fisk og menneske, og 98% identisk mellem mus, rotter, mennesker og andre pattedyr [29]. STC1 knockout-mus ikke vise nogen åbenlys fænotype [30]; dog kan forhøjede niveauer af STC1 ændre muskelfunktion og knogleudvikling og fald reproduktion [31], [32]. De STC1 mRNA niveauer blev hurtigt opreguleres under hypoxi og efter udsættelse for forskellige cytokiner, herunder tumornekrosefaktor alfa, transformerende vækstfaktor beta og fibroblastvækstfaktor-2 (G. Block, upublicerede data). Tilsammen disse observationer yderligere at understøtte den konklusion, at STC1 modulerer signalering i de tidlige begivenheder i den cellulære reaktion på stress.

For at undersøge den rolle, STC1 i stress, vi ansat en model for personskade, hvor epitelial monolag blev sprængt med en mekanisk stimulus at rekapitulere den tidlige begivenheder af sårheling [15], [28], [33]. Vi fandt, at STC1 forbedret hastigheden og maksimal afstand af udbredelsen af ​​en ATP-afhængig calcium bølge. STC2 påvirkede ikke calcium bølge progression siden forbehandling af celler med STC2 ændrede ikke den maksimale afstand, som den bølge. Vi udledte, at STC1 var afhængig af PLC-aktivering i en P2Y G-protein-koblet receptor pathway siden PLC-hæmmeren, U73122, var i stand til at blokere calcium bølgeudbredelse i nærvær eller fravær af STC1. Endvidere funktionel blokering af endogen STC1 anvendelse af et antistof inhiberede formering af calcium bølge.

allestedsnærværende nukleotid signalering reflekteres af den store udbredelse af P2-receptorer i forskellige celletyper [24]. Vores observation, at STC1 kan mægle calcium aktivering neden for ATP i lunge epitelceller kan også være gældende for andre celletyper og væv. For eksempel er de iagttagelser, at STC1 fungerede som en selektiv L-kanal hæmmer [34] parallelt de tidlige observationer, ekstracellulær ATP kan bremse puls efter traumatisk chok [35], [36]. Endvidere inddragelse af ekstracellulær ATP i regulering makrofag kemotaxi [16], [18], [37], [38], [39] er ligeledes blevet defineret, for STC1 [7]. Desuden tyder vore resultater, at STC1 modulering af purinergisk signalering kan bidrage til de åbenlyse udvises af transgene mus konstitutivt udtrykker STC1.

Selvom STC1 øger calcium respons nedstrøms for ekstracellulære nukleotider epitelceller, det samme kan ikke være tilfældet i andre celletyper. For eksempel har STC1 blevet vist at aktivere calcium signalering i endotelceller [9], men inhiberer calcium signalering i afhængighed MCP-1 i makrofager [7]. I vores assay STC1 havde ingen virkning på calcium dynamik, når de tilsættes alene til A549-celler (film S6). Endvidere kan ATP ikke inducere calcium frigivelse i alle celletyper, idet ATP er en potent suppressor af calcium aktivering i hippocampale neuroner [40], [41]. De variable virkninger af ATP afspejles også i følsomheden af ​​celler til ATP, som forskellige celletyper kræver forskellige koncentrationer af ekstracellulær ATP til at fremkalde en virkning. Ud fra følgende betragtninger A549 celler reagerer på så lidt som 0,5 uM ATP, makrofager generelt behov 100 uM for at reagere [42]. STC1 kan spille en rolle i sensibiliserende eller desensibilisering celler til forskellige koncentrationer af ATP.

De efterfølgende konsekvenser af STC1-medieret aktivering af en ATP-induceret calcium reaktion kunne have vigtige konsekvenser for microenvironmental stikord fører til normale stress-reaktioner mekaniske og potentielt giftige fornærmelser. For eksempel kan den rolle, STC1 i reparation af en epitelial sår baseres på dets evne til at fremme eller forhindre apoptose af ATP stimulerede celler [43]. Rolle STC1 på purinergisk signalering fra cellen eller organel membraner kunne have stor betydning for downstream calcium bevægelighed inden for og mellem beskadigede celler. Det har været en udfordring dels på grund af manglen på tilgængelige bioassays for STC1. Det arbejde, vi har præsenteret her etablerer en bioassay for STC1 aktivitet for at fremme en dybere forståelse af dens struktur og funktion i en række forskellige celletyper og fysiologiske situationer.

Materialer og metoder

Etik Statement

Mus blev opstaldet og anvendes i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af University Rådet om Animal Care på University of Western Ontario.

Cell Kultur og reagenser

Menneskelig A549 lungekræft epitelial celler og PC3-prostatacancerceller blev opnået fra American Tissue Type Culture Collection (Manassas, VA; www.atcc.org). Muse embryonale fibroblaster og plasma blev opnået fra vildtype- og human STC1 transgene mus som beskrevet tidligere [44]. Alle celler blev holdt i Dulbeccos minimale essentielle medier (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA; www.invitrogen.com) indeholdende 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Norcross, GA, www.atlantabio.com) og 100 E penicillin /100 ug streptomycin (Invitrogen). Reagenser var indkøb fra følgende kilder: ATP fra Teknova (Hollister, CA, www.teknova.com); apyrase fra New England Biolabs (Ipswich, MA, www.neb.com); glycyrrhetinsyre fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, www.sigmaaldrich.com); rekombinant humant STC1 og STC2 som FLAG-Tagged fusionsprotein fremstillet af humane celler fra BioVendor (Modrice Tjekkiet www.biovendor.com); ged polyklonale antistoffer og monoklonalt muse (klon 380.715) anti-STC1 antistof fra R www.rndsystms.com) og hæmmere NF023 og D609 fra Sigma Aldrich

Calcium Dye Mærkning

for at måle ændringer i intracellulære calcium niveauer blev celler mærket med Fluo-4 No-Wash farvestof (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev lyofiliseret farvestof rekonstitueret med 10 ml Assay Buffer (1X calcium og magnesium fri HBSS med 20 mM HEPES-buffer), og suppleret med 100 pi probenecid syre for at forhindre farvestoffet i at lække fra cellerne, i overensstemmelse med producentens anvisninger. Celler dyrket i 48 vel petriskåle blev inkuberet i 200 uL Fluo-4 i 30 min før visualisering af levende celler mikroskopi eller kontinuerlig analyse af fluorescens spektroskopi.

Inhibitor og antistof Blokering Analyser

NF023 (50 uM), D609 (50 uM), U73122 (12,5 uM), og anti-STC1 (1 ug /ml) blev tilsat direkte til 200 pi Fluo-4 assaybuffer indeholdende Fluo-4, og inkuberet ved siden af ​​Fluo -4 i 30 min før dataindsamlingen som cellerne indtog farvestoffet. Alle inhibitorkoncentrationer blev optimeret i præliminære eksperimenter under anvendelse to gange seriefortyndinger begyndende ved 100 uM til 50 nM. Den effektive koncentration blev bestemt som den laveste koncentration for at udøve en virkning, selv i tilfælde af NF023, blev ingen effekt nogensinde observeret. Indledende forsøg under anvendelse af glycyrrhetinsyre (5 uM til 100 uM) blev udført ved præ-inkubering af cellerne i 30 minutter på samme tid som de blev inkuberet med Fluo-4 farvestof.

levende celler og mekanisk sprængning

Celler blev afbildet levende ved hjælp af et Nikon Ti Eclipse inverteret fluorescerende mikroskop (Nikon Instruments inc .; Melville, NY, www.nikoninstruments.com). Celler og mikroskopet blev indkapslet i en 37 ° C miljømæssige kammer (In Vivo Scientific, St Louis, MO, www.invivoscientific.com). Billeder blev taget ved 2 billeder /sek i mindst 1 minut under anvendelse NIS Elements software. En 4X mål blev anvendt (CFI Plan Fluor 4X /0,13 17,1 mm Nikon Instruments). Fluo-4 blev ophidset ved anvendelse af en 488 nm excitation filter, og påvist ved 520 nm emission

mekanisk stimulering af A549-celler blev udført manuelt ved at skabe en lineær bunden med en bøjet p200 pipettespids (epTIP;. Eppendorf, Hamburg Tyskland, www.eppendorf.com). For mere tydeligt at vise calcium bølger i hver figur, blev alle billeder i hver tilstand justeres samtidig ved hjælp af Adobe Photoshop tærsklen funktion således at pixels over en vilkårligt sat tærskel blev rød.

fluorescensspektroskopi

Fluo-4 mærkede celler dyrket på 48 eller 96-brønds plader blev inkuberet ved 37 ° C i en fluorescens-spektrofotometer udstyret med to reagens-injektorer (Fluostar Omega, BMG Labtech, Offenburg Tyskland; www.bmglabtech.com). Den første injektor var programmeret til at levere stigende doser af ATP efter 4 sek baseline læsning. Den anden injektor var programmeret til at levere reagenset buffer før ATP så volumenet for hver aflæsning forblev konstant. Brønde blev analyseret ved 480 excitation /520 emission. Data fra hver betingelse baseline fratrækkes. Fluorescerende målinger intensitet blev taget hver 0,5 sek ved 480-aktivitet og analyseret ved hjælp af BMG Omega Software dataanalyse software og Microsoft Excel.

In vitro

ATP Analyser

ATP blev analyseret ved hjælp af en luciferase-baseret protokol i overensstemmelse med producentens instruktioner (CellTitre-Glo, Promega, www.promega.com). For at indirekte kvantificere celleantallet blev 20 ml luciferase-reagens tilsat 50 pi af en DNA indlejringsfarvestof (CyQuant; Invitrogen). En enkelt volumen af ​​reagens blev tilsat til et tilsvarende volumen af ​​konditionerede medier. Halvdelen af ​​prøven blev derefter analyseret for luciferaseaktivitet og resten til fluorescens (480/520 exitation /emmision) under anvendelse af en pladelæser stand til at påvise både fluorescens og luminescens (Fluostar Omega, BMG Labtech).

ATP Assay i museplasma

Blod blev opsamlet fra human STC1 transgene hanmus (linje 2) [32] og vildtype mænd (2-4 måneder gamle) på den samme genetiske baggrund (C57BI /6 x CBA) under anvendelse heparin til forhindre koagulation. Typisk blev 300-400 pi opsamlet pr mus og blandes straks med stopopløsning ved stuetemperatur for at minimere frigivelsen af ​​ATP fra blodplader og ATP nedbrydning med ATPase [45]. Stop-opløsning var 3 mM EDTA, 118 mM NaCI, 5 mM KCI, 40 mM tricin-puffer, 5 nM nitrobenzyl thioinosine, 10 pM forskolin, 100 uM isobutylmethylxanthin. Blodet blev øjeblikkeligt centrifugeret ved 13.000 x g i 3 minutter ved stuetemperatur, og 50 pi af plasma blev anvendt i duplikat til at udføre indirekte ATP-målinger under anvendelse af CellTiter-Glo Assay (Promega) ifølge producentens instruktioner. Det luminescerende signal blev målt under anvendelse af et Berthold Lumat LB9507 luminometer og relative lysenheder blev omdannet til ATP-koncentrationer ved anvendelse af en standardkurve.

Billede og Movie Analysis

Billedanalyse blev udført ved anvendelse Nikon NIS Elements software (Nikon) eller ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij). For at kvantificere afstand af calcium bølge, blev billeder optaget 10, 20, 30 og 40 s efter skrabe. For hvert billede blev 5 linjer trukket vinkelret på kanten af ​​skraber til spidsen af ​​calcium bølge. Afstande af linjerne blev registreret og gennemsnit i over 5 film pr tilstand.

Statistiske Analyser

Når to midler blev sammenlignet, blev en to-tailed t-test ved hjælp af Microsoft Excel. Under omstændigheder, hvor mere end to midler blev sammenlignet, blev nulhypotesen afvist ved hjælp af en analyse af varians. Tællinger blev analyseret ved hjælp af en multi-variabel kontingenstabel og chi-squared test med InStat statistisk software.

Støtte oplysninger

figur S1.

Calcium Wave Formering var uafhængig af Gap Junction intercellulær kommunikation. A549 monolagene blev mekanisk stimuleret efter præinkubering med 10, 25 eller 50 uM glycyrrhetinsyre og analyseret ved levende celler mikroskopi. . Forstørrelse = 40 ×

doi: 10,1371 /journal.pone.0010237.s001

(0,30 MB TIF)

Movie S1.